CN108977363A - 试验用小麦白粉病菌培养制备方法 - Google Patents

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徐飞
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宋玉立
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Abstract

本发明公开了一种试验用小麦白粉病菌培养制备方法，旨在解决大量试验白粉病菌的培养与收集困难的技术问题。该试验用小麦白粉病菌收集方法包括以下步骤：（1）小麦白粉病菌株的分离纯化；（2）小麦白粉病菌株的扩繁；（3）小麦白粉病菌的收集。本发明的方法采用活体方式，小麦白粉菌可继续在小麦麦苗上定殖生长，菌株具有生长优势；收集菌株时无需通过人工剪苗离体培养，简便、省时、省力；且收集到的小麦白粉病菌的菌量大。

Description

试验用小麦白粉病菌培养制备方法
技术领域
本发明涉及植物病原寄生菌技术领域，具体涉及一种试验用小麦白粉病菌培养制备方法。
背景技术
由布氏白粉菌（Blumeria graminis(DC.) E.O.Speer f.sp.tritici）侵染引起的小麦白粉病几乎在全球范围内的所有小麦生产区都时有发生，尤其在20世纪80年代后，小麦白粉病曾多次流行，成为严重制约小麦生产的重要病害。小麦白粉病主要发生于叶片上，也可发生于植株叶鞘、茎秆和穗部。一般叶正面病斑较叶背面多，下部叶片较上部叶片病害重。病部表面附层白粉状霉层，病部最先出现白色丝状霉斑，逐渐扩大并相互联合，呈长椭圆形较大的霉斑，严重时可覆盖叶片大部，甚至全部，霉层厚度可达2毫米左右，并逐渐呈粉状。后期霉层逐渐由白色变为灰色，上生黑色颗粒。叶早期变黄，卷曲枯死，重病株常常矮缩不能抽穗，对小麦的产量和品质影响十分严重，是影响我国小麦生产上最严重的病害之一。
为了深入开展小麦白粉病菌分子生物学的相关研究，以及药剂筛选研究，就需要有大量一致性好、性状表现稳定的试验研究用小麦白粉病菌。但是，由于小麦白粉病菌是一种专性寄生菌，需要从活体寄主组织中获取必要的养分，并且该菌在培养基上不能生长，为活体寄生菌，只能在新鲜的寄主植物上一代一代的转接，在病菌的培养制备、收集保存上尚存在有较大困难。
因此，大量试验用的一致性好、稳定性好的白粉病菌的培养制备与收集成为目前亟待解决的技术问题，开发一种简便易行、省时省力的试验用的小麦白粉病菌收集的方法迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术中缺乏大量试验用小麦白粉病菌收集的方法这一现状，本发明提供一种试验用小麦白粉病菌培养制备方法，旨在简便快速地制备、收集到大量一致性、稳定性好的小麦白粉病菌。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
设计一种试验用小麦白粉病菌培养制备方法，包括以下步骤：
（1）小麦白粉病菌株的分离纯化
I. 无菌条件下，将野外采集或试验室保藏的小麦白粉病菌样转接到无菌麦苗上，置于温度17～19℃（最适宜温度为18℃）、光照12000～18000LX、湿度50～60%条件下培养4～5天；
II. 待小麦叶面上可见侵染点但尚未长出分生孢子时，剪下含有单个分生孢子堆的叶段，置于含苯骈咪唑的水琼脂培养基上，于温度17～19℃（优选18℃）、光照12000～18000LX，湿度50～60%条件下培养4～5天；
III. 将单孢子堆的分生孢子接种到无菌麦苗上，得纯化菌株；
（2）小麦白粉病菌株的扩繁
将所述纯化菌株转至新鲜的无菌管苗上进行扩繁，置17～19℃（优选18℃）光照条件下培养10～12天，再次转接扩繁；
（3）小麦白粉病菌的收集
a. 种植盆苗：取种植盆，压实盆中营养土，在盆中央种植小麦种子，得盆苗，出苗后在盆上加罩玻璃筒，所述玻璃筒上端罩有隔离纱布；
b. 待盆苗长至一叶一心期时，倒扣玻璃筒，去掉麦苗根部浮土；将所述步骤（2）中扩繁的白粉菌株转接到盆苗中，置17～19℃（优选18℃）光照条件下培养10～12天；
c. 当麦苗上产生大量分生孢子时，去掉玻璃筒上端的隔离纱布，倒扣玻璃筒于纸上，敲打玻璃筒使麦苗上的小麦白粉病菌分生孢子粉抖落；
d. 移开玻璃筒收集孢子，干燥3～4天，冷冻保存。
优选的，在所述步骤（1）中，将小麦白粉病菌样转接至一叶一心期无菌麦苗上。
进一步的，在所述步骤（1）中，所述水琼脂培养基含浓度为60 mg/L的苯骈咪唑和4.5g/L的琼脂粉。
优选的，在所述步骤（3）的a中，待麦苗刚长出时，倒扣盆苗，去掉麦苗上的浮土。
优选的，在所述步骤（3）的c中，所述纸为硫酸纸或称量纸。
进一步的，在所述步骤（3）的c中，所述抖落时用纱布扫除落在玻璃筒以外的土。
优选的，在所述步骤（3）的d中，所述干燥采用变色硅胶干燥剂。
优选的，在所述步骤（3）的d中，所述冷冻的温度控制为-40～-20℃
进一步的，在所述步骤（3）的d中，收集过孢子的盆苗用纱布罩好玻璃筒，4～5天后进行孢子的二次收集。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明采用活体方式而非离体方式，小麦白粉菌可以继续、连续的在小麦麦苗上定殖生长，菌株具有生长优势。
2. 本发明收集菌株方式采用活体方式，不用通过人工剪苗离体培养，省去离体培养时大量制作水琼脂培养基、将带有显症小麦白粉菌麦苗叶段剪下，整齐摆放在配制好的水琼脂培养基上等繁琐步骤，简便、省时、省力。
3. 本发明的方法制备收集到的小麦白粉病菌菌量大，一致性、稳定性好，菌株干燥后重量平均在25～55mg之间，可以满足分子生物学试验需要。
附图说明
图1为盆苗种植过程示意图；
图2为白粉菌收集步骤示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂、原料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用小麦品种，为小麦高感白粉病品种：津丰1号。
实施例1：分离、纯化和扩繁小麦白粉病菌
（1）在超净工作台中，取高感小麦津丰1号于大玻璃管中，种植10天，使麦苗处于“一叶一心”期，得无菌管苗；
（2）将田间采集到的携带小麦白粉菌的小麦叶片采用抖落孢子的方法转接到长在大玻璃管中的麦苗上，玻璃管上罩4层纱布以隔离杂菌，于温度18℃、光照12000～18000LX、湿度50～60%条件下生长5天；
（3）待小麦叶面上可见侵染点但尚未长出分生孢子时，剪下含有单个分生孢子堆的叶段，放在含有60 mg/L苯骈咪唑的0.45%的水琼脂培养基上，置于于温度17℃、光照12000～18000LX、湿度50～60%的光照培养箱中培养4～5天；
其中，水琼脂培养基的具体制作方法为：称取4.5g琼脂粉，加入到1000ml蒸馏水中，微波炉中加热至完全沸腾，冷却至30～40℃时加入 6 ml 配制好的0.1% 苯骈咪唑，充分混匀后倒入培养皿中；
（4）将单孢子堆的分生孢子接种到无菌苗上，重复步骤（3），获得纯化菌株；
（5）将其转至新鲜的无菌管苗上进行扩繁，置于18℃光照培养箱中培养10～12天，得管苗扩繁菌。
实施例2：收集小麦白粉病菌
（1）种植盆苗：取直径11.5cm，高10cm得塑料盆，压实盆中的营养土，放置津丰1号种子（尽量靠盆的中央），然后用薄土盖住种子即可。这样做可减少后期浮土，且麦苗比较集中利于收菌。
（2）待麦苗刚长出时，倒扣盆苗，用镊子将麦苗上覆盖的一层浮土轻轻弹掉，防治后期收菌时盆面上的土会散落下来影响菌的收集。
（3）如图1所示，出苗后用直径9.5cm，厚度2.0cm，高29.5cm上端罩有5层纱布的玻璃筒罩上，防止苗被侵染。
（4）待盆苗长至一叶一心期时，倒扣玻璃筒，将麦苗根部上的土用镊子轻轻弹掉。将试管中扩繁好的白粉菌株转接到盆苗中继续扩繁，置于19℃光照培养箱中培养10～12天。
（5）当充分产生大量分生孢子时，如图2所示，去掉玻璃筒上的纱布，倒扣玻璃筒于硫酸纸上，轻轻敲打玻璃筒使麦苗上的小麦白粉病菌分生孢子粉充分抖落于硫酸纸上，再用纱布小心扫除落在玻璃筒以外的土，以免混入到收集好的菌中；
（6）移开玻璃筒收集孢子于离心管中，置入变色硅胶中干燥3～4天，-40～-20℃冰箱中保存。收集过孢子的盆苗用纱布罩好，待4～5天后进行孢子的二次收集。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (8)

1.一种试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）小麦白粉病菌株的分离纯化
I. 无菌条件下，将野外采集或试验室保藏的小麦白粉病菌样转接到无菌麦苗上，置于温度17～19℃、光照12000～18000LX、湿度50～60%条件下培养4～5天；
II. 待小麦叶面上可见侵染点但尚未长出分生孢子时，剪下含有单个分生孢子堆的叶段，置于含苯骈咪唑的水琼脂培养基上，于温度17～19℃、光照12000～18000LX，湿度50～60%条件下培养4～5天；
III. 将单孢子堆的分生孢子接种到无菌麦苗上，得纯化菌株；
（2）小麦白粉病菌株的扩繁
将所述纯化菌株转至新鲜的无菌管苗上进行扩繁，置17～19℃的光照条件下培养10～12天，再次转接扩繁；
（3）小麦白粉病菌的收集
a. 种植盆苗：取种植盆，压实盆中营养土，在盆中央种植小麦种子，得盆苗，出苗后在盆上加罩玻璃筒，所述玻璃筒上端罩有隔离纱布；
b. 待盆苗长至一叶一心期时，倒扣玻璃筒，去掉麦苗根部浮土；将所述步骤（2）中扩繁的白粉菌株转接到盆苗中，置17～19℃光照条件下培养10～12天；
c. 当麦苗上产生大量分生孢子时，去掉玻璃筒上端的隔离纱布，倒扣玻璃筒于纸上，敲打玻璃筒使麦苗上的小麦白粉病菌分生孢子粉抖落；
d. 移开玻璃筒收集孢子，干燥3～4天，冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，将小麦白粉病菌样转接至一叶一心期无菌麦苗上。
3.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，所述水琼脂培养基含浓度为60 mg/L的苯骈咪唑和4.5g/L的琼脂粉。
4.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）的a中，待麦苗刚长出时，倒扣盆苗，去掉麦苗上的浮土。
5.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）的c中，所述纸为硫酸纸或称量纸。
6.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）的c中，所述抖落时用纱布扫除落在玻璃筒以外的土。
7.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）的d中，所述干燥采用变色硅胶干燥剂。
8.根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）的d中，所述冷冻的温度控制为-40～-20℃
根据权利要求1所述的试验用小麦白粉病菌培养制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）的d中，收集过孢子的盆苗用纱布罩好玻璃筒，4～5天后进行孢子的二次收集。
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