CN104342495A - 鉴别分枝虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别分枝虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法。该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该核酸分子探针为FZF：5`-AGCGGTGGGCGAATGA-3`和FZR：5`-ACTTTAGCTGCGGGCG-3`。其鉴别方法是以分枝虫草的ITS rDNA序列基因为模板，以上述核酸分子探针FZF和FZR为PCR引物，按照常规PCR方法进行鉴定。经实验发现，仅分枝虫草能够扩增到特异性片段，而其他虫草样品，如冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草、和蝉花都没有扩增到任何片段，这表明本发明的核酸分子探针FZF和FZR具有极高的专一性，无需测序步骤，可以用于快速的鉴别分枝虫草(菌丝体和子实体)的真伪。
Description
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法鉴别中药材真伪技术领域，具体涉及鉴别分枝虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法。
背景技术：
冬虫夏草(虫草)Ophiocordyceps sinensis是中国名贵中药材，具有保肺肾、补精益髓、化痰止咳的作用，常食可促进消化、调节免疫功能，增强人体抵抗力，市场需求日益增大。但随着人们的过度采集，使得野生虫草资源日益稀缺，几近濒危，产量供不应求，价格大幅上升，形成恶性循环。许多伪品也趁机大量涌入市场，而分枝虫草就被当做伪品之一混入其中。经过研究，分枝虫草Cordyceps ramosa Teng是我国特有的具有药用价值的真菌，它又称分枝团囊虫草、大团囊枒，在分类上隶属于团囊虫草属Elaphocordyceps，主要分布在安徽、福建、甘肃和广东等省区，民间常用于治疗妇科出血症包括崩漏、月经过多、更年期子宫出血、产后恶露不绝和宫内节育器所致子宫出血等。因此，快速、准确的鉴别分枝虫草具有重要的意义。
地球上的每个生物物种均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，是用来鉴定物种或个体的可靠依据。分枝虫草之前的鉴别只局限于形态特征且易受环境和培养条件等诸多因素的影响，难以区分形态差异较小的种类，影响鉴定的准确性。DNA条形码鉴定技术为中药材的物种鉴定研究提供了方便快捷的方法，DNA条形码(DNAbarcoding)是利用短的，标准的DNA序列来鉴定物种的新技术。不同中药材均可方便地提取较为完整的DNA，然后利用引物扩增短的条形码序列来实现中药材的快速准确鉴定。目前，已有用于鉴别部分真菌包括虫草属真菌的核苷酸特征序列获得专利，但尚未发见与分枝虫草相关的分子鉴定方法。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种利用分子生物学手段，从遗传本质上鉴别分枝虫草及其制品真假的特征性核苷酸序列。
本发明的用于鉴别分枝虫草的特征性核苷酸序列来源于分枝虫草的核糖体rDNA内转录间隔区ITS1、ITS2和它们之间的5.8S rDNA基因，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供以分枝虫草的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为基础的，设计用于鉴别分枝虫草的特异性核酸分子探针，该核酸分子探针序列如下：
FZF：5`-AGCGGTGGGCGAATGA-3`；
FZR：5`-ACTTTAGCTGCGGGCG-3`。
上述核酸分子探针序列FZF和FZR，它们的退火温度相近，GC含量相当，均不能形成引物二聚体，具有极高的专一性，仅与分枝虫草发生反应，而不与其他虫草扩增生成PCR条带。利用该探针通过PCR扩增可以快速的对分枝虫草(菌丝体、子实体)进行鉴别。
本发明的第三个目的是提供一种分枝虫草快速鉴定试剂盒，包括核酸分子探针、DNA提取试剂和PCR反应试剂，其特征在于，所述的核酸分子探针序列如下：
FZF：5`-AGCGGTGGGCGAATGA-3`；
FZR：5`-ACTTTAGCTGCGGGCG-3`。
所述的分枝虫草快速鉴定试剂盒优选还包括真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`。该通用引物可以作为鉴定分枝虫草的阳性对照。
本发明的第四个目的是提供一种鉴别分枝虫草的方法，其特征在于，采用上述核酸分子探针FZF和FZR作为特异性扩增引物，以分枝虫草核糖体rDNA的内转录间隔区基因为模板，经PCR扩增，电泳检测，直接获得清晰的分枝虫草特异性条带，无需测序步骤，实现对分枝虫草的鉴别。
优选，利用ITS1和ITS4作为PCR引物，以分枝虫草的ITS rDNA基因或基因组DNA作为模板进行常规的PCR，以作为阳性对照(如图2)。
本发明基于分枝虫草的核糖体rDNA内转录间隔区ITS1、ITS2和它们之间的5.8S rDNA基因，即序列SEQ ID NO.1，设计特异性的核酸分子探针FZF和FZR，并以该核酸分子探针为引物，以分枝虫草的核糖体rDNA的内转录间隔区基因为模板，按照常规PCR方法进行扩增，获得的DNA片段，经测序其具体序列为序列SEQ ID NO.1中第192～530位碱基所示，长度为339bp(如图1)。利用本发明的核酸分子探针FZF和FZR进行PCR扩增，仅分枝虫草能够扩增获得该特异性片段，而其他样品没有扩增到任何片段(如图3)，这表明本发明的核酸分子探针FZF和FZR具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别分枝虫草(子实体和菌丝体)的真伪。
本发明采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅20mg就足够，方法简单，特异性好，用时短，半日即可完成。
附图说明：
图1是本发明所述的分枝虫草专一性核酸分子探针FZF和FZR扩增的片段序列，左侧为5`端，右侧为3`端，其中黑色部分为专一性核酸分子探针FZF和FZR扩增的片段大小及位置。
图2是利用ITS1和ITS4作为引物按照常规的PCR方法对不同虫草样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、冬虫夏草，2、蛹虫草，3、广东虫草，4、蝉花，5、分枝虫草，M为2Kb的DNA分子量标准。
图3是利用本发明的核酸分子探针FZF和FZR作为引物按照常规的PCR方法对不同虫草样品核糖体rDNA的内转录间隔区基因进行PCR的产物的电泳图，1、冬虫夏草，2、蛹虫草，3、广东虫草，4、蝉花，5、分枝虫草，M为2Kb的DNA分子量标准。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
分枝虫草基因组DNA的提取和ITS rDNA基因的获得
取20mg分枝虫草样品置于无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，选用DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(真菌)，货号13122749Y]提取分枝虫草DNA。冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草、蝉花的基因组DNA参照上述方法提取。
取真菌ITS rDNA通用引物ITS1和ITS4，ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用PCR Master Mix试剂盒[Thermo Scientific公司的Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)货号：00139170]，进行PCR反应。总反应体系为50.0μL，PCR Master Mix 20.0μL、ddH2O27.0μL、ITS1(10μmol/L)1.0μL、ITS4(10μmol/L)1.0μL、模板DNA(冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草、蝉花、分枝虫草的基因组DNA)1.0μL。反应程序为94℃5min预变性、94℃30s、55℃30s、72℃90s、35个循环，72℃8min。分枝虫草的ITS rDNA序列电泳图如图2所示。由图2可以看出，利用通用引物ITS1和ITS4可以从冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草、蝉花、分枝虫草的基因组DNA中扩增出序列(ITS rDNA基因)。
实施例2：
分枝虫草特异性引物的PCR扩增
根据分枝虫草的核糖体rDNA内转录间隔区ITS1、ITS2和它们之间的5.8S rDNA基因序列设计特异性引物FZF和FZR，FZF：5`-AGCGGTGGGCGAATGA-3`和FZR：5`-ACTTTAGCTGCGGGCG-3`。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以不同虫草样品的ITS rDNA序列基因为模板，总反应体系为50.0μL，PCR Master Mix 20.0μL、ddH2O27.0μL、FZF(10μmol/L)1.0μL、FZR(10μmol/L)1.0μL、模板DNA(冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草、蝉花、分枝虫草的ITS rDNA基因)1.0μL。反应程序为94℃3min预变性、94℃30s、60℃30s、72℃30s、35个循环，72℃8min。电泳检测PCR结果，电泳图如图3所示，从图3可以看出，仅分枝虫草能够扩增出特异性片段，而冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草、蝉花没有扩增出任何片段，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的专一性，特异性好，因此可以用于快速的鉴别分枝虫草。将分枝虫草的特异性片段送去测序，其序列如SEQ ID NO.1中第192至530位碱基所示，片段长度为339bp(如图1)。
Claims (6)
1.一种用于鉴别分枝虫草(Cordyceps ramosa Teng)的特征性核苷酸序列，其特征在于，该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于鉴别分枝虫草的核酸分子探针，其特征在于，该核酸分子探针为：
FZF：5`-AGCGGTGGGCGAATGA-3`；
FZR：5`-ACTTTAGCTGCGGGCG-3`。
3.一种分枝虫草快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸分子探针序列FZF和FZR，以及DNA提取试剂和PCR反应试剂。
4.根据权利要求3所述的分枝虫草快速鉴定试剂盒，其特征在于，还包括虫草属真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`和ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`。
5.一种鉴别分枝虫草的方法，其特征在于，是采用权利要求2所述的核酸分子探针FZF和FZR作为PCR引物，利用PCR方法鉴定分枝虫草，具体步骤按常规PCR方法进行。
6.根据权利要求5所述的鉴别分枝虫草的方法，其特征在于，还利用ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`和ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`作为PCR引物，以分枝虫草的ITS rDNA基因或基因组DNA作为模板进行常规的PCR，以作为阳性对照。
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