CN106554934A - 高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法，利用三角瓶能有效阻隔普通微生物的特性，采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，制备培养高质量的香蕉枯萎病菌分生孢子，制备培养方法步骤如下：1)将普通三角瓶洁净备用；2)用马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，制备三角瓶式培养基；3)将香蕉枯萎病菌植入瓶式培养基；4)在合适温度条件下产孢培养；5)用无菌水洗脱收集分生孢子。本发明的优点是：1)获得的分生孢子液成品含菌丝体、培养基、及菌体代谢外泌产物等较少；2)三角瓶配上常规瓶塞后，能阻隔普通微生物的通过，很好地保护三角瓶内不受杂菌污染，获得高质量的孢子成品；3)三角瓶内收集孢子比培养皿内收集孢子的操作更为方便；三角瓶的保护可使得产孢菌落能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要孢子的工作程序衔接。

Description

高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法。

背景技术

香蕉枯萎病是香蕉上的重大病害，可给香蕉生产造成毁灭性的重大损失，该病害由香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)侵染造成。分生孢子是香蕉枯萎病菌的无性繁殖体，在香蕉枯萎病的病害循环和病害流行中发挥重大作用。在实验室内，分生孢子也是香蕉枯萎病研究不可缺少的材料。有关孢子的形成发育生理、对不良环境的生存适应性或抵抗性，孢子与寄主的识别互作反应等研究，都需要使用孢子形态的材料；新型防治药物研发方面的有关研究，如药剂对孢子的致毒效应等，也需要孢子；分子生物学领域的有关研究，如致病相关基因的诱变、定位与克隆等；也离不开孢子；可见，分生孢子是香蕉枯萎病日常研究的重要菌体形态。而且在许多工作中，往往要求研究所用的分生孢子要达到没有杂菌污染的状态。

在实验室工作中，由于香蕉枯萎病菌在液体培养基中，通过振荡培养能获得大量的分生孢子，因而长期以来，许多文献报道公开的孢子制备方法均使用液体培养方法。但该方法有一个弊病，就是培养产物混合液中包含有较多的培养基组分、菌体代谢产物和菌丝体等，要获得较为单纯的孢子液，往往需要滤掉菌丝、离心沉淀及洗涤孢子等颇有难度的技术处理，另外，该方法需要有振荡培养设备的支持。

在固体培养基上，香蕉枯萎病菌也可形成分生孢子。由于从固体培养收集获得的孢子成品，含有较少的培养基组分、菌体代谢产物和菌丝体等，因而对某些需要减少培养基组分和菌体代谢产物干扰的试验来说，固体培养则显示出其优越性。实验室固体培养的常规方法是，在普通培养皿内的培养基平板上制备培养分生孢子。

一般实验室使用的培养皿由皿底和皿盖组成，限于当前培养皿的制作工艺技术，皿底与皿盖间很难达到均匀贴合的程度，大多数培养皿的皿底与皿盖间存在较大缝隙，培养皿内外的空气流动可畅通无阻。因此，利用普通培养皿培养制备的分生孢子容易受外界污染空气的干扰，容易得到带有杂菌污染状态的孢子成品。尤其是一般的植物病理学实验室，当前均偏好于配置具有降温/升温功能的培养箱，该类培养箱通常为了实现工作室内快速恒温及温度均匀分布状态，往往将工作室设计为循环空气的模式。利用这类培养箱进行的产孢培养，培养皿周围空气处于常流动状态，造成培养皿内材料污染的机率相当高，通常培养7天可造成50％以上的培养平板被杂菌污染，即使一些培养平板上看不到明显的青霉菌等实验室污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染情况仍然存在。因此，利用培养皿培养制备香蕉枯萎病菌分生孢子，在技术上很难排除污染的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养方法的步骤如下：

1.采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。

2.瓶式培养基的制备：用马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将培养基分装于步骤1准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用。

3.香蕉枯萎病的移植：用移植工具将实验室常备的香蕉枯萎病菌菌丝体，移植入步骤2制备的瓶式培养基上。

4.培养产孢：将步骤3操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；通常培养5天后，瓶式培养基面上已形成菌丝密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。

5.分生孢子的收集：用无菌水洗脱步骤4获得菌落上的孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的香蕉枯萎病菌分生孢子液。

本发明的优点是：

1)获得的分生孢子液成品含菌丝体、培养基、及菌体代谢外泌产物等较少。

2)三角瓶配上常规瓶塞后，能阻隔普通微生物的通过，很好地保护三角瓶内不受杂菌污染，获得高质量的孢子成品。

3)三角瓶内收集孢子比培养皿内收集孢子的操作更为方便。

4)三角瓶的保护可使得产孢菌落能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要孢子的工作程序衔接。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

本发明的关键技术是三角瓶与琼脂类培养基的结合与应用。

三角瓶虽然属植物病理学实验室的日常器具，但其常规用途主要是装盛培养基灭菌；也常见用于装盛液体培养基、或植物组织类培养基(如籽粒、秸杆等)进行病原菌培养。

琼脂类培养基的应用，现有的技术规范都是使用培养皿作培养器具，将琼脂培养基加热熔化后，倒入培养皿制成培养基平板，并在该培养平板上培养病原菌。

香蕉枯萎病菌分生孢子在琼脂培养基上的制备培养，均为应用常规的技术规范，即利用培养皿结合琼脂类培养基的培养技术进行制备培养；至今还未见有利用三角瓶作培养器具，在琼脂类培养基上进行香蕉枯萎病菌产孢培养的孢子制备技术。可能原因是对培养皿的长期依赖及习惯沿用，以及通常认为病原菌产孢需要通气性良好的环境条件，而培养皿恰好能满足良好的通气性。

普通三角瓶套上瓶塞后，虽然形成通气性较差的封闭环境，但发明人反复试验发现，香蕉枯萎病菌能在该较为封闭的环境内的琼脂培养基上形成分生孢子；而三角瓶的应用，则正好解决应用培养皿容易导致污染的重大技术问题。

香蕉枯萎病菌可在许多琼脂类培养基上生长并形成分生孢子，本发明所述的产孢培养基是实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基，其组分为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；按常规方法煮配。培养基煮配完毕后，可直接分装到三角瓶中；由于三角瓶底部多属曲面状态，培养基量过少会造成瓶底局部无培养基或培养基过薄，培养基过多则容易造成浪费；通常每瓶(250mL规格)装入20～30mL培养基为宜，其它规格的三角瓶酌情增减液量。

套好瓶塞后，常规高压高温灭菌，灭菌后取出三角瓶平置于平直的桌面上，冷却后形成瓶式培养基。

瓶式培养基也可以用另一种方法分装，先用较大的三角瓶按常规方式装入液量较多的培养基进行灭菌；再如同倒培养皿平板一样，使用前加热熔化后，分装到灭菌的空白三角瓶内。

香蕉枯萎病菌的移植可按常规方式移植，用普通菌落上的菌丝体作移植用的母体菌体；为加速培养进程，可在一个瓶式培养基上植入多块菌丝块。

产孢培养可在普通培养箱内实施，温度控制在香蕉枯萎病菌生长的适宜温度，本发明培养温度采用28℃；培养过程对光照条件和湿度条件无特别需求。

通常产孢制备培养5天后，三角瓶内培养基面上能形成浓密的气生菌丝和大量分生孢子。

用无菌水收集获得的分生孢子，实际操作可用T形玻棒刷洗菌落，使孢子释放到洗孢水液中。

实施例1

应用本发明高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养香蕉枯萎病菌菌株Fo-1的分生孢子，按如下步骤实施操作：

1.采用250mL三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。

2.瓶式培养基的制备：用马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将培养基分装于步骤1准备的三角瓶，每瓶30mL；常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用。

3.香蕉枯萎病菌的移植：用移植针将实验室常备的香蕉枯萎病菌菌株Fo-1菌丝体，移植入步骤2制备的瓶式培养基上。

4.培养产孢：将步骤3操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；5天后瓶式培养基面上已形成菌丝密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。

5.分生孢子的收集：取无菌水15mL注入步骤4获得的一瓶菌落上，用T形玻棒刷洗菌落的孢子，能获得孢子浓度为46.1×10⁶个/mL、无杂菌污染的较高质量的香蕉枯萎病菌分生孢子液。

实施例2

应用本发明高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养香蕉枯萎病菌菌株Fo-2的分生孢子，按实施例1的步骤1至步骤5操作实施，只是步骤3的菌株是Fo-2；结果用无菌水15mL洗脱一瓶菌落上的孢子，能获得孢子浓度为21.5×10⁶个/mL、无杂菌污染的较高质量的香蕉枯萎病菌分生孢子液。

Claims (1)

1.高效避免污染的香蕉枯萎病菌分生孢子的制备培养方法，其特征在于，制备培养方法的步骤如下：

1)采用普通三角瓶作制备培养分生孢子的器具，将三角瓶洁净备用；

2)瓶式培养基的制备：用马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将培养基分装于步骤1)准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用；

3)香蕉枯萎病菌的移植：用移植工具将实验室常备的香蕉枯萎病菌菌丝体，移植入步骤2制备的瓶式培养基上；

4)培养产孢：将步骤3操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；通常培养5天后，瓶式培养基面上已形成菌丝密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子；

5)分生孢子的收集：用无菌水洗脱步骤4获得菌落上的孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的香蕉枯萎病菌分生孢子液。