CN102154133B - 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 - Google Patents
不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102154133B CN102154133B CN2011100306615A CN201110030661A CN102154133B CN 102154133 B CN102154133 B CN 102154133B CN 2011100306615 A CN2011100306615 A CN 2011100306615A CN 201110030661 A CN201110030661 A CN 201110030661A CN 102154133 B CN102154133 B CN 102154133B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- damping fluid
- application
- candida krusei
- zjb
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- PUPZLCDOIYMWBV-SCSAIBSYSA-N (R)-butane-1,3-diol Chemical compound C[C@@H](O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-SCSAIBSYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 claims abstract description 16
- LVSQXDHWDCMMRJ-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutan-2-one Chemical compound CC(=O)CCO LVSQXDHWDCMMRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 15
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 3
- 238000009876 asymmetric hydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LKDRXBCSQODPBY-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructopyranose Chemical compound OC[C@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-ZXXMMSQZSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 abstract 1
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 11
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 11
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 9
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybutan-2-one Chemical compound CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 3-benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]oxolan-2-one Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OCC1OC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)C1 AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N D-Cellobiose Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(O)OC2CO)C(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- -1 D-semi-lactosi Chemical compound 0.000 description 1
- 241000555268 Dendroides Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235644 Issatchenkia Species 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N 0.000 description 1
- MNFORVFSTILPAW-UHFFFAOYSA-N azetidin-2-one Chemical compound O=C1CCN1 MNFORVFSTILPAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N d-xylitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009189 diving Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-WLDMJGECSA-N methyl D-glucoside Chemical compound COC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-WLDMJGECSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 239000006273 synthetic pesticide Substances 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一株产羰基还原酶新菌株——克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ZJB 09162，及其在催化不对称还原4-羟基-2-丁酮制备(R)-1，3-丁二醇中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M2010335，保藏日期：2010年12月6日。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种产4-羟基-2-丁酮羰基还原酶的新菌种，通过该菌种可制备高光学纯度的(R)-1，3-丁二醇，转化率＞90％，光学纯度＞99％；使用本发明的不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了过程的原子经济性，具有很好的工业应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株产羰基还原酶新菌株——克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)ZJB 09162，及其在催化不对称还原4-羟基-2-丁酮制备(R)-1，3-丁二醇中的应用。
(二)背景技术
(R)-1，3-丁二醇，又可记作(R)-1，3-BDO(结构见式(I))，是一种无色粘稠状，带甜味液体，能与水、乙醇、丙酮、丁酮等混溶。(R)-1，3-丁二醇是一种具有广泛用途的重要手性砌块，如在医药领域用于合成碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮，在农药领域用于合成杀虫剂和信息激素，同时它也是合成一大类香料的重要中间体。因此，开展(R)-1，3-丁二醇合成研究具有重要的实际应用价值。
(R)-1，3-丁二醇的化学合成主要有两条工艺，一是以L-苏氨酸为起始原料，在KBr存在下先亚硝化脱氨，再经甲酯化、氢解脱溴和还原等4步反应制备(R)-1，3-丁二醇。该工艺原料成本高，有毒有害原辅料用量大，收率低(仅为64％)(Synth Commun，1991，21(22)：2295-2300)。二是以4-羟基-2-丁酮为底物，经钌基催化剂Ru-BINAP一步不对称加氢还原(US，4981992，1991)，但该催化剂制备成本高，且回收利用困难，难以实现规模化生产。
生物转化法制备光学纯手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性高等优点，代表着绿色化学的发展方向，已成为制备手性化合物的经典方法。生物催化合成手性化合物有以下两种途径：一是利用微生物或酶对外消旋混合物中某一个异构体具有高度的立体选择性，而对另一个异构体不起催化作用(或作用很小)，从而实现对映体分离，拆分为两个具有光学活性的对映体；二是从潜手性醛或酮等羰基化合物前体出发，通过不对称催化反应得到光学活性化合物。
目前国际上生物法制备(R)-1，3-丁二醇的报道主要来自日本大赛璐化学工业株式会社，公开了Candia parapsilosis、Candia utilis、Candidaarborea、Kluvermyces lactis、Issatchenkia scutalata、Rhodococcuserythropolis等多种能够催化(R，S)-1，3-丁二醇手性拆分或4-羟基-2-丁酮不对称还原制备(R)-1，3-丁二醇的微生物(J Mol Catal B：Enzyme，2001，11：513-521，Biosci Biotech Biochem，1993，57(2)：348-349，JP 03236795，WO 9207082)。Yamamoto等进一步将Candia parapsilosis IFO 1396仲醇脱氢酶基因在E.coli JM109中重组表达，以该重组菌为生物催化剂拆分外消旋1，3-丁二醇，产物(R)-1，3-丁二醇光学纯度95％，转化率48.4％(Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(4)：925-927)。该工艺具有一定的工业化应用价值，但产物的光学纯度有待提高。Eguchi等采用固定化SP382脂肪酶(Candida sp.)催化双酰化反应动力学拆分(R，S)-1，3-丁二醇，经一次拆分后光学纯度达到85％以上，将该产物化学水解为二醇后，再次进行双酰化拆分，光学纯度达到98％以上(Biotech Lett，15(9)：955-960)。该工艺需经2次酰化和1次水解反应，步骤繁琐，且需要酰基化供体，原子经济性低。
综上所述，与化学合成工艺相比，生物催化法合成(R)-1，3-丁二醇具有显著的优势，显示出广阔的应用前景。但是生物拆分工艺也存在诸如原料利用率低(50％以上的1，3-丁二醇无法利用)，及已报道的拆分用醇脱氢酶立体选择性不高等缺陷，导致总收率低，产物光学纯度难以达到药物合成的高要求(e.e.＞99％)。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株能够高立体选择性地催化不对称还原反应的产羰基还原酶菌株，以及一种利用该羰基还原酶催化4-羟基-2-丁酮不对称还原生成高光学纯度(R)-1，3-丁二醇的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明采用的技术方案是：
一株产羰基还原酶菌株——克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ZJB09162，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010335，保藏日期：2010年12月6日。
该菌株是本申请发明人从来自全国各地的200多份土壤样品中，经初筛、复筛及分离纯化而得到一株能够高效不对称还原4-羟基-2-丁酮制备(R)-1，3-丁二醇的新菌株。根据它的生理生化特性，鉴定为Candida krusei。
该菌株的主要特征如下：
菌落形态：于30℃在豆芽汁培养基平板培养40h，菌落呈圆形，直径5-8毫米，表面隆起为凸镜状，乳白色，边缘整齐，光滑。
细胞形态：呈椭圆形棒状，芽殖，细胞大小3.0～5.0μm×6.0～20.0μm，假菌丝呈树枝状。
生理生化特性：阳性项目：D-葡萄糖和N-乙酰-葡萄糖胺能利用；阴性项目：D-麦芽糖、侧金盏花醇、D-纤维二糖、乳糖、甲基-D-葡萄糖苷、蔗糖、D-海藻糖、肌醇、2-酮基葡萄糖、阿拉伯糖、D-半乳糖、甘油、D-木糖、D-松三糖、D-棉籽糖、D-山梨醇、木糖醇利用。耐5～10％(w/v)的氯化钠溶液。
该菌株18S rDNA扩增产物的实际长度为472bp，序列如下：
ctgcaggtcgacgatttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattactgtgatttaacatcttccacacgtgcgtgagcgcaagcaaaacacgaaaaaactgtagtacgagagtcaaaacaaaccaaaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaagagcgcagcgaaatgcgatacctagtgtgaattgcagccatcgtgaatcatcgagttcttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggcatgcctgtttgagcgtcgtttccttcttgcttgcgagcagaaatgggggggccctggcattggggccgctctgaaaagaaacgttgcgggcgaagcgaactatgagtaggacgcttggccgccgaacttaatacataagctcgacctcaaatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaatct。
本发明还涉及所述克鲁斯假丝酵母ZJB 09162在不对称还原4-羟基-2-丁酮制备(R)-1，3-丁二醇中的应用。
具体的，所述应用为：以4-羟基-2-丁酮为底物，以克鲁斯假丝酵母ZJB 09162经培养获得的含酶菌体细胞为催化剂，在20～45℃下，于pH6.0～9.0的缓冲液中进行不对称加氢还原反应8～36h，反应结束后反应液经分离纯化得到所述(R)-1，3-丁二醇。所述催化剂可以是克鲁斯假丝酵母ZJB 09162经培养后离心收集的湿菌体或冷冻干燥的菌体，也可以是菌体经破碎后，通过无机盐、有机溶剂或聚合物进行沉淀所得的粗酶。
为提高反应转化率，所述缓冲液中还可添加20～100g/L缓冲液的辅助底物，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②乳糖、③蔗糖、④木糖、⑤果糖、⑥麦芽糖、⑦异丙醇、⑧乙醇、⑨丙三醇。
本发明反应可在常规适用于酵母细胞的缓冲液中进行，具体的所述缓冲液可为下列之一：pH 6.0～6.6的柠檬酸缓冲液、pH 6.5～7.8的磷酸盐缓冲液或pH 7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液。
所述缓冲液中底物初始浓度为5～30g/L，含酶菌体细胞添加量可为10～50g/L(以湿重计)。
具体的，所述含酶菌体细胞由如下方法获得：将克鲁斯假丝酵母ZJB09162接种至发酵培养基，在25～43℃、100～300rpm下培养24～72h，得到发酵液离心分离，即得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖10～60g/L，酵母膏10～50g/L，MgSO40.2～1.5g/L，(NH4)2HPO40.5～3.5g/L，KH2PO40.5～3.5g/L，溶剂为水，pH 5.5～8.5。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种产4-羟基-2-丁酮羰基还原酶的新菌种，通过该菌种可制备高光学纯度的(R)-1，3-丁二醇，转化率＞90％，光学纯度＞99％；使用本发明的不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了过程的原子经济性，具有很好的工业应用前景。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：克鲁斯假丝酵母CCTCC M 2010335的发酵培养
发酵培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，MgSO40.2g/L，(NH4)2HPO40.5g/L，KH2PO40.2g/L，溶剂为水，pH 5.5。121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却，接种。250ml摇瓶装液量30％，接种一环克鲁斯假丝酵母CCTCC M 2010335，于25℃，300rpm振荡培养24h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，菌体湿重达8.5g/L。
实施例2：克鲁斯假丝酵母CCTCC M 2010335的发酵培养
发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母膏50g/L，MgSO41.5g/L，(NH4)2HPO43.5g/L，KH2PO43.5g/L，pH 8.5g/L。121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却，接种。250ml摇瓶装液量30％，接种一环克鲁斯假丝酵母CCTCC M 2010335，于43℃，100rpm振荡培养72h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，菌体湿重达18g/L。
实施例3：(R)-1，3-丁二醇的生产
取实施例1获得的湿菌体15g，悬浮于pH 6.0的100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮2.5g，葡萄糖10g；在20℃的水浴中转化8h，离心去除菌体；上清液旋转蒸发并用食盐水饱和，经等体积乙酸乙酯萃取，产物(R)-1，3-丁二醇的光学纯度＞99％，转化率82％。
产物的对映体过量值(ee)和底物的转化率采用气相色谱法分析，具体如下：取转化液1ml离心，上清液加入氯化钠饱和后，用800μl乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯层用无水硫酸钠处理后进样分析。分析条件如下：日本岛津GC-14C气相色谱仪，GC-solution色谱工作站；瑞士BGB-175毛细管色谱柱；载气为高纯氦气，柱流量1.5ml/min；进样量1μl，分流比40∶1；检测器及进样口温度均为220℃；柱温100℃，以2℃/min程序升温至132℃。
实施例4：(R)-1，3-丁二醇的生产
取实施例2获得的湿菌体10g，悬浮于pH 7.0的50mM磷酸盐缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮9g，异丙醇15ml；在30℃的水浴中转化12h，离心去除菌体；上清液旋转蒸发并用食盐水饱和，经等体积乙酸乙酯萃取，产物(R)-1，3-丁二醇的光学纯度＞99％，转化率93％(分析方法同实施例1)。
实施例5：(R)-1，3-丁二醇的生产
取实施例2获得的湿菌体6g，悬浮于pH 7.3的50mM磷酸盐缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮14g，木糖50g；在40℃的水浴中转化36h，离心去除菌体；上清液旋转蒸发并用食盐水饱和，经等体积乙酸乙酯萃取，产物(R)-1，3-丁二醇的光学纯度＞99％，转化率95％(分析方法同实施例1)。
实施例6：(R)-1，3-丁二醇的生产
取实施例1获得的湿菌体8g，悬浮于pH 9.0的50mM磷酸盐缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮15g，果糖21g；在35℃的水浴中转化48h，离心去除菌体；上清液旋转蒸发并用食盐水饱和，经等体积乙酸乙酯萃取，产物(R)-1，3-丁二醇的光学纯度＞99％，转化率90％(分析方法同实施例1)。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 不对称还原制备(R)-1,3-丁二醇的方法及菌株
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 472
<212> DNA
<213> Candida krusei
<400> 1
ctgcaggtcg acgatttccg taggtgaacc tgcggaagga tcattactgt gatttaacat 60
cttccacacg tgcgtgagcg caagcaaaac acgaaaaaac tgtagtacga gagtcaaaac 120
aaaccaaaaa acaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagagcgc 180
agcgaaatgc gatacctagt gtgaattgca gccatcgtga atcatcgagt tcttgaacgc 240
acattgcgcc ctctggtatt ccggagggca tgcctgtttg agcgtcgttt ccttcttgct 300
tgcgagcaga aatggggggg ccctggcatt ggggccgctc tgaaaagaaa cgttgcgggc 360
gaagcgaact atgagtagga cgcttggccg ccgaacttaa tacataagct cgacctcaaa 420
tcaggtagga atacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaat ct 472
Claims (7)
1.一株产羰基还原酶菌株——克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ZJB 09162，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2010335，保藏日期：2010年12月6日。
2.如权利要求1所述的克鲁斯假丝酵母ZJB 09162在不对称还原4-羟基-2-丁酮制备(R)-1，3-丁二醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以4-羟基-2-丁酮为底物，以克鲁斯假丝酵母ZJB 09162经培养获得的含酶菌体细胞为催化剂，在20～45℃下，于pH 6.0～9.0的缓冲液中进行不对称加氢还原反应8～36h，反应结束后反应液经分离纯化得到所述(R)-1，3-丁二醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液中还添加有20～100g/L缓冲液的辅助底物，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②乳糖、③蔗糖、④木糖、⑤果糖、⑥麦芽糖、⑦异丙醇、⑧乙醇、⑨丙三醇。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为下列之一：pH6.0～6.6的柠檬酸缓冲液、pH 6.5～7.8的磷酸盐缓冲液或pH 7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液中底物初始浓度为5～30g/L。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法获得：将克鲁斯假丝酵母ZJB 09162接种至发酵培养基，在25～43℃、100～300rpm下培养24～72h，得到发酵液离心分离，即得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖10～60g/L，酵母膏10～50g/L，MgSO40.2～1.5g/L，(NH4)2HPO40.5～3.5g/L，KH2PO40.5～3.5g/L，溶剂为水，pH 5.5～8.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100306615A CN102154133B (zh) | 2011-01-27 | 2011-01-27 | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100306615A CN102154133B (zh) | 2011-01-27 | 2011-01-27 | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102154133A CN102154133A (zh) | 2011-08-17 |
| CN102154133B true CN102154133B (zh) | 2012-07-25 |
Family
ID=44435809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011100306615A Active CN102154133B (zh) | 2011-01-27 | 2011-01-27 | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102154133B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651243B (zh) * | 2015-02-03 | 2018-02-16 | 温州大学 | 膜醭毕赤酵母及其在手性合成(r)‑1,3‑丁二醇中的应用 |
| WO2018183628A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Genomatica, Inc. | Process and systems for obtaining 1,3-butanediol from fermentation broths |
| CN109609473A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-04-12 | 河北省科学院生物研究所 | 一种羰基还原酶DmCR及其编码基因、重组表达载体、重组表达细胞及其应用 |
| CN109749968B (zh) * | 2019-03-04 | 2020-07-17 | 河北省科学院生物研究所 | 一株生物催化合成(r)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005218349A (ja) * | 2004-02-05 | 2005-08-18 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
| CN101899495A (zh) * | 2009-06-04 | 2010-12-01 | 江南大学 | 一株不对称性还原4-羟基-2-丁酮为光学纯(r)-1,3-丁二醇酵母菌株的选育 |
-
2011
- 2011-01-27 CN CN2011100306615A patent/CN102154133B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005218349A (ja) * | 2004-02-05 | 2005-08-18 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
| CN101899495A (zh) * | 2009-06-04 | 2010-12-01 | 江南大学 | 一株不对称性还原4-羟基-2-丁酮为光学纯(r)-1,3-丁二醇酵母菌株的选育 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Matsuyama A et al.Industrial production of (R)-1,3-butanediol by new biocatalysts.《journal of molecular catalysis B-Enzymatic》.2001,第11卷(第4-6期),513-521. * |
| MatsuyamaAetal.Industrialproductionof(R)-1 3-butanediol by new biocatalysts.《journal of molecular catalysis B-Enzymatic》.2001 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102154133A (zh) | 2011-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102559520B (zh) | 一种利用微生物催化制备(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法 | |
| CN102154133B (zh) | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 | |
| CN1793320A (zh) | 一株镰刀霉菌及其用于制备人参皂苷Rh2的方法 | |
| CN103416223A (zh) | 一种提高北冬虫夏草发酵液中虫草素产量的方法 | |
| CN102168036B (zh) | 微生物转化制备r-4-氯-3-羟基丁酸酯和s-3-羟基丁内酯及菌株 | |
| CN104560745B (zh) | 一种毕赤酵母菌Pichia sp.SIT2014及其培养方法和应用 | |
| CN100999750B (zh) | 一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法 | |
| CN101565679B (zh) | 一种红酵母细胞以及不对称转化生产光学活性醇的方法 | |
| CN108220358A (zh) | 一种(s)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备方法 | |
| CN101824438B (zh) | 乙酰乙酸乙酯微生物转化制备(s)-3-羟基丁酸乙酯的方法 | |
| CN103589665B (zh) | 庆笙红球菌及其在制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用 | |
| CN101538542B (zh) | 一种假单胞菌酯酶及其用于制备光学纯扁桃酸及其衍生物的用途 | |
| CN102465159B (zh) | 微生物法制备艾利西平的一种合成工艺 | |
| CN106086090B (zh) | 一种两步微生物转化法制备r-扁桃酸的方法 | |
| CN110373366B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其制备l-薄荷醇的方法 | |
| CN102732579A (zh) | 一种微生物转化制备(3s)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2r)-丁醇的方法 | |
| CN102925368B (zh) | 一种可催化不对称还原反应的球孢白僵菌及其应用 | |
| CN102199546B (zh) | 壤霉菌及其在水解制备（s）-环氧氯丙烷中的应用 | |
| CN104561136B (zh) | 一种将消旋体芳基邻二醇转化为手性芳基邻二醇的方法 | |
| CN110156807A (zh) | 黄曲霉oucmdz-2205次级代谢产物的用途 | |
| CA2414742A1 (en) | Microbial production of r-phenylacetylcarbinol by biotransformation of benzaldehyde by filamentous fungi | |
| CN103122319B (zh) | 一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其生物拆分制备s-型利斯的明的方法 | |
| CN104372036B (zh) | 一种以山梨醇作为碳源提高发酵生产莽草酸产量的方法 | |
| CN104371935B (zh) | 一种博伊丁假丝酵母及其应用 | |
| CN104561137A (zh) | 一种粒毛盘菌液体发酵产多酚的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |