CN101899495A

CN101899495A - 一株不对称性还原4-羟基-2-丁酮为光学纯(r)-1,3-丁二醇酵母菌株的选育

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Publication number: CN101899495A
Application number: CN2009100328509A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 杨套伟; 夏海锋; 马正
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2029-06-04
Also published as: CN101899495B

Abstract

(R)-1，3-BDO是一种重要的化工原料，例如它可以用于合成旋光性化合物氮杂环丁酮，其是青霉烯抗生素、信息激素、香料和杀虫剂合成的中间体原料。以本实验室筛选并保藏的菌株作为出发菌株，本发明在国内首次筛选到一株能以4-羟基-2-丁酮为底物合成光学纯(R)-1，3-丁二醇酵母菌，命名为Pichia jadinii HB61，产物(R)-1，3-BDO的生成率达到70％以上，e.e.值达100％，本发明为以4H2B为底物微生物法工业化生产光学纯(R)-1，3-BDO奠定基础。

Description

一株不对称性还原4-羟基-2-丁酮为光学纯(R)-1,3-丁二醇酵母菌株的选育

技术领域

不对称性还原4-羟基-2-丁酮为光学纯(R)-1，3-丁二醇，属于生物催化技术领域。

背景技术

(R)-1，3-丁二醇，英文名为1，3-butanediol，简写为(R)-1，3-BDO，无臭，略有苦甜味，无色粘稠液体，熔点-77℃，沸点207.5℃，溶于水、丙酮，几乎不溶于脂肪族烃、苯、四氯化碳等。

(R)-1，3-BDO是一种重要的化工原料，例如它可以用于合成光学性化合物氮杂环丁酮，其是青霉烯抗生素、信息激素、香料和杀虫剂合成的中间体原料。(R)-1，3-BDO可以通过化学合成法和微生物法生产法两种，化学合成法最主要是日本Daicel化工公司的研究者开发出一种制取外消旋1，3-BDO并副产丁醇及醋酸丁酯的方法。他们是将乙醛缩合制得3-羟基丁醛，然后用具有高加氢活性的Raney Ni催化剂进行加氢处理，或者将碱性条件下缩合的反应液转入酸性的加氢系统进行处理，最后，将加氢得到的反应混合液进行蒸馏，蒸出丁醇后，再蒸馏余液，得粗制外消旋1，3-BDO，再用臭氧处理外消旋1，3-BDO，得到外消旋1，3-BDO精品，随后用手性拆分剂，分别得到(R)-1，3-BDO和(S)-1，3-BDO。但化学法合成(R)-1，3-丁二醇设备投资大，技术难度高，产品分离纯化困难，且对环境不友好。目前，微生物法生产1，3-BDO在国外已有相关报道，自然界中的微生物能将4-羟基-2-丁酮(4H2B)转化为(R)-1，3-丁二醇，或通过手性拆分将外消旋1，3-BDO转化为光学纯的(R)-1，3-BDO或(S)-1，3-BDO。微生物法生产(R)-1，3-BDO较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，从长远发展和环境保护角度来看，微生物法显得更有生命力，因此越来越得到广大研究者的青睐。国内相关研究起步较晚，微生物法生产(R)-1，3-BDO的方法还未见报道，同时，国内市场上的供应的1，3-BDO基本上是从国外进口的。因此，获得能以4H2B为底物高产(R)-1，3-BDO的菌株，成为微生物法转化生产(R)-1，3-BDO的关键。

本研究以4H2B为底物，筛选得到可以将4H2B为转化为(R)-1，3-BDO(e.e.100％)的菌株1株，命名为Pichia jadinii HB61，该工作为进一步建立一种以4H2B为底物绿色、高效合成(R)-1，3-BDO奠定基础。

发明内容

(1)本发明的目的：筛选到能以4H2B为底物通过生物催化生产光学纯(R)-1，3-丁二醇(e.e.100％)的酵母，并对其形态与生理生化特征进行鉴定，将该菌命名为Pichiajadinii HB01，该菌可以将4H2B为转化为光学纯(R)-1，3-BDO(e.e.100％)，并对产物进行定性定量鉴定，该工作为进一步建立一种以4H2B为底物绿色、高效合成光学纯(R)-1，3-BDO奠定基础。

(2)本发明的技术方案：一种通过微生物不对称还原4H2B为光学纯(R)-1，3-BDO的方法，是在不对称性还原合成光学纯(R)-1，3-BDO的反应体系中，体系pH为7.0，以本实验室筛选并保藏的菌株为转化菌株，加入4H2B和葡萄糖，控制温度30℃，摇床转化28h，通过气相色谱定性定量检测转化液中物质成分，筛选出能不对称还原4H2B为光学纯(R)-1，3-BDO的菌株。本发明成功筛选到一株能不对称还原4H2B为光学纯(R)-1，3-BDO(e.e.100％)的菌株，通过18S rDNA鉴定，将其命名为Pichia jadinii HB61，已于2009年5月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M209103。

主要试剂：

(R)-1，3-BDO，(S)-1，3-BDO，(R，S)-1，3-BDO 购自美国Sigma-Aldrich公司

(R)-1，3-BDO，(S)-1，3-BDO和(R，S)-1，3-BDO分析方法的确定：

(R)-1，3-BDO，(S)-1，3-BDO和(R，S)-1，3-BDO标样在supelco β-120手性柱上通过气相色谱进行分析，(R)-1，3-BDO的保留时间为16.73min，(S)-1，3-BDO的保留时间为16.98min。所有气相色谱仪为varian 3900，手性柱supelco β-120(250×2.5mm)。

确定具体色谱条件为：手性柱supelco β-120(250×2.5mm)；柱温：140℃；进样口温度250℃，进样量为0.5μL；检测器温度300℃。

产物光学纯度通过对映体过量值(％e.e.)来评价。

(R)-1，3-BDO ％e.e.＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]

产率yield＝(Cp/Cs₀)×100％

S_R：反应后(S)-对映体的峰面积；S_S：反应后(R)-对映体的峰面积；Cp：反应后(R)-对映体的摩尔浓度；Cs₀：反应前底物4H2B的初始浓度。

目的菌株的筛选：以本实验室筛选并保藏的菌株作为供试菌株，将出发菌株在斜面培养基上活化后，接种于装有100mL种子培养基的500mL的三角瓶中，振荡培养28h，离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0.1mol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0.05g 4H2B，然后置于30℃、200r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取上清液以备检测；取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物(R)-1，3-BDO含量。

目的菌株的鉴定：采用18S rDNA测序，将该序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的DNA序列进行比对，结果表明其与Pichia jadinii strain DC 3343的18S rDNA序列相似性最高，为99.8％，为Pichia jadinii的一个亚种，将其命名为：Pichia jadiniiHB61。

产物的定性检测：采用气质联用(GC-MS)来鉴定产物中是否含有1，3-BDO。分别测定1，3-BDO标样GC-MS图谱，转化液用乙酸乙酯萃取后的GC-MS图谱，并进行图谱分析，确定转化液中是否含有1，3-BDO，随后用手性柱检测转化液中产物1，3-BDO的光学纯度。

产物的定量检测：用气相色谱法(GC)检测转化液中产物1，3-BDO的生成量与底物4H2B的残留量。

(3)本发明的有益效果：

以本实验室筛选并保藏的菌株作为供试菌株，将出发菌株在斜面培养基上活化后，接种于装有100mL种子培养基的500mL的三角瓶中，振荡培养28h，离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0.1mol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0.05g 4H2B，然后置于30℃、200r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取上清液以备检测；取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物(R)-1，3-BDO合成情况。国内市场上的供应的(R)-1，3-BDO基本上是从国外进口的，本发明为以4H2B为底物微生物法工业化生产(R)-1，3-BDO奠定基础。

将较廉价底物4H2B转化成具有附加价值较高的用于合成光学性化合物氮杂环丁酮，其是青霉烯抗生素、信息激素、香料和杀虫剂合成的中间体原料(R)-1，3-BDO；同时用微生物法生产(R)-1，3-BDO，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

附图说明

图1 1，3-BDO标准品GC-MS图谱

图2 图1中6.23min处解图结果

图3 (R)-1，3-BDO标准品手性柱GC图谱

图4 (S)-1，3-BDO标准品手性柱GC图谱

图5 4-羟基-2-丁酮标样填充柱GC图谱

图6 (R)-1，3-BDO标准品填充柱GC图谱

图7 P.jadinii以4H2B为底物28h转化液的GC-MS图谱

图8 图7中6.22min处解图结果

图9 P.jadinii以4H2B为底物28h转化液的手性柱GC图谱

图10 P.jadinii以4H2B为底物28h转化液加入少量标准品(R)-1，3-BDO的手性柱GC图谱

图11 P.jadinii以4H2B为底物28h转化液加入少量标准品(S)-1，3-BDO的手性柱GC图谱

图12 P.jadinii以4H2B为底物28h转化液填充柱GC图谱

具体实施方法

实施例1：菌株的筛选：

将出发菌株划线于YEPD培养基上(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 6.0，0.8MPa灭菌15min。)培养28h后，挑取单菌落接种于装有100mL种子培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，0.8MPa灭菌15min)的500mL摇瓶中，30℃培养28h；

用50ml的离心管收集培养28h后的菌液，离心后收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0.1mol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0.05g 4H2B，然后置于30℃、200r/min条件下振荡培养28h；收集转化液，离心，取上清液以备检测。

实施例2：1，3-BDO定性检测：

取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)来鉴定萃取液中是否含有1，3-BDO。气质联用检测条件：采用的色谱柱温控程序为：首先在50℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持10min，最后以20℃/min 的升温速率升至230℃。进样口温度为240℃，进样量为1μL，载气为高纯氮气，载气流量1.0mL/min；

TraceMS质谱条件：EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIST98谱库；

标准品1，3-丁二醇标准品GC-MS图谱及解图结果如图1和图2所示，菌株转化液GC-MS图谱如图7和图8所示。

实施例3：(R)-1，3-丁二醇光学纯度检测：

用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物1，3-BDO的光学纯度。气相色谱法检测条件如下：varian 3900型气相色谱仪，色谱柱温控程序为：首先在80℃下保温2min，然后以2.5℃/min的升温速率升至140℃并保持10min。进样口温度250℃，进样量为0.5μL，载气为高纯氢气，载气流量1.5mL/min；检测器温度300℃。

(R)-1，3-BDO标准品和(S)-1，3-BDO标准品手性柱GC图谱如图3和图4所示，P.jadinii以4H2B为底物28h转化液的手性柱GC图谱如图9、图10和图11所示；

实施例4：菌株的合成(R)-1，3-丁二醇能力检测：

将实施例1获得的转化液液中1，3-丁二醇及4-羟基-2-丁酮的含量采用气相色谱测定。安捷伦1490型气相色谱仪，2m不锈钢柱(

3mm)，国产高分子微球GDX-401(110目)为固定相。柱温：225℃，进样温度：230℃，检测温度：240℃，氮气作为载气，使用氢火焰检测器，进样5μL，4-羟基-2-丁酮保留时间为1.8min，1，3-丁二醇的保留时间为5.6min，用外标法计算转化液中4-羟基-2-丁酮和1，3-丁二醇的含量。

(R)-1，3-BDO标准品填充柱GC图谱如图6所示，P.jadinii以4H2B为底物28h转化液填充柱GC图谱如图12所示；

筛选到的一株酵母转化28h后，转化液中4-羟基-2-丁酮残留量为2.4g/L左右，1，3-丁二醇含量为7.6g/L左右，经过手性色谱柱检测，该产物为(R)-1，3-BDO。以上实验结果表明本发明在国内首次成功筛选到以4H2B为底物产光学纯(R)-1，3-丁二醇酵母菌。产物(R)-1，3-BDO的生成率达到70％以上，e.e.值100％。

Claims

1.一株不对称性还原4-羟基-2-丁酮(4H2B)为光学纯(R)-1，3-丁二醇酵母菌株的选育，其特征是以本实验室筛选和保藏的菌株作为供试菌株，以4H2B为底物微生物法生产(R)-1，3-丁二醇，将筛选得到的1株酵母菌株Pichia jadinii HB61，该菌能以4H2B为底物进行生物转化，得到光学纯(R)-1，3-丁二醇(e.e.100％)；

(1)菌株的筛选：

菌种筛选培养：以本实验室筛选和保藏的菌株作为供试菌株，将出发菌株划线于YPD培养基上(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 6.0，0.8MPa灭菌15min。)培养28h后，挑取单菌落接种于装有100mL种子培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，0.8M/Pa灭菌15min)的500mL摇瓶中，30℃培养28h；

生物转化：用50ml的离心管收集培养28h后的菌液，离心后收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0.1mol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0.6g葡萄糖，预培养10min后，再加入0.05g 4H2B，然后置于30℃、220r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取上清液以备检测；

(2)1，3-BDO定性检测：

取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液中是否含有1，3-BDO。气质联用检测条件：采用的色谱柱温控程序为：首先在50℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持10min，最后以20℃/min的升温速率升至230℃。进样口温度为240℃，进样量为1μL，载气为高纯氮气，载气流量1.0mL/min，检测器温度为240℃；

TraeeMS质谱条件：EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；

(3)(R)-1，3-丁二醇光学纯度检测：

用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物1，3-BDO的光学纯度。气相色谱法检测条件如下：varian 3900型气相色谱仪，色谱柱温控程序为：首先在80℃下保温2min，然后以2.5℃/min的升温速率升至140℃并保持10min。进样口温度250℃，进样量为0.5μL，载气为高纯氢气，载气流量1.5mL/min；检测器温度300℃；

(4)菌株鉴定

提取出发菌株的基因组DNA

以出发菌株的基因组DNA为模板，使用酵母菌18S rDNA的通用引物进行扩增

P1：5’-ACCGGAATTC GCCTGAGAAACGGCTACC-3’

P2：5’-ACCGGAATTC GGCAGGGACGTAATCAAC-3’

PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mol/L的引物P1和P2各0.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5V，5U/μL 的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5min，56℃退火90S，72℃延伸2min，94℃变性1min，循环30次；

用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18-T载体，转化E.coli JM109。经Amp抗性筛选，获得阳性克隆。18S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。

2.根据权利要求1所述的酵母菌株的18S rDNA分析，该酵母菌株分类名称为：Pichiajadinii，将其命名为Pichia jadinii HB61。

3.根据权利要求2所述的酵母菌株，其特征是将酵母接种于100mL种子培养基(蛋白胨g/L，酵母膏g/L，葡萄糖g/L)的500mL的三角瓶中，30℃，150r/min，培养28h后，离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0.1mol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0.05g 4H2B，然后置于30℃、220r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取上清液以备检测；上清液用于对产物进行定性定量检测，测得1，3-丁二醇的含量为7.6g/L。

4.根据权利要求3所述的酵母菌株转化过程，其特征是取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物1，3-BDO的光学纯度。气相色谱法检测条件如下：varian 3900型气相色谱仪，色谱柱温控程序为：首先在80℃下保温2min，然后以2.5℃/min的升温速率升至140℃并保持10min。进样口温度250℃，进样量为0.5μL，载气为高纯氢气，载气流量1.5mL/min；检测器温度300℃；乙酸乙酯萃取液中测得(R)-1，3-丁二醇的e.e.值为100％。