CN111876336A - 胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用 - Google Patents

胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用，该类真菌为胶膜菌属菌株，为Tulasnella sp.GYBQ01，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：M 2020129。本发明提供了该菌株的形态学及其生理生化特征。根据形态学、生理生化、核苷酸序列分析结果表明，Tulasnella sp.GYBQ01属于胶膜菌科胶膜菌属的一株真菌，该菌株可用于促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗，具有较强的专一性，可利用该菌株接种白旗兜兰种子获取优质的共生种苗，实现共生萌发的高效培育种苗，可用于苗圃育苗或野外真菌拌种直播，相对于组织培养具有成本低廉，野外栽培成活率高，无组织退化问题等优点，为开展白旗兜兰的仿生态栽培、物种回归和种群重建奠定基础。

Description

胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用
技术领域
本发明涉及胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用，属于应用微生物领域。
背景技术
白旗兜兰 ( Paphiopedilum spicerianum)，最早发现于印度北部的阿萨姆邦(Assam)，后来在印度东北部与缅甸交界处也有发现。其花朵中萼片大、白色，像一面白色的旗帜，上部向前弯曲成拱形，假雄蕊为耳状倒心形，具有极高的观赏和育种价值。2006年在我国云南省普洱市首次发现有白旗兜兰的野外分布，也是在我国唯一确认的野外分布点，原生地种群仅存20余株。该种群生长在一个外来移民村村口小河沟边陡峭的河岸上，其生长环境土质松软，河岸极易因大雨冲刷或小河涨水而崩塌，小河周围是咖啡种植园，河水已被咖啡加工厂的废料严重污染，其生长环境十分恶劣，2011年被国家林业部纳入《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划》。
兰科植物的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行濒危种类野外回归时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发能很好的解决这一问题。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离，但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。因此，获得种子萌发的有效共生真菌是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用。
本发明采用如下技术方案实现。
一类真菌，该类真菌为胶膜菌属菌株，为Tulasnella sp. GYBQ01，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：M 2020129，保藏时间为2020年5月18日。地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学。
本发明所述该菌株核苷酸序列中nrDNA ITS序列特征为：GATATGCTTAAGTCTAGCGGGTTGTCCTACCCCAATGAGGTCATGCGTTGTAGTACCGACGTCCAGACGGACGCGGACTTGGTGACGCGAGCCCAACGGCCGGTCAAGCGCGTCTCAAGCTCAAAGGGACTCCACGCTCAGGCATTAGAGTACCCATCAGGCGATCGGCGCGACGCATCTAAGAGAACACGATCCACAGAGGACCGAGGACTCCGAGCTCGGGTCTTTCAGCAAGGAAAGACTCCCGAAGGAATACAATGACGCTCAAAGGGGCATACCGCAGCCGGATTAGGGCGCGGTGCAATGCGTTCAACAACTCGATGATTCACGTATAAGTGGTGGACTTGCGCATCACATCACTTTATCGCAATTTGCAACGGTCTTCATCGAATGACGTGCCAAGGGATCCAGCGCTGCCGGTTGTAGAAAGTTTACAACTGGTGTTAGACTCACAACGCGGAACGATCTTTAACGTGTGCCTCCAAAGAGGTAACACAGGCAAGCGACCGTTTAACCTCGGTCAGAGGGGTCGTTTATCCTYGACCAGAGCGCCTTAACGTCCCGAGGACGATGGAGATAGAACGTCAAAGACGATTACTATGATCCTTCCGCAG。
本发明所述的胶膜菌属菌株在PDA平板上培养7天其菌落呈白色，表面覆盖柔毛，多气生菌丝，规则圆形发散生长；在25±2 ℃条件下真菌培养箱内培养14天，取插片按常规制片方法制片，光学显微镜下观察, 菌丝具隔膜，粗2.5～5.5μm，分枝近直角，分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象。
本发明所述的真菌，包括促进白旗兜兰(Paphiopedilum spicerianum)种子萌发形成幼苗中的应用的显著特征。
本发明该真菌菌株的分离获得及分子生物学鉴定方法步骤为：
1-迁地共生萌发原球茎的诱导
(1)2018年9月采集云南普洱白旗兜兰原生境基质带回实验室，将基质放在塑料饭盒（20.5cm × 12.5cm × 6.0cm）内，覆盖网孔为45μm的尼龙网布，使网布与基质紧密相连。
(2)将储存在-20℃中的白旗兜兰种子取出，放在室温下10个小时，使种子温度恢复至室温。取少量种子于烧杯中，加入1 g•L-1的无菌琼脂悬浮液中充分摇匀，制成种子悬浮液。
(3)用5000mL移液枪吸取5mL悬浮液播种在尼龙网布上，盖好一次性塑料饭盒盖子，在人工培养箱内25 ± 2℃条件下。黑暗培养60天，60天后进行光照培养(光周期为12/12 h L/D)，每隔两周观察种子萌发情况，并保持塑料盒内基质的湿度。
(4)60后，观察到白旗兜兰种子萌发形成白色原球茎，收集原球茎用于后续的分菌实验。
2-胶膜菌属GYBQ01菌株的分离
(1)原球茎的来源：白旗兜兰种子迁地共生萌发实验获得共生萌发形成的白旗兜兰原球茎。
(2)原球茎内共生真菌的诱导、分离纯化及保存：取出萌发的原球茎，放入盛有1%次氯酸钠（NaClO）溶液的灭菌烧杯中，轻轻摇动烧杯，5 min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上，用无菌刀片将原球茎切成两半，置于PDA培养基中25°C培养箱培养。待在原球茎伤口处长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落。
(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量PDA培养基倒入规格为18 × 20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的 1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌（121°C，20 min）。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25 ± 2°C培养。待菌丝要长满PDA斜面时，将试管取出存入4°C冰箱内保存。
分离得到的菌株在中国典型培养物保藏中心进行生物保藏，且存活。
3-胶膜菌属GYBQ01菌株的鉴定
(1)将胶膜菌属真菌GYBQ01菌株的nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其Genbank号为：MN733451；对其进行BLAST比对，鉴定结果表明该菌株与JX514385.1真菌Tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到99.84%。
本发明中所述的胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01主要具有以下微生物学特征：
①形态学特征
胶膜菌属菌株在PDA平板上培养7天其菌落呈白色，表面覆盖柔毛，多气生菌丝，规则圆形发散生长。
②生理生化特性
观察菌株显微形态特征使用盖玻片插片培养法，在25±2 ℃条件下真菌培养箱内培养14天，取插片按常规制片方法制片。光学显微镜下观察, 菌丝具隔膜，粗2.5～5.5μm，分枝近直角，分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象。
所述的分子生物学鉴定涉及的真菌总DNA提取采用CTAB法；PCR扩增所用引物为真菌通用引物ITS4和ITS5；PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。
利用种子与真菌在培养基内的共生萌发实验来检测分离到的真菌是否对种子萌发阶段有促进效果以及对比不同真菌对种子萌发阶段促进效果的差异：
（1）配制共生萌发培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4 g·L-1燕麦和8g·L-1琼脂，培养基pH为5.6~5.8；
（2）将胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01取出，接种在PDA培养基上，置于人工气候箱内，在温度为25 ± 2℃培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生萌发菌株；
（3）将消毒灭菌预处理的白旗兜兰种子加入到1 g·L-1的无菌琼脂悬浮液中混合均匀得到种子悬浮液，再将种子悬浮液均匀的播撒在燕麦琼脂培养基的培养皿中；
（4）将共生萌发菌株接种至燕麦琼脂培养基的培养皿中，再置于人工气候箱内，在温度为25 ± 2°C条件下恒温培养，前60天在黑暗条件下培养，后60d在光照强度为2000–3000Lx、光周期12h/12h L/D条件下培养。
（5）种子萌发情况检测和数据统计分析：统计4个阶段，即种子未萌发、种子萌发(种胚膨大并产生根状物)、原球茎形成和发育(种胚膨大突破种皮至出现原生分生组织)、幼苗分化和发育阶段(长出第一片叶片及后续生长)的量。按以上分级标准统计每组实验不同处理的种子萌发数量(g)，原球茎数量(p)和幼苗的数量(s)，并根据播种的种子总数(t)，SE为标准误。计算种子萌发率G = mean (g + p + s)/t ± SE，原球茎形成率P = mean (p+ s)/t ± SE和幼苗形成率S = mean s/t ± SE。
利用非参数检验方法Kruskal-Wallis test (KW)和 Mann- Whitney U – test(U)对不同处理的种子萌发率、形成原球茎比率及幼苗率进行显著性检验，α = 0.05 。
所述步骤(3)消毒灭菌预处理方法：将储存在-20℃种子保存库中的种子取出，放在室温下10h，使种子温度恢复至室温；将种子放在纸质的种子包内，用订书钉将纸袋封好；将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5~10min，轻轻的挤压出气泡；用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液(有效氯离子浓度为1%)及一滴洗涤剂的烧杯中，轻轻搅拌或摇动烧杯；10min后，将纸袋移至超净工作台，用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动；重复冲洗种子3~4次，轻轻挤压出纸袋内多余的水，用无菌剪刀剪开纸袋获得灭菌种子。
本发明的胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01具有如下优点：
(1)本发明胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01从白旗兜兰的原球茎中分离获取，其分离方法简单便捷；
(2)胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01可用于促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗，具有较强的专一性，可利用胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01与白旗兜兰种子共生获取优质的共生种苗，实现高效培育白旗兜兰种苗；相对于组织培养具有成本低廉，幼苗移栽野外成活率高，无组织退化问题等优点，具有代替组织培养获得共生种苗的应用价值；
(3)本发明工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，在珍稀濒危兰科植物的回归、极小种群的重建、解决白旗兜兰栽培产业的种苗来源瓶颈问题等方面都具有巨大的推广价值。
下面结合具体实施方式对本申请做进一步解释。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，但是本发明的保护范围并不仅限于所述内容。
实施例Ⅰ：迁地共生萌发原球茎的诱导、胶膜菌属真菌(Tulasnellasp.)GYBQ01菌株的分离与鉴定
1-迁地共生萌发原球茎的诱导
(1)2018年9月采集的云南普洱白旗兜兰原生境基质带回实验室，将基质放在遗传学塑料饭盒（20.5cm × 12.5cm × 6.0cm）内，覆盖网孔为45μm的尼龙网布，使网布与基质紧密相连。
(2)将储存在-20℃中的白旗兜兰种子取出，放在室温下10个小时，使种子温度恢复至室温。取少量种子于烧杯中，加入1 g•L-1的无菌琼脂悬浮液中充分摇匀，制成种子悬浮液。
(3)用5000mL移液枪吸取5mL悬浮液播种在尼龙网布上，盖好一次性塑料饭盒盖子，在人工培养箱内25 ± 2℃条件下、黑暗培养60天，60天后光照培养(光周期为12/12 hL/D)，每隔两周观察种子萌发情况，并保持塑料盒内基质的湿度。
(4)60天后，观察到白旗兜兰种子萌发形成白色原球茎，收集原球茎用于后续的分菌实验。
2-胶膜菌属GYBQ01菌株的分离
(1)原球茎的来源：白旗兜兰种子迁地共生萌发获得原球茎。
(2)原球茎内共生真菌的诱导、分离纯化及保存：取出萌发的原球茎，放入盛有1%次氯酸钠（NaClO）溶液的灭菌烧杯中，轻轻摇动烧杯，5 min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上，用无菌刀片将原球茎切成两半，置于PDA培养基中25°C培养箱培养。待在原球茎伤口处长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落。
(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量PDA培养基倒入规格为18 × 20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的 1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌（121°C，20 min）。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25 ± 2°C培养。待菌丝要长满PDA斜面时，将试管取出存入4°C冰箱内保存。
分离得到的菌株在中国典型培养物保藏中心进行生物保藏，且存活。
3-胶膜菌属GYBQ01菌株的鉴定
(1)将胶膜菌属真菌GYBQ01菌株的nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其Genbank号为：MN733451；对其进行BLAST比对，鉴定结果表明该菌株与JX514385真菌Tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到99.84%。
本发明中所述的胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01主要具有以下微生物学特征：
①形态学特征
胶膜菌属菌株在PDA平板上培养7天其菌落呈白色，表面覆盖柔毛，多气生菌丝，规则圆形发散生长。
②生理生化特性
观察菌株显微形态特征使用盖玻片插片培养法，在25±2 ℃条件下真菌培养箱内培养14天，取插片按常规制片方法制片。光学显微镜下观察, 菌丝具隔膜，粗2.5～5.5μm，分枝近直角，分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象。
所述的分子生物学鉴定涉及的真菌总DNA提取采用CTAB法；PCR扩增所用引物为真菌通用引物ITS4和ITS5；PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。
具体的，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITS1和ITS4；PCR反应体系(25μl)包括：2.5μl 10×PCR缓冲液，0.4μl dNTP，1.5μl Mg2+，1.5μl ITS1，1.5μl ITS4，0.2μl Taq酶，15.4μl ddH2O，2μl DNA模板；扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行，如下PCR循环：94℃预变性3 min，循环1次；94℃变性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循环；最后72℃延伸10min；PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序；对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类下地位；
本发明菌株鉴定结果表明该菌株与JX514385真菌Tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到99.84%。根据菌落、形态特征及分子生物学手段将本发明所涉及真菌鉴定为胶膜菌属真菌。
实施例2：胶膜菌属真菌GYBQ01菌株促进白旗兜兰种子共生萌发有效性实验
利用种子与真菌在培养基内的共生萌发实验来检测分离到的真菌是否对种子萌发阶段有促进效果以及对比不同真菌对种子萌发阶段促进效果的差异：
(1)配制共生萌发培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4 g·L-1燕麦粉和8 g·L-1琼脂，培养基pH为5.6~5.8；制备100皿燕麦培养基灭菌备用，每个实验处理重复30个皿，共3个处理；
(2)将存于温度为4℃试管斜面内的供试胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01取出，接种在PDA培养基上，然后置于人工气候箱内，在温度为25 ± 2℃培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生萌发菌株；
(3)将消毒灭菌预处理的白旗兜兰种子加入到1 g·L-1的无菌琼脂悬浮液中混合均匀得到种子悬浮液，用移液枪吸取种子悬浮液并将种子悬浮液均匀的播撒在燕麦琼脂培养基的培养皿中；其中消毒灭菌预处理方法：将储存在温度为-20℃中的种子取出，放在室温下10h，使种子温度恢复至室温；将种子放在纸质的种子包内，用订书钉将纸袋封好；将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5~10min，轻轻的挤压出气泡；用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液(有效氯离子浓度为1%)及一滴洗涤剂的烧杯中，轻轻搅拌或摇动烧杯；10min后，将纸袋移至超净工作台，用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动；重复冲洗种子3~4次，轻轻挤压出纸袋内多余的水，用无菌剪刀剪开纸袋获得灭菌种子；
(4)播种与培养：将无菌种子与1 g·L-1无菌琼脂溶液制作成无菌种子悬浮液；在OMA培养基中间接种约0.5cm3 (1× 1× 0.5cm)含有单一真菌纯培养物的琼脂块，用移液枪吸取150μl种子悬浮液（150微升的悬浮液约含35粒种子）均匀播种菌块四周，用封口膜将培养皿密封；其中3组燕麦琼脂培养基的培养皿中分别接种从白旗兜兰原球茎中分离得到的菌株GYBQ01 (Tulasnellasp.)、从竹叶兰原球茎分离得到的菌株AgP-1 (Tulasnellasp.)，设置另外1组不接菌的OMA培养基为营养缺乏培养基作为对照处理，中间接种0.5cm3无菌的纯PDA琼脂块；每组处理30个重复，置于人工气候箱内在温度为25 ± 2°C条件下恒温培养，前60天黑暗培养，60天后在光照强度为2000–3000Lx、光周期12h/12h L/D条件下培养。
(5)播种后60天检测种子萌发情况，记录种子萌发及形成原球茎的时间；培养120天后，当培养皿中产生大量处于发育初期阶段的幼苗时将全部培养皿取出，在立体显微镜下观察记录种子萌发及原球茎发育情况。在Arditti (1967)和其他相关研究对兰科植物种子萌发阶段的分级标准，本研究将种子萌发简化为4个阶段： 种子未萌发、种子萌发(种胚膨大并产生根状物)、原球茎形成和发育(种胚膨大突破种皮至出现原生分生组织)、幼苗分化和发育阶段(长出第一片叶片及后续生长)。按以上分级标准统计每组实验不同处理的种子萌发数量(g)，原球茎数量(p)和幼苗的数量(s)，并根据播种的种子总数(t)，SE为标准误。计算种子萌发率G = mean (g + p + s)/t ± SE，原球茎形成率P = mean (p + s)/t± SE和幼苗形成率S = mean s/t ± SE。
(6)共生培养120天截止实验时，利用非参数检验方法Kruskal-Wallis test (KW)和 Mann- Whitney U – test (U)对不同处理的种子萌发率、原球茎形成率及幼苗率进行显著性检验，α = 0.05；白旗兜兰任意接种处理包括空白对照均有种子萌发（表1）。
表1不同真菌对白旗兜兰种子萌发的影响 (120天统计)
处理组 菌种 萌发率(%) 原球茎率(%) 幼苗率(%)
GYBQ01 <i>Tulasnella sp.</i> 87.02±0.59% 37.38±2.88% 30.83±2.56%
AgP-1 <i>Tulasnella sp.</i> 65.71±0.79% 0 0
OMA 不接菌 61.31±1.13% 0 0
从表1可知，共生培养120天截止实验时，不接菌的OMA对照组有种子萌发但无原球茎和幼苗形成；接种从竹叶兰分离到的AgP-1菌株，萌发率为(65.71±0.79%)，但无原球茎和幼苗形成；而接种白旗兜兰的原球茎中分离到的GYBQ01菌株在第120天时不仅能显著促进白旗兜兰种子萌发(87.02±0.59%)，且能显著促进原球茎的形成(37.38±2.88%)以及显著促进原球茎后续发育成幼苗(30.83±2.56%)。表明Tulasnellasp.GYBQ01能有效促进白旗兜兰种子萌发并生长发育到幼苗阶段。
实验证实白旗兜兰与不同菌株在共生培养初期都能萌发，但种子萌发仅指种胚吸水膨胀尚未突破种皮，不具有实际应用价值，更重要的指标是幼苗形成比率。共生培养后期即幼苗形成时期，接种从竹叶兰中分离得到的能有效促进竹叶兰种子萌发的真菌胶膜菌AgP-1菌株不能促进白旗兜兰种子萌发形成原球茎及幼苗，然而从白旗兜兰种子迁地共生萌发的原球茎中分离得到的胶膜菌GYBQ01菌株，能有效的促进白旗兜兰种子萌发及后续幼苗的形成。白旗兜兰种子和本发明菌株表现出了较强的专一性，可以利用GYBQ01菌株和白旗兜兰种子共生萌发生产种苗。
兰科植物种子的萌发可以通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式；虽然大多数兰科植物可通过非共生萌发培养，且具有较高的萌发率，但是此方式获得的幼苗移植到自然界中，生长缓慢，抗病原微生物能力差，存活率较低，同时由于很难与后接触的真菌建立共生关系而导致后继生长严重受阻；共生萌发培养技术是指在特定的基质(培养基)中同时播种植物种子和共生真菌，该方法可以提高种子的萌发率、幼苗的生长速度以及移植到自然环境后的幼苗存活率；由于兰科植物种子与真菌的共生关系具有专一性，故不同兰科植物种子的共生真菌不同；确定能与白旗兜兰种子形成共生关系并促进其萌发的有效真菌是培育白旗兜兰幼苗的关键环节。共生种苗的获取是开展白旗兜兰回归原生境工作的基础。本发明的菌株通过共生萌发实验将白旗兜兰种子和不同的真菌及空白对照组分别在燕麦琼脂培养基上培养，通过种子萌发率的比较，成功地获得促进白旗兜兰种子萌发的有效菌株，从而为利用白旗兜兰种子和真菌共生萌发来高效培育种苗、种苗回归原生境及种群重建开辟了一条新的途径。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例（由于本发明的技术方案涉及数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准），方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南大学
<120>胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 614
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GATATGCTTAAGTCTAGCGGGTTGTCCTACCCCAATGAGGTCATGCGTTGTAGTACCGACGTCCAGACGGACGCGGACTTGGTGACGCGAGCCCAACGGCCGGTCAAGCGCGTCTCAAGCTCAAAGGGACTCCACGCTCAGGCATTAGAGTACCCATCAGGCGATCGGCGCGACGCATCTAAGAGAACACGATCCACAGAGGACCGAGGACTCCGAGCTCGGGTCTTTCAGCAAGGAAAGACTCCCGAAGGAATACAATGACGCTCAAAGGGGCATACCGCAGCCGGATTAGGGCGCGGTGCAATGCGTTCAACAACTCGATGATTCACGTATAAGTGGTGGACTTGCGCATCACATCACTTTATCGCAATTTGCAACGGTCTTCATCGAATGACGTGCCAAGGGATCCAGCGCTGCCGGTTGTAGAAAGTTTACAACTGGTGTTAGACTCACAACGCGGAACGATCTTTAACGTGTGCCTCCAAAGAGGTAACACAGGCAAGCGACCGTTTAACCTCGGTCAGAGGGGTCGTTTATCCTYGACCAGAGCGCCTTAACGTCCCGAGGACGATGGAGATAGAACGTCAAAGACGATTACTATGATCCTTCCGCAG

Claims (7)

1.一类真菌，其特征在于，该类真菌为胶膜菌属菌株，为Tulasnella sp. GYBQ01，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：M 2020129。
2.根据权利要求1所述真菌，其特征在于，该菌株核苷酸序列中nrDNA ITS序列特征为：GATATGCTTAAGTCTAGCGGGTTGTCCTACCCCAATGAGGTCATGCGTTGTAGTACCGACGTCCAGACGGACGCGGACTTGGTGACGCGAGCCCAACGGCCGGTCAAGCGCGTCTCAAGCTCAAAGGGACTCCACGCTCAGGCATTAGAGTACCCATCAGGCGATCGGCGCGACGCATCTAAGAGAACACGATCCACAGAGGACCGAGGACTCCGAGCTCGGGTCTTTCAGCAAGGAAAGACTCCCGAAGGAATACAATGACGCTCAAAGGGGCATACCGCAGCCGGATTAGGGCGCGGTGCAATGCGTTCAACAACTCGATGATTCACGTATAAGTGGTGGACTTGCGCATCACATCACTTTATCGCAATTTGCAACGGTCTTCATCGAATGACGTGCCAAGGGATCCAGCGCTGCCGGTTGTAGAAAGTTTACAACTGGTGTTAGACTCACAACGCGGAACGATCTTTAACGTGTGCCTCCAAAGAGGTAACACAGGCAAGCGACCGTTTAACCTCGGTCAGAGGGGTCGTTTATCCTYGACCAGAGCGCCTTAACGTCCCGAGGACGATGGAGATAGAACGTCAAAGACGATTACTATGATCCTTCCGCAG。
3.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于：所述的胶膜菌属菌株在PDA平板上培养7天其菌落呈白色，表面覆盖柔毛，多气生菌丝，规则圆形发散生长；在25±2 ℃条件下真菌培养箱内培养14天，取插片按常规制片方法制片，光学显微镜下观察，菌丝具隔膜，粗2.5～5.5μm，分枝近直角，分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象。
4.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于：包括促进白旗兜兰(Paphiopedilum spicerianum)种子萌发形成幼苗中的应用。
5.根据权利要求1至4任一所述的真菌，其特征在于：该真菌菌株的分离获得及分子生物学鉴定方法步骤为：
1-迁地共生萌发原球茎的诱导
(1) 采集白旗兜兰原生境基质带回实验室，将基质放在塑料饭盒内，覆盖尼龙网布，使网布与基质紧密相连；
(2) 将储存在-20℃中的白旗兜兰种子取出，放在室温下10个小时，使种子温度恢复至室温；取少量种子于烧杯中，加入1 g·L-1的无菌琼脂悬浮液中充分摇匀，制成种子悬浮液；
(3) 用5000mL移液枪吸取5mL悬浮液播种在尼龙网布上，盖好一次性塑料饭盒盖子，在人工培养箱内25 ± 2℃条件下；黑暗培养60天，60天后进行光照培养；光周期为12/12 hL/D，每隔两周观察种子萌发情况，保持塑料盒内基质的湿度；
(4) 60天后，观察到白旗兜兰种子萌发形成白色原球茎，收集原球茎用于后续的分菌实验；
2-胶膜菌属GYBQ01菌株的分离
(1)原球茎的来源：白旗兜兰种子迁地共生萌发实验获得共生萌发形成的白旗兜兰原球茎；
(2)原球茎内共生真菌的诱导、分离纯化及保存：取出萌发的原球茎，放入盛有1%次氯酸钠溶液的灭菌烧杯中，轻轻摇动烧杯，5 min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌水冲洗3～4次；在超净工作台上，用无菌刀片将原球茎切成两半，置于PDA培养基中25°C培养箱培养；待在原球茎伤口处长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，得纯菌落；
(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存；将配制好的适量PDA培养基倒入规格为18 × 20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的 1/3；硅胶塞后，放入高压灭菌锅内121°C灭菌20 min；灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用；在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注明菌种、编号、日期；将接种后的试管置于人工气候箱内25 ± 2°C培养；待菌丝要长满PDA斜面时，将试管取出存入4°C冰箱内保存；分离得到的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心；
3-胶膜菌属GYBQ01菌株的鉴定
(1)将胶膜菌属真菌GYBQ01菌株的nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI，http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其Genbank号为：MN733451；对其进行BLAST比对，鉴定结果表明该菌株与JX545225.1真菌Tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到99.84%，所述的胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01具有以下微生物学特征：
①形态学特征
胶膜菌属菌株在PDA平板上培养7天其菌落呈白色，表面覆盖柔毛，多气生菌丝，规则圆形发散生长；
②生理生化特性
观察菌株显微形态特征使用盖玻片插片培养法，在25±2 ℃条件下真菌培养箱内培养14天，取插片按常规制片方法制片；光学显微镜下观察，菌丝具隔膜，粗2.5～5.5μm，分枝近直角，分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象；
所述的分子生物学鉴定涉及的真菌总DNA提取采用CTAB法；PCR扩增所用引物为真菌通用引物ITS4和ITS5；PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。
6.根据权利要求5所述的真菌，其特征在于：步骤2-胶膜菌属GYBQ01菌株的分离中，检测分离到的真菌是否对白旗兜兰种子萌发阶段有促进效果的方法：
（1）配制共生萌发培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4 g·L-1燕麦和8g·L-1琼脂，培养基pH为5.6~5.8；
（2）将胶膜菌属真菌菌株Tulasnellasp. GYBQ01取出，接种在PDA培养基上，置于人工气候箱内，在温度为25 ± 2℃培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生萌发菌株；
（3）将消毒灭菌预处理的白旗兜兰种子加入到1 g·L-1的无菌琼脂悬浮液中混合均匀得到种子悬浮液，再将种子悬浮液均匀的播撒在燕麦琼脂培养基的培养皿中；
（4）将共生萌发菌株接种至燕麦琼脂培养基的培养皿中，再置于人工气候箱内，在温度为25 ± 2°C条件下恒温培养，前60天在黑暗条件下培养，后60d在光照强度为2000-3000Lx、光周期12h/12h L/D条件下培养；
（5）种子萌发情况检测和数据统计分析：统计4个阶段，即种子未萌发、种子萌发：种胚膨大并产生根状物、原球茎形成和发育：种胚膨大突破种皮至出现原生分生组织、幼苗分化和发育阶段：长出第一片叶片及后续生长的量；
按以上分级标准统计每组实验不同处理的种子萌发数量(g)，原球茎数量(p)和幼苗的数量(s)，并根据播种的种子总数(t)，SE为标准误；
计算种子萌发率G = mean (g + p + s)/t ± SE，
原球茎形成率P = mean (p + s)/t ± SE，
幼苗形成率S = mean s/t ± SE；
利用非参数检验方法Kruskal-Wallis test (KW)和 Mann- Whitney U – test (U)对不同处理的种子萌发率、形成原球茎比率及幼苗率进行显著性检验，α = 0.05 。
7.根据权利要求6所述的真菌，其特征在于：所述步骤(3)消毒灭菌预处理方法具体为，在-20℃种子保存库中的种子取出，放在室温下10h，使种子温度恢复至室温；将种子放在纸质的种子包内，用订书钉将纸袋封好；将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5~10min，轻轻的挤压出气泡；用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液及一滴洗涤剂的烧杯中，轻轻搅拌或摇动烧杯；10min后，将纸袋移至超净工作台，用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，轻轻摇动；重复冲洗种子3~4次，轻轻挤压出纸袋内多余的水，用无菌剪刀剪开纸袋获得灭菌种子。
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