CN1397566A - 抗肿瘤和免疫调节白术多糖、生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从中药材白术中提取的多糖、其生产方法和用途。本发明采用常压煎煮获得白术水提液,有机溶剂沉淀、沉淀用水溶解,上清液经透析或膜分离和浓缩干燥获得总多糖,白术总多糖经有机溶剂分级沉淀和柱层析获得白术多糖AMP-1,其化学结构以β-(1→2)-连接-D-半乳糖为主链,有的半乳糖在0-6位有β-D-甘露糖末端分枝,该多糖无毒副作用,具有抗肿瘤和调节免疫功能作用。本发明方法工艺简单、产率高,适宜工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及从生药白术中提取白术多糖AMP-1的化学结构和生产方法。
技术背景
白术是一种传统的中药材,具有“补气健脾、燥湿利水、止汗、安胎之功效。白术中含有挥发油,如苍术酮、白术内酯和微量元素,有关白术多糖的报道很少。顾玉诚等(中草药,1992,10:507)从白术中分离出二种多糖,其中为分子量3.1×104的甘露聚糖和分子量1.1×104的果聚糖,无生物活性报道。池玉梅等(中药材,2001,9:647)得到分子量1.36×105和分子量1.04×105二种杂多糖,单糖组成一为半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖,二为木糖、阿拉伯糖和半乳糖,无生物活性报道。
发明内容
本发明的目的是提供方法简便、产率高和适于工业化生产的白术多糖。
本发明是从生药白术中提取获得的多糖,其化学结构为β-(1→2)-连接-D-半乳糖为主链,且有1/3~1/2的半乳糖的C6上有β-D-甘露糖末端分枝。本发明的制备方法是将生药白术用水浸泡,采用煎煮获得水提液,有机溶剂沉淀,透析或膜分离,浓缩干燥获得白术总多糖。白术总多糖用有机溶剂二~三次分级沉淀获得白术多糖精品,再经凝胶柱层析纯化得多糖纯品AMP-1。该多糖无毒副作用,具有抗肿瘤和调节免疫功能作用。
该多糖由完全酸水解、还原、乙酰化和GC分析得知由甘露糖和半乳糖组成,其甘露糖和半乳糖摩尔比为1∶2.0~3.0,推荐的摩尔比为1∶2.5。例如实测甘露糖和半乳糖摩尔比为1∶1.91,经四舍五入为1∶1.91。由ESI-MS和HPLC分析得知分子量在3200~5800左右,推荐的平均分子量在3800左右。其谱图数据例如下面所述:IR 936cm-1(β-D-吡喃半乳糖基);1H-NMR:δ(ppm)<5.0(β-D-吡喃半乳糖基和β-D-吡喃甘露糖基);13C-NMR:δ1(ppm)106.4(C-1),84.4(C-4),80.7(C-2),78.0(C-3),65.4(C-5),64.3(C-6);δ2(ppm)95.7(C-1),76.0(C-4),75.7(C-5),74.5(C-3),72.8(C-2),63.7(C-6).δ1为β-D-比喃半乳糖残基,δ2为β-D-吡吡喃甘露糖末端残基。
从AMP-1甲基化、还原、乙酰化衍生物的GC-MS图谱分析得知,AMP-1含有[Manp]1→碎片、→2[Galp]1→和→2,6[Galp]1→碎片,其摩尔比2∶2~4∶2。根据甲基化、NMR等分析,AMP-1具有以下重复单元结构:
式中,Manp为甘露糖,Galp为半乳糖,1、2、6分别代表单糖的取代位置,n=0~2,m=3~4。
本发明的制备方法包括将生药白术干燥用水浸泡,煎煮获得水煎液提取白术多糖(其目的是获得与临床用药水煎剂加工方法相同的白术多糖)。采用不同浓度的有机溶剂沉淀2~3次获得白术多糖精品,精品再经凝胶柱层析纯化可得多糖纯品AMP-1。
具体来说,将干燥后的生药白术粉碎或切片,用水浸泡,煎煮,其中生药白术与浸泡水或煎煮水的重量比推荐是白术∶水=1∶5-15,尤其推荐用10-12倍重量或更多的水,浸泡0.5-12小时。常压煎煮时间推荐0.5-2小时。所述水推荐为无离子水。浸泡液和水提液的pH值推荐保持在5.0-8.0。
过滤,滤液经或不经浓缩,用有机溶剂沉淀后离心。离心所得沉淀用水溶解,推荐用1-5倍重量的水溶解。
离心,上清液透析或膜分离,透析时间推荐为24-72小时,透析用透析膜、透析袋,其孔径推荐截留分子量在1000以下,尤其推荐截留分子量为500~1000的。
浓缩干燥获得总多糖,其中干燥或减压浓缩温度推荐低于60℃进行,最好采用低温真空浓缩或冷冻干燥,例如在30~60℃干燥或浓缩,压强推荐控制在0.08~0.1MPa。
所得白术总多糖加水溶解,其中推荐加1-5倍重量的水溶解。然后加有机溶剂沉淀。离心,上清液重复加有机溶剂沉淀。上述沉淀推荐加2~6倍体积的与水互溶的有机溶剂,尤其推荐加2倍体积的与水互溶的有机溶剂沉淀24小时。离心,沉淀用水溶解,透析或膜分离后冷冻干燥获得白术多糖精品,纯度可达90%以上。多糖精品再经凝胶柱层析作进一步纯化,用水或稀盐溶液洗脱,收集糖峰,膜分离后冷冻干燥获得白术多糖纯品AMP-1,纯度可达99%。凝胶柱层析所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose、Bio-Gel P型或Superdex,选用的分离范围为5×102~1×104道尔顿。推荐凝胶用Sephadex G-25,用0.1MNaCl洗脱。
前述的用有机溶剂沉淀,所述有机溶剂推荐与水互溶的有机溶剂,可以是低碳链的醇或酮,例如C1~C6的醇或酮等;尤其推荐乙醇,例如用2~6倍体积的75%~95%的乙醇;沉淀时间推荐为12-72小时。
本发明的白术多糖AMP-1易溶于水,具有抗肿瘤和调节免疫功能的作用,其可用于制备抗肿瘤和调节免疫的药品或保健品等。用本发明方法获得的白术多糖AMP-1对小鼠S-180肉瘤和小鼠Lewis肺癌均有明显的抑制作用,均可以提高荷瘤小鼠的NK细胞的活性,具有明显的增强免疫功能作用。
本发明首次从白术中提取白术多糖AMP-1。本发明的提取分离方法简便,产率高和适于工业化生产。该多糖适用于口服和注射液用药。具有显著抑制肿瘤生长和显著增强免疫功能的作用。
附图说明
图1是白术多糖AMP-11H-核磁共振(NMR)图谱。其中δppm<5.0表明是β-D型半乳糖苷键和β-D型甘露糖苷键
图2是白术多糖AMP-1 13C-核磁共振(NMR)图谱。其中δ1(ppm):106.4,84.4,80.7,78.0,65.4,64.3表明为β-D型半乳糖苷键δ2(ppm):95.7,76.0,75.7,74.5,72.8,63.7表明为甘露糖末端苷键。
图3是白术多糖AMP-1红外光谱图谱。仪器:Bio-rad FTS-185。其中936cm-1处有吸收峰表明有β型半乳糖残基。
图4是白术多糖AMP-1的GC-MS图谱中的GC图谱。其表明有3个碎片峰,具体碎片质量见图5,6,7。
图5是白术多糖AMP-1的MS图谱,其对应于GC图中的18.357min峰,表明有→2[Galp]1→。
图6是白术多糖AMP-1的MS图谱,其对应于GC图中的18.585min峰,表明有→2,6[Galp]1→。
图7是白术多糖AMP-1的MS图谱,其对应于GC图中的15.686min峰,表明有[Manp]1→。
图8是白术多糖经两次有机溶剂沉淀得到的白术多糖精品的HPLC图,图中:
峰 | 保留时间 | 峰面积 | 峰面积百分比 |
1 | 5.660 | 16635 | 0.64 |
2 | 5.817 | 5974 | 0.23 |
3 | 6.302 | 21214 | 0.82 |
4 | 7.134 | 65058 | 2.50 |
5 | 13.859 | 2493105 | 95.82 |
总计 | 2601986 | 100.00 |
图9是白术多糖AMP-1纯品的HPLC图,图中:
峰 | 保留时间 | 峰面积 | 峰面积百分比 |
1 | 13.035 | 5282101 | 98.39 |
2 | 18.429 | 86503 | 1.61 |
总计 | 538603 | 100.00 |
具体实施方式
实施例1
将生药白术1公斤洗净干燥,粉碎,用10升无离子水室温浸泡1小时,常压煎煮1小时并不停搅拌,过滤。残渣用5升无离子水继续煎煮1小时,过滤,合并滤液,60℃减压浓缩至2-4升。然后用95%的乙醇沉淀,乙醇终浓度为80%,醇沉24小时。离心,沉淀用2.5升水溶解,离心,无离子水透析48-72小时。60℃减压浓缩后冷冻干燥,即获得白术多糖100克。加水2升溶解,离心,上清液加4升95%乙醇醇沉24小时,离心。上清液再加入4升95%乙醇醇沉24小时,离心,沉淀用1升水溶解,然后减压浓缩、冷冻干燥,获得平均分子量3800±380左右的白术多糖10克。
实施例2
将生药白术1公斤洗净干燥,粉碎,用10升无离子水室温浸泡2小时,常压煎煮1小时并不停搅拌,过滤。残渣用5升无离子水继续煎煮1小时,过滤,合并滤液,60℃减压浓缩至4升。然后用6倍体积的95%的乙醇沉淀,乙醇终浓度为82%,醇沉72小时。离心,沉淀用4升水溶解,离心,无离子水透析72小时。55℃减压浓缩后冷冻干燥,即获得白术多糖120克。加水2升溶解,离心,上清液加4升95%乙醇醇沉24小时,离心。上清液再加入4升95%乙醇醇沉24小时,离心,沉淀用1升水溶解,然后减压浓缩、冷冻干燥,获得平均分子量3800左右的白术多糖11.8克。
实施例3
白术总多糖经不同浓度乙醇分级沉淀获得分子量3800左右的精制多糖,纯度为90~95%,该多糖再经Sephadex-G-25柱层析,即获得纯度为99%的纯多糖。具体分离方法:称取精制多糖150mg,溶于3~5ml蒸馏中,离心(4500r/min,10min)。取上清液上玻璃柱(1.5cm*100cm),用0.1M NaCl洗脱,流速为0.5ml/min,每管收集3~5ml,大约10~20管为吸收峰。收集,,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,即获得纯多糖110mg。
实施例4
白术多糖对小鼠Lewis肺癌足趾接种的疗效试验
样品 剂量 给药方案 动物数 瘤重 抑制率
mg/kg X±SD %
AMP-1 200 ip×8qd 10 0.499±0.10 50.10**
AMP-1 100 ip×8qd 10 0.539±0.08 46.10**
CY 30 ip×7qd 10 0.038±0.01 96.20***
对照组 NS ip×8qd 10 2.34±0.09
**表示试验组与阴性对照组相比p<0.01
***表示试验组与阴性对照组相比p<0.001
白术多糖对小鼠S-180肉瘤(腋皮下接种)的实验结果
样品 剂量 给药方案 动物数 瘤重 抑制率
mg/kg X±SD %
AMP-1 200 ip×8qd 10 1.41±0.19 39.74**
AMP-1 100 ip×8qd 10 1.53±0.17 34.61**
CY 30 ip×7qd 10 0.25±0.14 89.32***
对照组(NS) ip×8qd 10 2.34±0.29
**表示试验组与阴性对照组相比p<0.01
***表示试验组与阴性对照组相比p<0.001
白术多糖对荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影响
样品 剂量 给药方案 动物数 OD值 NK活性
mg/kg X±SD %
AMP-1 200 ip×8qd 6 0.345±0.05** 51.61
AMP-1 100 ip×8qd 6 0.333±0.05** 53.30
对照组 NS ip×8qd 6 0.545±0.08 23.56
**表示试验组与阴性对照组相比p<0.01
Claims (10)
1.一种抗肿瘤和免疫调节水溶性白术多糖,其特征是具有如下重复单元结构:
其中n=0~2,m=3~4,Manp为甘露糖,Galp为半乳糖,1、2、6分别代表单糖的取代位置。
2.如权利要求1所述的白术多糖,其特征是分子量为3200~5800。
3.如权利要求1所述的白术多糖,其特征是其半乳糖和甘露糖的组成摩尔比2.0~3.0∶1。
4.如权利要求1所述的白术多糖的生产方法,其特征是包括将干燥后的生药白术用水浸泡,煎煮,用有机溶剂沉淀,沉淀用水溶解,上清液经透析或者膜分离后,浓缩干燥获得总多糖,白术总多糖加水溶解后,用有机溶剂分级沉淀2~3次获得多糖精品,多糖精品经凝胶柱层析纯化可得多糖纯品AMP-1。
5.如权利要求3所述的白术多糖的生产方法,其特征是生药白术与浸泡水或煎煮水的重量比是白术∶水=1∶5-15,水浸泡时间0.5-12小时,煎煮0.5-2小时,浸泡液或水煎液的pH=5-8。
6.如权利要求3所述的白术多糖的生产方法,其特征是水提液加入2-6倍体积的有机溶剂分级沉淀12~72小时。
7.如权利要求3所述的白术多糖的生产方法,其特征是所述的有机溶剂是与水互溶的有机溶剂。
8.如权利要求3所述的白术多糖的生产方法,其特征是所述的凝胶柱层析所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose、Bio-Gel P型或Superdex,选用的分离范围为5×102~1×104道尔顿。
9.如权利要求3所述的白术多糖的生产方法,其特征是透析或膜分离所采用的膜,其孔径控制在截留分子量500-1000。
10.如权利要求1所述的白术多糖,其特征是具有抗肿瘤和调节免疫功能的作用。
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