CN113912751A - 一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法 - Google Patents

一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法，属于食用菌提取技术领域。本发明采用水提取灵芝孢子粉中多糖，水提物的单糖组成主要以葡萄糖、半乳糖和甘露糖为主，然后采用乙醇进行分级醇沉，通过一级醇沉得到的50～70％醇沉组分(分子量为106～104Da的组分)的单糖组成主要为葡萄糖，通过二级醇沉得到的80～85％醇沉组分(分子量为104～103Da的组分)主要是葡萄糖和半乳糖，且85％部分中半乳糖比重较高。本发明通过调控乙醇浓度，除去水提物中葡萄糖为主的部分，使富含半乳糖的组分得到富集，从而得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖，半乳糖的含量约为50％。

Description

一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及食用菌提取技术领域，尤其涉及一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)为多孔菌科灵芝属真菌，是我国的一种名贵中药材，具有抗肿瘤、增强免疫功能、降血糖和保肝等多种药理作用。灵芝孢子粉是灵芝生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞。随着灵芝栽培技术的发展，灵芝孢子粉的产量越来越高，甚至超过子实体的产量。
多糖是孢子粉中的主要活性成分之一，近十几年对灵芝孢子粉的功效也进行了大量的研究，发现具有多种生物活性，如提高机体免疫力、提高机体耐缺氧能力、消除自由基、抑制肿瘤和抗辐射等。大多数的灵芝孢子粉中提取的多糖，其单糖组成主要为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，其中以葡萄糖摩尔占比最高(50％以上)，而半乳糖的摩尔占比较低(10％左右)。
半乳糖(Galactose)是一种常以多糖形式存在于植物胶、真菌细胞壁和奶类产品的单糖，用半乳糖代替葡萄糖可以预防或显著减少三磷酸腺苷(ATP)的损失和腺泡细胞的坏死，进而减少胰腺腺泡细胞损伤，保护急性胰腺炎小鼠的胰腺损伤。相关研究表明：依据结肠癌高表达的半乳糖凝集素家族成员galectin-3可以识别半乳糖并结合的特点，在galectin-3高表达的结肠炎症中期给予炎症性肠病大鼠富含半乳糖的多糖后可以阻止90％以上炎症性肠病，尤其是溃疡性结肠炎癌变，在炎症性肠病尤其是溃疡性结肠炎癌变药物开发方面表现出巨大潜力。此外，灵芝深层发酵得到的富含半乳糖的胞外多糖能显著增强小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖及抗体的产生，对卡介苗素和脂多糖诱导的肝损伤小鼠显示出肝保护活性。因此，提高灵芝中半乳糖含量具有实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法，所制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖中半乳糖含量为45～55wt％。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的制备方法，包括以下步骤：
将灵芝孢子粉与水混合，进行水提取，将所得物料浓缩后，得到灵芝孢子粉多糖粗提液；
将所述灵芝孢子粉多糖粗提液与乙醇混合，进行一级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为50～70％，得到一级醇沉产物；
将所述一级醇沉产物与乙醇混合，进行二级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为80～85％，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖；
所述灵芝孢子粉多糖中半乳糖的质量含量为45～55wt％。
优选的，所述灵芝孢子粉与水的质量比为1:(15～20)。
优选的，所述水提取在煮沸条件下进行；所述水提取的时间为2～3h。
优选的，进行所述浓缩至料液比为1g:(0.5～1)mL。
优选的，完成所述一级醇沉后，还包括：将所得物料依次进行静置和分离；所述静置的时间为12h；所述分离的方式为离心分离。
优选的，完成所述二级醇沉后，还包括将所得物料依次进行静置、分离和溶解冻干，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。
优选的，所述富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的分子量为(3.80～4.00)×103Da，由半乳糖、葡萄糖和甘露糖三种单糖组成，所述半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1:1。
本发明提供了一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的制备方法，包括以下步骤：将灵芝孢子粉与水混合，进行水提取，将所得物料浓缩后，得到灵芝孢子粉多糖粗提液；将所述灵芝孢子粉多糖粗提液与乙醇混合，进行一级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为50～70％，得到一级醇沉产物；将所述一级醇沉产物与乙醇混合，进行二级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为80～85％，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖；所述灵芝孢子粉多糖中半乳糖的质量含量为45～55wt％。本发明采用水提取灵芝孢子粉中多糖，水提物的单糖组成主要以葡萄糖、半乳糖和甘露糖为主，然后采用乙醇进行分级醇沉，通过一级醇沉得到的50～70％醇沉组分(分子量为106～104Da的组分)的单糖组成主要为葡萄糖，通过二级醇沉得到的80～85％醇沉组分(分子量为104～103Da的组分)主要是葡萄糖和半乳糖，且85％部分中半乳糖比重较高。本发明通过调控乙醇浓度，除去水提物中葡萄糖为主的部分，使富含半乳糖的组分得到富集，从而得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖，半乳糖的含量为45～55wt％。
本发明制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖组分分子量为(3.80～4.00)×103Da的均一多糖，单糖组成由半乳糖、葡萄糖和甘露糖三种单糖组成，其中半乳糖和葡萄糖摩尔比例接近1:1，甘露糖含量较少。
本发明制备得到的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖得率为0.67％，多糖含量为31～39％。
本发明的制备方法简便、高效、成本低，且适合规模化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的HPSEC-MALLS-RI分析谱图；
图2为实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的高效阴离子色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的制备方法，包括以下步骤：
将灵芝孢子粉与水混合，进行水提取，将所得物料浓缩后，得到灵芝孢子粉多糖粗提液；
将所述灵芝孢子粉多糖粗提液与乙醇混合，进行一级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为50～70％，得到一级醇沉产物；
将所述一级醇沉产物与乙醇混合，进行二级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为80～85％，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖；
所述灵芝孢子粉多糖中半乳糖的质量含量为45～55wt％。
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将灵芝孢子粉与水混合，进行水提取，将所得物料浓缩后，得到灵芝孢子粉多糖粗提液。本发明对所述灵芝孢子粉的来源没有特殊的限定，本领域熟知来源的灵芝孢子粉均可；在本发明的实施例中，具体为浙江龙泉基地的沪农灵芝1号采收的孢子粉。
本发明对所述灵芝孢子粉与水混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程将物料混合均匀即可。在本发明中，所述灵芝孢子粉与水的质量比优选为1:(15～20)，更优选为1:(16～18)。在本发明中，所述水提取优选在煮沸条件下进行；所述水提取的时间优选为2～3h。
本发明通过水提取将灵芝孢子粉中多糖提取出来。
完成所述水提取后，本发明优选将所得物料离心，收集上清液；本发明优选依次重复进行水提取、离心和收集上清液的过程1～2次，合并上清液，进行浓缩，得到灵芝孢子粉多糖粗提液。本发明对所述离心的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可；在本发明的实施例中，所述离心的转速为10000r/min或8000r/min，每次离心的时间为20min或15min。本发明优选将上清液浓缩至料液比为1g:(0.5～1)mL；所述浓缩优选在加热条件下进行，所述加热的温度优选为100℃。
得到灵芝孢子粉多糖粗提液后，本发明将所述灵芝孢子粉多糖粗提液与乙醇混合，进行一级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为50～70％，得到一级醇沉产物。
在本发明中，所述灵芝孢子粉多糖粗提液与乙醇混合的过程优选为向灵芝孢子粉多糖粗提液中加入乙醇，边加边搅拌，直至物料中乙醇的质量含量为50～70％，更优选为55～65％。本发明对所述搅拌的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程保证醇沉顺利进行即可。
在所述一级醇沉过程中，灵芝孢子粉多糖粗提液在乙醇作用下沉淀，分子量为106～104Da的组分(单糖组成主要为葡萄糖)沉淀，通过分离去除。
完成所述一级醇沉后，本发明优选还包括：将所得物料依次进行静置和分离；所述静置的时间优选为12h，所述静置优选在室温进行；所述分离的方式优选为离心分离。
分离后，本发明优选收集上清液，得到一级醇沉产物。
得到一级醇沉产物后，本发明将所述一级醇沉产物与乙醇混合，进行二级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为80～85％，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。在本发明中，所述一级醇沉产物与乙醇混合的过程优选为向所述一级醇沉产物中加入乙醇，直至物料中乙醇的质量含量为80～85％。
在所述二级醇沉过程中，分子量为104～103Da的组分(主要是葡萄糖和半乳糖)逐渐沉淀，富集多糖中的半乳糖。
完成所述二级醇沉后，本发明优选还包括将所得物料依次进行静置、分离和溶解冻干，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。在本发明中，所述静置的时间优选为12h，所述静置优选在室温进行；所述分离的方式优选为离心分离。本发明对所述离心的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程能实现固液分离即可。
分离后，本发明优选将所得沉淀溶解于水后，冻干，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。本发明对所述水的用量没有特殊的限定，能够将沉淀充分溶解即可。在本发明中，所述冻干优选在冷冻干燥机中；本发明对所述冻干的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。本发明通过溶解冻干将沉淀中包裹的乙醇溶解于水，在冻干的过程中随着水分一起除去，得到成分均一的多糖。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。在本发明中，所述富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的分子量为(3.80～4.00)×103Da，由半乳糖、葡萄糖和甘露糖三种单糖组成，所述半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1:1。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
以浙江龙泉基地栽培的沪农灵芝1号采收的孢子粉为原料，称取2000g，加入40L蒸馏水，加热至沸腾，保持微沸2h，将所得物料在10000r/min离心20min，将所得沉淀重复提取1次，在10000r/min离心20min，合并上清液，将所得上清液在100℃加热浓缩至1000mL，料液比为1g:0.5mL，得到灵芝孢子粉多糖粗提液；
向所述灵芝孢子粉多糖粗提液中加入无水乙醇，边加边搅拌，直至乙醇质量含量达到70％，将所得物料室温静置12h，离心，收集上清液；向上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇质量含量达到85％，将所得物料室温静置12h，离心，收集沉淀，将沉淀在蒸馏水中溶解后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖干品。
实施例2
以浙江龙泉基地栽培的沪农灵芝1号采收的孢子粉为原料，称取200g，加入4L蒸馏水，加热至沸腾，保持微沸2h，将所得物料在8000r/min离心15min，将所得沉淀重复提取1次，在8000r/min离心15min，合并上清液，将所得上清液在100℃加热浓缩至40mL，料液比为1g:0.5mL，得到灵芝孢子粉多糖粗提液；
向所述灵芝孢子粉多糖粗提液中加入无水乙醇，边加边搅拌，直至乙醇质量含量达到70％，将所得物料室温静置12h，离心，收集上清液；向上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇质量含量达到85％，将所得物料室温静置12h，离心，收集沉淀，将沉淀在蒸馏水中溶解后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖干品13.41g。
1)采用分析天平称量实施例1和实施例2制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖干品的重量，按公式1计算多糖得率：
Figure BDA0003386953210000061
2)多糖含量的检测：
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，精密称取富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖干品10mg，用蒸馏水溶解后定容至100mL，精密吸取样品溶液1.0mL，置15mL试管中，加入0.5mL质量浓度5％的苯酚，2.5mL 98％浓硫酸，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡萄糖为标准品计算样品中多糖含量。
计算发现，实施例1中：多糖的重量为13.41g，样品重量2000g，制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖得率为0.67％，多糖含量为38.78wt％；
实施例2中：多糖的重量为1.33g，样品重量2000g，制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖得率为0.67％，多糖含量为31.61wt％。
3)HPSEC-MALLS-RI分析
1、样品制备：称取实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖干品5mg，加入1.0mL HPLC流动相，充分溶解，12000r/min离心5min，所得上清液经0.22μm的水相微孔膜过滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析；
2、色谱分析条件：分析柱为日本TOSOH公司TSKPWXL6000和TSK PWXL3000凝胶色谱柱串联后分析，流动相为含0.05mol/L的NaH2PO4和0.15mol/L的NaNO3水溶液(pH＝7，含有体积分数0.03％的叠氮钠)，流速为0.5mL/min，色谱柱温度为35℃；激光检测器光源波长选用623.8nm；多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。
3、分子量计算：使用Astra(version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算多糖分子量和其他分子特性，所得HPSEC-MALLS-RI分析图谱如图1所示。
由图1可知，实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖组分主要含有1个大峰，代表均一多糖，即多糖的重均分子量为3.91×103Da。
4)高效阴离子色谱(HPAEC)分析
1、样品制备：称取实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖干品2.0mg加入带盖玻璃瓶中，加入3mL 2mol/L的三氟乙酸，110℃油浴3h，冷却至室温，40℃下用氮吹仪吹干，再加甲醇吹干，重复4～5次至无酸味，用超纯水将玻璃瓶中的样品转移至100mL容量瓶中，定容后取少量于离心管中，12000r/min离心20min，取上清液进行高效阴离子色谱(HPAEC)分析。
2、色谱条件：Dionex公司色谱柱CarboPacTM PA20(3mm×150mm)；流动相为2mMNaOH溶液(pH＝12)和超纯水；时间30min；柱温30℃；流速0.45mL/min；进样量25μL。
经高效阴离子色谱检测实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的单糖组成如图2所示。由图2可知，实施例1制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖组分由半乳糖、葡萄糖和甘露糖三种单糖组成，其中半乳糖和葡萄糖摩尔比例接近1:1，甘露糖含量较少；说明本发明制备的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖中半乳糖含量接近50wt％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将灵芝孢子粉与水混合，进行水提取，将所得物料浓缩后，得到灵芝孢子粉多糖粗提液；
将所述灵芝孢子粉多糖粗提液与乙醇混合，进行一级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为50～70％，得到一级醇沉产物；
将所述一级醇沉产物与乙醇混合，进行二级醇沉，直至物料中乙醇的质量含量为80～85％，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖；
所述灵芝孢子粉多糖中半乳糖的质量含量为45～55wt％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灵芝孢子粉与水的质量比为1:(15～20)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水提取在煮沸条件下进行；所述水提取的时间为2～3h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行所述浓缩至料液比为1g:(0.5～1)mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，完成所述一级醇沉后，还包括：将所得物料依次进行静置和分离；所述静置的时间为12h；所述分离的方式为离心分离。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，完成所述二级醇沉后，还包括将所得物料依次进行静置、分离和溶解冻干，得到富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。
7.权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖。
8.根据权利要求7所述的富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖，其特征在于，所述富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖的分子量为(3.80～4.00)×103Da，由半乳糖、葡萄糖和甘露糖三种单糖组成，所述半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1:1。
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