CN102776292A

CN102776292A - 鉴别毛蜂窝菌（龙眼梳）的特征性核苷酸序列及其探针和方法

Info

Publication number: CN102776292A
Application number: CN2012102925027A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 谭国慧; 章卫民; 李浩华; 潘清灵; 陈玉婵; 陶美华
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2012-08-15
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-08-15
Also published as: CN102776292B

Abstract

本发明公开了一种鉴别毛蜂窝菌（龙眼梳）的特征性核苷酸序列及其探针和方法。所述的用于鉴定毛蜂窝菌（Hexagonia apiaria）的特征性核苷酸序列来自毛蜂窝菌核糖体rRNA内转录间隔区，其序列如SEQ ID NO.1所示。以此特征性核苷酸序列为基础设计的核苷酸分子探针Probe I（如SEQ ID NO.2所示）和Probe II（如SEQ ID NO.3所示），以及包含该核酸分子探针的鉴定试剂盒，以及利用该探针通过PCR鉴别毛蜂窝菌的方法。利用本发明，可以方便、快速、准确的进行毛蜂窝菌及相关制品的快速鉴定，本发明使用分子生物学手段排除了鉴定中的人为影响、鉴定结果客观准确，鉴定时间短，半天即可完成。

Description

鉴别毛蜂窝菌(龙眼梳)的特征性核苷酸序列及其探针和方法

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域，具体涉及用于鉴别毛蜂窝菌（即龙眼梳，Hexagonia apiaria）的特征性核苷酸序列以及核苷酸分子探针和鉴别毛蜂窝菌的方法。

背景技术：

毛蜂窝菌[Hexagonia apiaria(Pers.)Fr.]，又名龙眼梳，隶属于非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科（Polyporaceae）、蜂窝菌属（Hexagonia），子实体在腐木上侧生，无柄，扁平，平展至平展反卷，肾形至近半圆形，韧木栓质，菌盖长5～11.5cm，宽4～6cm，厚0.7～1.5cm，黄褐色至灰黑色，被分枝或不分枝的黑色硬粗毛，老熟后部分易脱落，具环纹和辐射状皱纹，边缘薄而锐。菌管表面灰白色、淡黄褐色至赤褐色；菌孔幼时六角形，管口呈蜂窝状，直径1～4mm，孔内灰白色，成熟后不规则形；菌肉棕褐色至锈褐色，厚0.2～0.4mm。在我国主要分布于广东、海南、广西、四川、贵州、云南、福建、台湾、香港等地区。毛蜂窝菌是一种珍稀的药用真菌，据《中华本草》记载，毛蜂窝菌微苦、涩、微温，具理气止痛、健胃之功效。中医上常利用毛蜂窝菌子实体干品10～12克煎汤温服治疗胃病、也有与裂蹄菌、桦褐孔菌、灵芝等混合，加工成超微粉，用温水冲服辅助治疗胃癌；中医上还有用毛蜂窝菌子实体水煎服用治疗慢性肾炎；在广东民间，曾有肾结石患者煎服毛蜂窝菌子实体有排石效果的案例。

毛蜂窝菌在药用及保健方面的开发利用具有广阔前景，但在自然界，由于受生长环境和季节等条件的限制，野生资源较为稀有，不易获得，且采收的成本较高，品质参差不齐，同时也常常发生将灵芝、桑黄、拟层孔菌等木生真菌当作毛蜂窝菌的现象，不利于毛蜂窝菌作为医药保健品的开发和利用。近年来，毛蜂窝菌的人工栽培已获成功，同时带动了毛蜂窝野生资源的开发利用。

DNA是生物储存遗传信息的物质，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，可以作为该生物物种或个体区别于其他物种或个体的标志。DNA是细胞生物的基本组成部分，作为遗传信息的载体，具有一定的稳定性，不会受表型的影响而改变，是用来鉴别物种、个体的可靠依据，特别对于原料检测等已无法进行形态鉴定的情况特别有效。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核苷酸序列，利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、准确的对物种或个体进行鉴别。目前，未见与毛蜂窝菌相关的核苷酸特征性序列的专利。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供来源于毛蜂窝菌（Hexagonia apiaria）核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因，用于鉴别毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的利用分子生物学手段鉴别毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列来源于毛蜂窝菌核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因（核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因合并简称ITS区），其序列如SEQ ID NO.1所示，所在位置以及特征见图1，该序列包含毛蜂窝菌的ITS1、5.8S rDNA以及ITS2的序列。该序列可通过实施例1所述的方法获得，亦可通过人工合成的方法在商业化的DNA合成仪器上按照发明人提供的核苷酸序列合成。

本发明以上述毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列（如SEQ ID NO.1所示）为模板而设计得到全长序列或不少于16个核苷酸组成的寡核苷酸序列，以及在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上经修饰、加工、变化而获得核苷酸序列，也包括在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上在5’端添加或改变10个核苷酸以下或改变原有核苷酸序列数量小于10%以及3’端6个核苷酸改变不足1个核苷酸的核苷酸序列作为毛蜂窝菌鉴定的专一性核苷酸分子探针。上述序列可通过DNA自动合成仪等DNA合成装置按照设计好的顺序合成而获得，并可以通过酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等方式进行标记。

本发明的第二个目的是提供一种针对上述ITS区的如SEQ ID NO.1所示的序列的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针，其特征在于，该毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针包括Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’（序列如SEQ ID NO.2所示）和Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’（序列如SEQ ID NO.3所示）。Probe I、Probe II的具体位置见图2，这些序列样适用于上述修饰、加工与变化、添加酶切位点、改变部分核苷酸序列以及标记等操作。

本发明提供的上述毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针：Probe I和Probe II具有极高的专一性，可以与毛蜂窝菌发生专一性的反应而不与其他种类的真菌发生反应。利用上述探针通过PCR的方法或核酸杂交的方法可以快速的对毛蜂窝菌的菌丝体、子实体及其相关制品进行检测，从而快速鉴别毛蜂窝菌。

本发明的第三个目的是提供一种用于鉴别毛蜂窝菌的试剂盒，包括核酸分子探针和常规的PCR反应试剂，其特征在于，所述的核酸分子探针为毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针，具体为：Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’（序列如SEQ ID NO.2所示）和Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’（序列如SEQ ID NO.3所示）。

所述的用于鉴别毛蜂窝菌的试剂盒，优选还含有真菌核糖体rRNA内转录间隔区通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（序列如SEQ ID NO.4所示）和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3（序列如SEQ ID NO.5所示）。以此引物对的扩增产物作为阳性对照。

本发明的第四个目的是提供一种用于鉴别毛蜂窝菌的方法，其特征在于，是以毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针：Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’（序列如SEQ ID NO.2所示）和Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’（序列如SEQ ID NO.3所示）作为引物，利用PCR的方法鉴定毛蜂窝菌。

所述的PCR的方法鉴定毛蜂窝菌，优选以真菌核糖体rRNA内转录间隔区通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（序列如SEQ ID NO.4所示）和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3（序列如SEQ ID NO.5所示）的扩增产物作为阳性对照。

本发明还提供了另外一种用于鉴别毛蜂窝菌的方法，其特征在于，是以Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’、ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’作为引物；或以Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’、ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’作为引物；在同一管中进行PCR，根据扩增产物条带鉴定毛蜂窝菌。

PCR方法1：采用前面所述的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针Probe I及Probe II作为一组PCR引物，以如前所述真菌ITS区通用引物ITS1及ITS4作为阳性对照组的PCR引物，分别利用上述两组引物按照常规的PCR方法扩增待测样品，两者均能扩增到特异性DNA片段的样品即为毛蜂窝菌，其中利用Probe I及Probe II获得的DNA片断长为293bp左右，利用ITS1及ITS4获得的DNA片断长为600bp左右。仅真菌ITS通用引物ITS1及ITS4能够得到特异性片段而本发明提供的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针组成的PCR引物Probe I及Probe II不能扩增到特异性DNA片段的样品则不是毛蜂窝菌样品。不能扩增到任何条带的样品，其总DNA不满足分子鉴定的要求。其中，PCR反应可以按照常规的分子生物学方法提取的毛蜂窝菌样品总DNA作为模板，也可以直接挑取少量的毛蜂窝菌样品加入PCR反应体系作为模板。

PCR方法2：采用前面所述的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针Probe I及如前所述真菌ITS区通用引物ITS1及ITS4作为PCR引物，在同一管中利用PCR方法扩增待测样品，能扩增到两条特异性DNA片段的样品即为毛蜂窝菌，其中两条DNA片断长分别为500bp左右及600bp左右。仅能扩增到一条特异性DNA片段的样品则不是毛蜂窝菌样品。不能增到任何条带的样品，其总DNA不满足分子鉴定的要求。其中，PCR反应可以按照常规的分子生物学方法提取的毛蜂窝菌样品总DNA作为模板，也可以直接挑取少量的毛蜂窝菌样品加入PCR反应体系作为模板。

PCR方法3：采用前面所述的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针Probe II及如前所述真菌ITS区通用引物ITS1及ITS4作为PCR引物，在同一管中利用PCR方法扩增待测样品，能扩增到两条特异性DNA片段的样品即为毛蜂窝菌，其中两条DNA片断长分别为400bp左右及600bp左右。仅能扩增到一条特异性DNA片段的样品则不是毛蜂窝菌样品。不能扩增到任何条带的样品，其总DNA不满足分子鉴定的要求。其中，PCR反应可以按照常规的分子生物学方法提取的毛蜂窝菌样品总DNA作为模板，也可以直接挑取少量的毛蜂窝菌样品加入PCR反应体系作为模板。

本发明的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针：Probe I和Probe II具有极高的专一性，可以与毛蜂窝菌发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。利用上述探针通过PCR的方法或核酸杂交或荧光定量PCR的方法可以快速的对毛蜂窝菌及其相关制品进行检测。本发明由于采用DNA序列作为检测标记，因此可以准确、快速的检测未知样品是否为或含有毛蜂窝菌，其中样品可以为子实体、其粉碎加工产品及包含有毛蜂窝菌的中成药制剂、保健品。采用PCR方法检测时，所需样品量极少，方法简单，半天内可完成检测。

附图说明：

图1是核糖体rRNA基因结构示意图，其中标示为ITS区的范围为本发明涉及的DNA序列，即核糖体rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8S rRNA基因；

图2是本发明所述的毛蜂窝菌特征性核苷酸序列全序列以及毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针Probe I、Probe II的位置图，该图显示ITS区正链序列，左侧为5’端，右侧为3’端，其中下划线部分分别为Probe I（位于正链上）、Probe II（位于负链上）；

图3是实施例3中的PCR反应结果示意图，其中1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌；M为DNA分子量标准。

图4是实施例4中的PCR反应结果示意图，其中1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌；M为DNA分子量标准。

图5是实施例5中的PCR反应结果示意图，其中1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌；M为DNA分子量标准。

图6是实施例6中的PCR反应结果示意图，其中1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌；M为DNA分子量标准。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

鉴别毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列（rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因）的制备

取毛蜂窝菌样品0.1-0.5g，液氮中研磨成粉，加入300μL尿素提取液（SDS 1.5%，尿素7mol/L，Tris-HCl pH8.0 0.05mol/L，NaCl 0.5mol/L），移入1.5mL微型离心管中，在液氮中冷却，迅速移到65℃融化。反复冻融3~5次后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，震荡，13000r/min离心10min，上清移入新管中加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，震荡，13000r/min离心10min，上清移入新管中加入微量Rnase A，37℃保温30min，加入3倍体积无水乙醇，3M NaAc(pH5.2)，-20℃放置至少30min后，13000rpm离心15min，回收DNA沉淀，用70%乙醇和无水乙醇洗涤，抽干或风干，每管加入50μL TE(100mmol/L Tris-Cl,10mmol/LEDTA,pH8.0)回溶，获得毛蜂窝菌的总DNA。

取0.2ml PCR管一支，加入20μL PCR反应液(包括10xPCR缓冲液2μL，引物ITS1、ITS4各40ng，2mmol/L dNTP 1μL，Taq酶1个单位，加超纯水至20μL)，加入0.5μL毛蜂窝菌总DNA提取液，闭紧管盖，置于PCR仪上按以下程序进行PCR反应： 94°C预变性3min，然后93°C变性1min，50°C复性1min，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸10min。反应完成后利用商业化的纯化试剂盒进行产物的纯化并直接在DNA测序仪上测序。获得核苷酸序列即为鉴别毛蜂窝菌的特征性核苷酸序列（rRNA内转录间隔区ITS1、ITS2以及5.8SrRNA基因，图1），其序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：

毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针(引物)Probe I，Probe II的制备

将毛蜂窝菌的ITS区序列与其他真菌的同源序列进行比较，获得最适于鉴别毛蜂窝菌寡核苷酸片段组成与排列顺序，即Probe I（如SEQ ID NO.2所示），Probe II（如SEQ ID NO.3所示）。如图2所示，Probe I位于正链上；Probe II位于负链上。根据Probe I，Probe II的核苷酸排列和组成可以在商业化的DNA合成仪上通过化学合成的方法合成，即可用作毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针(引物)。再此基础上，可以利用常规的分子生物学方法利用酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等对Probe I及Probe II进行标记，即可用做杂交用探针。

实施例3：

鉴定毛蜂窝菌的正对照试验

本试验用以确定DNA样品符合PCR要求可获得特异性PCR产物。

方法1：总DNA提取参照实施例1进行，对不同的样品（日本平芝，牛樟芝，有柄灵芝，拟层孔菌，桑黄及毛蜂窝菌）分别提取DNA，再进行PCR扩增，各个样品的PCR反应体系为：20μL PCR反应液(包括10xPCR缓冲液2μL，引物ITS1、ITS4各40ng，2mmol/L dNTP 1μL，Taq酶1个单位，加超纯水至20μL)，加入0.5μL各个样品的总DNA提取液，闭紧管盖，置于PCR仪上按以下程序进行PCR反应： 94°C预变性3min，然后93°C变性1min，50°C复性1min，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸10min。扩增的产物在1%的含有DNA染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的紫外光源下查看以及拍照。

方法2：用牙签直接挑取适量的各个样品（粉碎子实体、粉碎的相关制品）（日本平芝，牛樟芝，有柄灵芝，拟层孔菌，桑黄及毛蜂窝菌）在装20μL超纯水的0.2mL PCR管中搅动，并分别稀至0.1倍以及0.01倍，取2μL上述三个浓度的样品悬浊液加入含有20μL PCR反应液(包括10xPCR缓冲液2μL，引物ITS1、ITS4各40ng，2mmol/L dNTP 1μL，Taq酶1个单位，加超纯水至20μL)的0.2m L PCR管中，充分混匀闭紧管盖，全部PCR管置于PCR仪上进行如下PCR反应：94°C预变性3min，然后93°C变性1min，50°C复性1min，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸10min。扩增的产物在1%的含有DNA着色剂的琼脂糖凝胶上进行电泳，在适当的紫外光源下查看以及拍照。

图3为按方法1进行的实验结果，显示六种真菌（1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌）均可正常的扩增得到ITS区DNA特异性片段，该结果表明待测真菌提取的总DNA符合PCR扩增的要求，可以用作专一性检测的待测样品。

实施例4：

毛蜂窝菌专一性鉴别：利用Probe I及Probe II作为引物。

用以从符合PCR要求的样品中专一性的扩增毛蜂窝菌，从而鉴别毛蜂窝菌。

方法1：使用实施例3方法1中符合PCR反应要求的样品，以这些样品的总DNA作为模板，参照实施例1中方法进行PCR扩增，其中引物替换为Probe I及Probe II。

方法2：使用实施例3方法2中符合PCR反应要求的样品悬浊液，如实施例3中方法2所述进行PCR反应，其中引物替换为Probe I及Probe II。

图4为按方法1进行的实验结果，显示六种真菌（1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌）中仅毛蜂窝菌被专一性的扩增获得300bp左右的特异性DNA片段，而其他真菌均无特异性DNA片段被扩增，该结果表明，毛蜂窝菌专一性核苷酸探针(引物)Probe I及Probe II可以从多种真菌中准确的鉴别出毛蜂窝菌，同时根据实施例3排除了假阴性（不符合PCR扩增条件而造成的阴性结果）的可能。

实施例5：

毛蜂窝菌专一性鉴别：利用Probe I及ITS1、ITS4作为引物。

用以直接在样品中专一性的扩增毛蜂窝菌，同时评价总DNA质量，从而鉴别毛蜂窝菌。

方法1：参照实施例3方法1所述方法进行总DNA提取及PCR扩增，不同之处在于20μLPCR反应液还包含引物Probe I 4 ng。

方法2：参照实施例3方法2所述方法进行PCR反应，不同之处在于20μL PCR反应液还包含引物Probe I 4 ng。

图5为按方法1进行的实验结果，显示六种真菌（1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌）中仅毛蜂窝菌扩增获得500bp左右及600bp左右两条特异性DNA片段，而其他真菌均获得一条600bp左右特异性DNA片段，该结果表明，毛蜂窝菌专一性核苷酸探针(引物)Probe I及真菌通用引物ITS1、ITS4同时作为引物时，可以从多种真菌中准确的鉴别出毛蜂窝菌，同时排除了假阴性（不符合PCR扩增条件而造成的阴性结果）的可能。

实施例6：

毛蜂窝菌专一性鉴别：利用Probe II及ITS1、ITS4作为引物。

方法1：参照实施例3方法1所述方法进行总DNA提取及PCR扩增，不同之处在于20μLPCR反应液还包含引物Probe II 4 ng。

方法2：参照实施例3方法2所述方法进行PCR反应，不同之处在于20μL PCR反应液还包含引物Probe II 4 ng。

图6为按方法1进行的实验结果，显示六种真菌（1为日本平芝；2为牛樟芝；3为有柄灵芝；4为拟层孔菌；5为桑黄；6为毛蜂窝菌）中仅毛蜂窝菌扩增获得400bp左右及600bp左右两条特异性DNA片段，而其他真菌均获得一条600bp左右特异性DNA片段，该结果表明，毛蜂窝菌专一性核苷酸探针(引物)Probe II及真菌通用引物ITS1、ITS4同时作为引物时，可以从多种真菌中准确的鉴别出毛蜂窝菌，同时排除了假阴性（不符合PCR扩增条件而造成的阴性结果）的可能。

Claims

1.一种用于鉴别毛蜂窝菌（Hexagonia apiaria）的特征性核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于鉴别毛蜂窝菌的专一性核苷酸分子探针，其特征在于，该毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针包括Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’和Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’。

3.一种用于鉴别毛蜂窝菌的试剂盒，包括核酸分子探针和常规PCR反应试剂，其特征在于，所述的核酸分子探针为权利要求2所述的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’和Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有真菌核糖体rRNA内转录间隔区通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

5.一种用于鉴别毛蜂窝菌的方法，其特征在于，是以权利要求2所述的毛蜂窝菌专一性核苷酸分子探针：Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’和Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’作为引物，利用PCR的方法鉴定毛蜂窝菌。

6.根据权利要求5所述的用于鉴别毛蜂窝菌的方法，其特征在于，所述的用PCR的方法鉴定毛蜂窝菌，还以真菌核糖体rRNA内转录间隔区通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’的扩增产物作为阳性对照。

7.一种用于鉴别毛蜂窝菌的方法，其特征在于，是以Probe I：5’-ACTTCACTGTCCGAGGCGTTACTG-3’、ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’作为引物；或以Probe II：5’-TCCAACCCTACAAAACCGCAAAAA-3’、ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’作为引物，在同一管中进行PCR，根据扩增产物条带鉴定毛蜂窝菌。