CN115786130B - 丽江杓兰共生真菌yafef040及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种丽江杓兰共生真菌YAFEF040及应用，本发明的一株丽江杓兰共生真菌YAFEF040菌株(Preussia funiculata)，菌株保藏名称为绳光黑壳YAFEF040(Preussia funiculate YAFEF040)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉大学；保藏编号为CCTCC M 2022614，本发明对多种致病细菌有较好的抑制作用，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。

Description

丽江杓兰共生真菌YAFEF040及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种丽江杓兰共生真菌YAFEF040及应用。

背景技术

病原细菌能使人和动植物患病，每年都给我们带来巨大的健康、粮食和财产损失，为杀死病菌或者抑制病菌活性，人们发明了抗生素和合成抗菌药物，随着抗菌药物的广泛应用，致病细菌对抗生素产生耐药性，甚至出现了多重耐药性，致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁，所以寻找新兴生物资源是一条很有前景的途径，目前共生菌次生代谢产物方面的研究日益增多。在长期共进化过程中，共生菌与宿主植物形成了特殊的生理代谢途径，产生出各种结构新颖的活性化合物，而共生菌的多样性决定了还有很多活性共生菌未被开发，因此研究共生菌的次生代谢产物，对我们开发新的抗菌药物有重要的作用，还能有效的缓解耐药菌株带来的危机；真菌天然化合物还具有易被降解、无毒等特性，对我们开发新型生物农药提供重要指导依据。

森林是一个拥有丰富物种的完整生态系统，苦楝、丹参、香椿、党参、元宝草等多种植物共生菌中发现了具有抗细菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物质。丽江杓兰(Cypripedium lichiangense)隶属兰科杓兰属的国家一级保护植物，是中国特有种。分布于云南西北部，四川西南部；生于海拔2600～3500m的灌丛中或开旷疏林中。其花大而艳，是重要的野生花卉资源；因人为活动破坏其生境，已被列为濒危物种，由于其特殊的生存环境和生存状态，被筛选为本发明的研究对象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一株抗细菌活性强的丽江杓兰根部共生真菌YAFEF040及其分离方法。

为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

本发明的一株丽江杓兰共生真菌YAFEF040，所述菌株保藏名称为绳光黑壳YAFEF040(Preussia funiculata YAFEF040)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年5月12日；保藏编号为CCTCC NO:M2022614。

进一步的，所述的丽江杓兰共生真菌YAFEF040的ITS基因序列包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种菌剂，包括丽江杓兰共生真菌YAFEF040的培养物或其加工物。

优选的，所述丽江杓兰共生真菌YAFEF040的培养物使用的培养基JRMM固体培养基或GMMM固体培养基。

优选的，所述JRMM固体培养基的成分为核桃渣8g/瓶+MM培养基15mL/瓶，所述MM培养基包括硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L。

本发明还提供了一种药物组合物，含丽江杓兰共生真菌YAFEF040，或其制备的菌剂。

进一步的，丽江杓兰共生真菌YAFEF040对致病菌中的蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、铜尿假单胞菌或溶血性葡萄球菌有优越的抑菌效果。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过分离筛选丽江杓兰共生真菌，得到一种新的绳光黑壳属Preussiafuniculata YAFEF040菌株，通过实验发现，YAFEF040菌丝体提取物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、铜尿假单胞菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。

附图说明

图1为本发明所述的YAFEF040菌丝生长情况图；

图2为本发明YAFEF040菌株与已知抗生素活性检测结果图；(注：1.氨苄青霉素；2.YAFEF040菌株；3.卡拉霉素；4.庆大霉素。)

图3为本发明不同的培养基培养YAFEF040菌株抑菌效果图；(注：1.PDA液体培养基；2.LMM液体培养基；3.JRMM固体培养基；4.GMMM固体培养基；5.MY液体培养基；6.OSMM固体培养基；7.CCMM固体培养基；8.OMAM固体培养基；9.SBMM固体培养基。)

图4为本发明的YAFEF040荧光显微镜下菌丝体图；

图5为本发明的YAFEF040对蜡样芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；

图6为本发明的YAFEF040对无乳链球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；

图7为本发明的YAFEF040对铜尿假单胞菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；

图8为本发明的YAFEF040对溶血性葡萄球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；

图9本发明基于ITS构建了丽江杓兰共生真菌YAFEF040的系统发育树显示图。

具体实施方式

下面本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，本发明中使用的化学物均为分析纯级别，均可以由市场购买。

实施例1

YAFEF040，该菌株为丽江杓兰根部共生真菌YAFEF040；保藏名称为绳光黑壳YAFEF040(Preussia funiculata YAFEF040)Preussia funiculata；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年5月19日；保藏编号为CCTCC NO:M2022614。该培养物于2022年05月12日由保藏中心收到，并登记入册，由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年，该培养物的存活性由保藏中心于2022年05月19日检测完毕，结果为存活。

该菌株形态如图1所示，真菌在PDA固体培养基上生长良好，菌落表面平整呈放射状向周围生长，生长前期菌丝颜色呈现白色，生长后期菌丝颜色变成青灰色，菌丝生长较密集且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状。

实施例2

丽江杓兰共生真菌YAFEF040菌株的分离和鉴定

1、丽江杓兰共生菌的分离

将采集的丽江杓兰根部样品以表面活性剂浸泡30min，流动水冲洗24h，然后转入无菌工作台进行消毒处理，用无菌滤纸吸干消毒根部表面多余的水分，晾干备用；在超净工作台中用已经高压灭菌的剪子或解剖刀把丽江杓兰根部切成0.5cm大小的组织块，在酒精灯火焰表面灭菌10s，用75％的酒精表面消毒10min，然后用无菌水洗涤6遍；把组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上培养，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于26℃培养箱中培养，培养10d左右，期间不定期观察。再将菌丝转接到固体PDA培养基，培养10d后，对菌株进行分子鉴定，得到丽江杓兰根部共生真菌YAFEF040。

2、丽江杓兰共生菌的鉴定

(1)形态的鉴定

真菌在PDA固体培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，菌丝是灰色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状。

(2)DNA提取

试验前先CTAB在65℃水浴锅中加热30min以上；取丽江杓兰共生菌分离纯化培养的菌丝体于2mL的离心管中，并将离心管放到装有液氮的不锈钢罐中浸泡6min，用破碎机破碎1.5min，将菌丝体打碎；离心管中加入1mL的CTAB、20uLβ-巯基乙醇，摇匀(10min)，放到水浴锅水浴1h；水浴结束后，放入离心机离心10min·4℃·12000r/min；取上清液，加入1mL(酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，振摇10min，离心10min(重复两次)；取上清液，加入50uLNaAc和1mL无水乙醇(-20℃)，摇匀放入-20℃冰箱沉淀1h；沉淀完离心10min，加入500uL75％酒精洗脱2次(3min/次)，加入500uL无水乙醇洗脱1次；离心3min，弃乙醇，放置干；加入40uL洗脱缓冲剂，瞬时离心，得到真菌YAFEF040基因组DNA。

(3)ITS分析鉴定

用真菌通用引物ITS1(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS4区)序列，所得得ITS测序序列如SEQ ID No.1所示。

(4)构建发育树

基于ITS构建丽江杓兰共生菌YAFEF040的系统发育树(图9)，综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与绳光黑壳属(Preussia funiculata)亲缘关系最近，所以将YAFEF040菌株鉴定为绳光黑壳属(Preussia funiculata)。

实施例3

丽江杓兰共生菌YAFEF040活性物质的提取

1、固体发酵培养

将已长成型的丽江杓兰根部共生菌YAFEF040菌丝体刮取适量放入2mL灭菌离心管中，再加入1mL无菌水，破碎2min，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有JRMM培养基的组培瓶中，置于恒温培养箱26℃，培养10d。

2、培养物菌丝体提取

将组培瓶培养的菌丝体置于60℃烘箱中干燥7h，去除培养基中的水分后，加入100mL乙醇超声震荡40min后静置48h，然后将菌液用漏斗进行分离，萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得丽江杓兰根部共生菌YAFEF040培养的菌丝体粗提物。

试验例1

丽江杓兰共生菌YAFEF040培养物的菌丝体粗提物的抗菌活性检测

1、致病菌的活化

将购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心的蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、铜尿假单胞菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌，分别取少量加入2mL离心管中，再加入700uL的LB液体培养基，然后将离心管放入37℃，转速为180r·min^-1恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，取出活化好的细菌进行稀释1/10倍。

2、阳性对照所用抗生素及配制

氨苄青霉素(Ampicillin)(批号：0339，纯度：95％)，购于昆明硕阳科技有限公司。精密称取氨苄青霉素50mg，分别置于离心管中，加入1mL DMSO溶液配置成50mg/mL的抗生素DMSO溶液，备用。其他抗生素如卡拉霉素、庆大霉素配置方法同氨苄青霉素一致,抗生素纯度均不小于95％。

3、滤纸片法检测抗菌活性

取适量丽江杓兰共生菌YAFEF040菌丝体粗提物，称重后加入适量DMSO(二甲基亚砜)溶液，稀释到50mg/mL。将活化得到的致病菌液分别均匀涂抹在LB固体培养基上，晾干后，将吸取了已溶解的丽江杓兰共生菌YAFEF040菌丝体粗提物的5mm的滤纸圆片放在培养基的对应标记处，并用5mm滤纸圆片蘸取DMSO溶液和氨苄青霉素作为阴性对照，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。

本发明筛选得到一种丽江杓兰共生真菌YAFEF040(绳光黑壳属Preussiafuniculata)，其培养物的菌丝体粗提物(50mg/mL)的抗细菌活性结果如表1和图5-8所示，菌丝体粗提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、铜尿假单胞菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性。

表1丽江杓兰共生真菌YAFEF040粗提物抗菌活性与阳性对照比较

对比例

为进一步确定丽江杓兰共生真菌YAFEF040粗提物的抗菌效果，蜡样芽孢杆菌为致病菌，对YAFEF040菌株与其它已知抗生素做抑菌活性检测，对不同培养基培养的YAFEF040菌株进行抑菌活性检测，同上述试验采用滤纸圆片法观察是否出现抑菌圈，并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小，结果如下所示：

1、YAFEF040菌株与已知抗生素活性检测结果显示(图2)，YAFEF040菌株对蜡样芽孢杆菌的抑菌活性结果明显，且抑菌圈直径达到1.6cm，抑菌效果显著。

2、通过不同的培养基培养YAFEF040菌株，并对其粗提物进行抑菌活性检测，结果发现在JRMM固体培养基和GMMM固体培养基，固体发酵培养菌株生长效果最佳，且抑菌活性最明显(图3)。

不同培养基筛选实验过程中，固体培养基培养获取培养物方法与上述固体发酵获取培养物方法一样，而液体培养基获取培养物方法为刮取适量YAFEF040菌株菌丝体放入2mL离心管，加入500uL无菌水，放入细胞破碎匀浆机破碎1min，取破碎液接种到每个装有液体培养基的锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱培养8d(150r·min^-1，28℃)。发酵培养完成后，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，在菌液中加入1:1乙酸乙酯摇匀，静置12h，充分萃取后取上清液溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得YAFEF040菌株培养的发酵液提取物，活性检测方法与上述方法一致。

培养基配方：

PDA液体培养基：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B1 0.1g/L

LMM液体培养基：乳糖15g/L，硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L，微量元素1mL/L

JRMM固体培养基：核桃渣8g瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)

GMMM固体培养基:黄豆粉7g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)

MY液体培养基：酵母麦芽浸粉肉汤21g/L

OSMM固体培养基：大米10g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)

CCMM固体培养基:山核桃渣8g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)山核桃渣为干的山核桃仁榨油后的剩余油渣

OMAM固体培养基:大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蔗糖20g/LSBMM固体培养基:高粱粉7g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)

除了通过培养菌株进行菌丝体提取，其他培养或者加工方法，如丽江杓兰共生真菌YAFEF040细胞的超声裂解上清；丽江杓兰共生真菌YAFEF040细胞的超声裂解沉淀，基于真菌YAFEF040的抗菌效果下，其加工物或者培养物均具备相应的抗菌活性，使用本菌制备相关抗菌活性药物、菌剂等，均在本发明的保护范围内。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (4)

1.丽江杓兰共生真菌YAFEF040菌株，其特征在于：所述菌株保藏名称为绳光黑壳YAFEF040（Preussia funiculata），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏编号为CCTCC NO: M 2022614。

2.根据权利要求1所述的丽江杓兰共生真菌YAFEF040，其特征在于，所述的丽江杓兰共生真菌YAFEF040的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.一种药物组合物，含权利要求1或2所述的丽江杓兰共生真菌YAFEF040。

4.根据权利要求1或2所述的丽江杓兰共生真菌YAFEF040在制备抑制致病菌的药物中的应用，所述致病菌为蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、铜尿假单胞菌或溶血性葡萄球菌。