CN107460231B - 一种小麦白粉菌喷雾接种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小麦白粉病菌接种方法，属于作物病原菌接种方法的技术领域。该方法包括：(1)单孢菌株的扩繁；(2)分生孢子的收集；(3)用C5‑18‑全氟烷(FluorinertTM FC‑40)悬浮孢子粉，并调成孢子数为106个/mL的白粉菌抱子悬浮液；(4)喷雾接种；本发明能够使小麦白粉病菌喷雾接种均匀，精确定量，克服了抖落法接种不均、无法精确定量等缺点，以保证小麦白粉病原菌相关研究工作的正常开展。本发明可以在小麦白粉病抗性鉴定与育种单位中推广应用。

Description

一种小麦白粉菌喷雾接种方法
技术领域
本发明属于植物病原专性寄生菌接种方法的应用技术领域，具体涉及一种小麦白粉菌喷雾接种方法。
背景技术
小麦白粉菌是属于气流传播的病害，主要通过白粉菌的分生孢子随气流传播，并且该菌在培养基上不能生长为专性寄生菌，只能在新鲜的寄主植物上一代一代的转接。因此，在研究病害发生规律，鉴定品种的抗病性及农药生物活性测定等工作时，都需借助人工接种才能得出比较可靠的结论。
已有报道包括黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦、辣椒、番茄、草莓、葡萄、苹果、甜瓜、橡胶树、烟草和月季等13种白粉病可采用孢子悬浮液喷雾和抖落法接种进行抗性评价。例如张志宏等采用喷雾法和抖落法接种对草莓白粉病抗性鉴定，结果认为喷雾法接种菌丝生长得很好，菌丝分布均匀；采用抖落法接种，菌丝生长得也很好，但叶盘上的菌丝分布不如喷雾法均匀(张志宏，2004)，除了孢子分布不均匀之外的不足，抖接法无法精确定量，只能凭借接种者的经验估测接种量，从而可能影响鉴定结果。然而有一些白粉菌，例如小麦、大麦、月季、豌豆和苜蓿等5种不能采用孢子悬浮液喷雾，而只能采用孢子粉接种。这主要是因为在使用无菌水配成的孢子悬浮液内，这些白粉菌的分生孢子在6-8h内可保持外形不变，10h后会因吸水而胀裂而死亡。因此，有很多学者为了能够使用喷雾接种而调节悬浮液的渗透压，确保孢子具有较强的萌发力。例如，在葡萄白粉菌接种悬浮液准备中，每1000ml无菌水悬浮孢子液加入7.8g葡萄糖(为了调整白粉菌的最佳渗透压)进行喷雾接种，使接种孢子具有较强的萌发力(王跃进，1999)。本发明人曾使用甘露醇、脯氨酸、丙三醇、山梨醇、生理盐水和葡萄糖等这些能够降低水势的化合物配成孢子悬浮液进行小麦白粉菌喷雾接种，但是均没有成功。
氟化物的表面张力是所有已发现的化合物中，表明张力最低的一类，比有机硅的表面张力还好，水表面张力为73答因/厘米，酒精为27答因/厘米，有机硅的表面张力为20-27答因/厘米，而有机氟的表面张力13-19达因/厘米。其中全氟烷是无色、透明全氟化学品，具有良好的化学惰性、电气绝缘性能、热传导性和独特的表面张力广泛应用于半导体制造厂作为热传导介质。C5-18-全氟烷(CAS：51142-49-5)，英文名Fluorinertfc-40(FC-40)，密度为1.85g/mL在25℃下，熔点为-57℃，沸点为158-173℃。主要应用于蚀刻设备、离子注入设备、测试设备及其他设备。
发明内容
针对抖接法接种白粉病菌不均匀、无法精确定量等缺点，本发明主要寻找一种能够精确定量、接种均匀的喷雾接种方法。
为实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种小麦白粉菌喷雾接种方法，按以下步骤进行：
(1)单孢菌株的扩繁：温室隔离培养高感小麦苗至第一叶完全展开，剪取叶片中段，叶片正面朝上放置在琼脂保鲜培养基上，在接种装置内对上述离体叶段接种预先繁殖好的新鲜分生孢子，接种后置于17±l℃，18h光照条件下培养，待大量产生孢子，备用；
(2)分生孢子的收集：取步骤(1)的培养皿置于超净工作台上，将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中，备用；
(3)用C5-18-全氟烷(FC-40)悬浮步骤(2)的孢子粉，制成接种体悬浮液，使用震荡器振荡30s使孢子在溶液中悬浮均匀，在显微镜下用血球计数板调整孢子浓度为106个/mL，作为接种体备用；
(4)将步骤(3)的接种体均匀喷雾于待检测的小麦叶片上，待喷雾处理的小麦叶片上出现明显病斑时，进行结果调查。
优选地，如上所述的一种小麦白粉菌喷雾接种方法，其特征在于：步骤(1)的琼脂保鲜培养基为：1L琼脂培养基中加入50mg苯骈咪唑。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：接种浓度可以精确定量，接种效果均匀，适宜室内抗性鉴定及药剂活性筛选研究工作，可以在小麦白粉病抗性鉴定与育种单位中推广应用。
附图说明
图1为不同孢子质量浓度接种效果图。从左到右依次为106、105、104、103、102和0个/mL孢子数，上下两排为两个重复。
图2为采用孢子喷雾法对不同小麦材料离体叶段抗病性测定接种效果图：图中每1个叶段为一个小麦品种，共计有30个小麦品种。
图3为置于田间自然条件下喷雾接种发病效果图。
图4为电子氟化液C5-18-全氟烷(FC-40)与甘露醇接种效果对比图，其中左边为C5-18-全氟烷(FC-40)接种皿，右边为甘露醇接种皿。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
使用英国Burkard公司波特喷雾塔和手动微型喷雾器(10毫升)两种方式喷雾，通过实施例完成后发现两者没有显著差异，因此在实施例中都使用英国Burkard公司的电动喷雾塔。
实施例1不同孢子质量浓度接种效果
剪取预先准备好的感病品种“晋麦47”第一叶中断3cm长，挑选10片叶片正面朝上放在含苯骈咪唑的琼脂保鲜培养基上，在超净台上收集预先初繁繁殖好的新鲜分生孢子到无菌5m L的离心管中，吸取4mL C5-18-全氟烷(FC-40)溶液到装有孢子粉的离心管中，制成接种体悬浮液。使用Vortex震荡器振荡30s使孢子在溶液中悬浮均匀，吸取10μL悬浮液在显微镜用血球计数板调整孢子浓度分别为106、105、104、103和102个/m L，作为接种体备用；同时使用不含孢子的FC-40溶液作为阴性对照，观察FC-40对小麦叶片有无伤害。接种后置于生长间培养(17±l℃，17-19h光照/天)8-10天，效果图见图1。
从图1结果得出：FC-40溶剂对小麦叶片无伤害，叶片同样保持鲜绿，随着孢子质量浓度降低，叶片发病的病斑也逐渐减少，呈梯度关系，106个/m L孢子质量浓度叶片发病最好，适宜抗病性测定；同时，孢子质量浓度越高发病时间也越早，106个/m L孢子质量浓度在5天见明显病斑，104个/m L孢子质量浓度在8天见明显病斑。
实施例2、不同喷雾量接种效果
接种叶片和接种体的准备同实施例1。
采用喷雾量分别为3m L、4m L和5m L在波特喷雾塔下喷雾，接种后置于生长间培养(17±l℃，17-19h光照/天)8-10天。观测结果显示，不同喷雾量接种效果不存在差异，均能充分发病。
实施例3、不同小麦品种抗病性鉴定效果
根据不同孢子质量浓度接种效果和品种抗病性鉴定的要求，抗病性鉴定使用孢子的浓度为1×106个/毫升。剪取预先准备好的30个小麦品种的第一叶中断3cm长，叶片正面朝上放在含苯骈咪唑的琼脂保鲜培养基上，按照实施例1中方法准备接种体孢子悬浮液，调整孢子浓度1×106个/毫升。将待测30个小麦品种放置于波特喷雾塔下，取孢子悬浮液4mL喷雾接种，接种后继续放置于喷雾塔下1-2分钟，保证接种孢子的充分沉降。接种后置于生长间培养(17±l℃，17-19h光照/天)8-10天，效果图见图2，从图2的结果得出：30个小麦品种发病充分，并且能够很好的区别不同品种不同药剂浓度处理的梯度明显，说明接种浓度适宜。
实施例4、田间接种效果
营养钵盆栽育苗，当小麦叶片长到1叶1心时接种。每钵留苗15株，3钵1个重复。使用孢子的浓度为1×106个/毫升。用10ml的手动微型喷雾器喷洒药液，叶片正反面均匀喷到，药液自然干燥后，用手持塑料喷雾器均匀喷洒菌液在叶片正反两面。喷洒药(菌)液时，以雾滴布满叶面正反面但不滴落为宜。接种后将营养钵置于田间，结果见图3。
由图3可知，在田间自然环境中，7天就可以明显看到密集的侵染点，9天就有明显的菌落。说明这种方法完全可以用于田间抗性鉴定的接种，不受自然环境限制。
实施例5.普通等渗压溶液与电子氟化液接种比较
将甘露醇、脯氨酸、丙三醇、山梨醇、生理盐水和葡萄糖，按照1L无菌去离子水中添加15g配置为等渗压溶液，分别取5ml等渗压溶液加入小麦白粉病菌孢子，调整孢子浓度使其达到106个孢子/ml,按照实施例1准备电子氟化液接种方式，在波特喷雾塔下喷雾，接种后置于生长间培养(17±l℃，17-19h光照/天)8-10天。观测结果显示，除了电子氟化液接种成功之外，其它六种等渗压溶液均没有接种成功，其中电子氟化液C5-18-全氟烷(FC-40)与甘露醇接种效果对比见图4。

Claims (2)

1.一种小麦白粉菌喷雾接种方法，其特征在于：该喷雾接种方法按以下步骤进行：
(1)单孢菌株的扩繁：温室隔离培养高感小麦苗至第一叶完全展开，剪取叶片中段，叶片正面朝上放置在琼脂保鲜培养基上，接种预先繁殖好的新鲜分生孢子，接种后置于17±l℃，18h光照条件下培养，待大量产生孢子，备用；
(2)分生孢子的收集：取步骤(1)的培养皿置于超净工作台上，将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，将分生孢子收集到无菌离心管中，备用；
(3)用C5-18-全氟烷悬浮步骤(2)的孢子粉，制成接种体悬浮液，使用震荡器振荡30s使孢子在溶液中悬浮均匀，并调整孢子浓度为106个/mL作为接种体备用；
(4)将步骤(3)的接种体均匀喷雾于待检测的小麦叶片上，待小麦叶片上出现明显病斑时，进行结果调查。
2.如权利要求1所述的一种小麦白粉菌喷雾接种方法，其特征在于：步骤(1)的琼脂保鲜培养基为：1L琼脂培养基中加入50mg苯骈咪唑。
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