CN108226330A - 一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法 - Google Patents

一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，步骤包括：S1、预处理：将茯苓多糖用氢氧化钠溶液溶胀，搅拌后采用流动相稀释，静置20～40分钟后摇匀、过滤，滤液作为供试品溶液；S2、标准曲线绘制：选取多个重均分子量不同的葡聚糖标准品，分别用流动相稀释，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，绘制标准曲线；S3、供试品溶液测定：取供试品溶液注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，利用标准曲线法得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布。该方法准确，简单，灵敏度高，分离度好，重复性好。

Description

一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法
技术领域
本发明涉及多糖分子量检测技术领域，具体涉及一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法。
背景技术
多糖又称多聚糖，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，由单糖聚合成聚合度大于10的极性大分子，分子量为数万至数百万，是生物体内普遍存在的、参与高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁构成的天然高分子化合物，是构成生命活动的四大基本物质之一，具有重要的生物活性。
茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf是多孔菌科真菌类的干燥菌核，为传统中药，茯苓多糖散为免疫调节药物，其既能增强细胞免疫功能，又能增强体液免疫功能，并能明显诱导促生IL-2、TNF、IL-6、IFN-γ等免疫因子，起到调节免疫功能的作用，在兽医临床上有广泛的应用前景。
然而在开发茯苓多糖散的过程中，茯苓多糖分子量与分子量分布并没有现成的检测和分析方法，这种现状使得该药物没有统一的标准，极大的阻碍了该药物的应用和推广，因此，建立一套有效、稳定的分子量与分子量分布检测方法时十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法。
本发明提供了一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，步骤包括：
S1、预处理：将茯苓多糖用氢氧化钠溶液溶胀，搅拌后采用流动相稀释，静置20～40分钟后摇匀、过滤，滤液作为供试品溶液；
S2、标准曲线绘制：选取多个重均分子量不同的葡聚糖标准品，分别用流动相稀释至标准品溶液浓度与供试品溶液浓度相等，然后取各标准品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，绘制标准曲线；
其中，所述液相色谱分析条件为：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液；
流速：流速0.60-1.20ml/min；
柱温：25-40℃；
检测器温度35℃；
S3、供试品溶液测定：取S1所得供试品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，通过S2所得标准曲线，利用标准曲线法得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布。
本发明的有益效果是：本方法通过液相色谱进行分析检测，对照品标准曲线法进行定性定量，采用GPC专用软件处理，计算，所述检测方法精密度高(RSD值为1.54％)、准确、简单、重复性好、灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例一中葡聚糖分子量对照品标准曲线图。
图2为实施例一中茯苓多糖散液相色谱图。
图3为实施例一中茯苓多糖GPC图。
图4为实施例一中茯苓多糖分子量分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，步骤包括：
S1、预处理：将茯苓多糖用氢氧化钠溶液溶胀，搅拌后采用流动相稀释，静置20～40分钟后摇匀、过滤，滤液作为供试品溶液；
S2、标准曲线绘制：选取多个重均分子量不同的葡聚糖标准品，分别用流动相稀释至标准品溶液浓度与供试品溶液浓度相等，然后取各标准品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，绘制标准曲线；
其中，所述液相色谱分析条件为：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液；
流速：流速0.60-1.20ml/min；
柱温：25-40℃；
检测器温度35℃；
S3、供试品溶液测定：取S1所得供试品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，通过S2所得标准曲线，利用标准曲线法得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布。
目前，茯苓多糖的检测均采用化学方法检测，检测过程繁琐，误差较大，常规的多糖液相检测方法也并不适用于茯苓多糖，采用常规的多糖液相检测方法用于检测茯苓多糖分离效果较差，难以检出，并且茯苓多糖在常规多糖检测用流动相中溶解性不佳，易造成色谱柱堵塞。本发明提供的液相检测方法，样品采用氢氧化钠溶液溶胀后直接用流动相稀释，茯苓多糖在碱性流动相中溶解性能佳，分离效果十分良好，得出的结果与现有文献记载的分子量相符，准确度高、重现性好。
优选的，所述液相色谱分析采用的色谱柱为凝胶色谱柱，色谱柱规格为长度7.5mm，内径300mm，填料粒径8μm；
所述液相色谱分析条件为：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液；
流速：流速0.8ml/min；
柱温：35℃；
检测器温度35℃；
进样量：10μL。
优选的，步骤S1中，所述用流动相稀释为用流动相稀释至茯苓多糖浓度为1mg/mL，步骤S2中，所述用流动相稀释为用流动相稀释至葡聚糖标准品的浓度为1mg/mL。
优选的，步骤S1中，所述氢氧化钠溶液浓度为0.9mol/L。
更加优选的，每10mg茯苓多糖用1mL氢氧化钠溶液溶胀。
优选的，步骤S2中，所述葡聚糖标准品的重均分子量分别为180、1×104、4×104、7×104、5×105、2×106。
优选的，采用GPC软件处理色谱检测结果，得到标准曲线，以及根据标准曲线得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布。
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
Ⅰ仪器设备及原材料：
安捷伦1260液相色谱分析仪，配备示差折光检测器，ChemStation色谱工作站，多糖专用凝胶(PL aquagel-OH MIXED，7.5mm×300mm，8μm)色谱柱；
试剂：磷酸氢二钠(分析级)、氢氧化钠(分析级)、纯化水、葡聚糖系列标准品，茯苓多糖散。
Ⅱ茯苓多糖分析样品的制备：
1.色谱分析条件：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠；
流速：流速0.80ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μl。
2.取茯苓多糖散10mg，加0.9mol/L氢氧化钠溶液1ml使溶胀，搅拌，再加流动相稀释至10ml，放置30分钟，摇匀，滤过。
3.标准品标准曲线的绘制取已知分子量的葡聚糖系列标准品PJT-180，PJT-10K，PJT-40K，PJT-70K，PJT-500K，PJT-2000K，重均分子量分别为180.00，1×104，4×104，7×104，5×105，2×106，分别用流动相溶解制成每1ml含1mg的溶液。分别取6个已知分子量的葡聚糖溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，输入各标样的重均分子量，绘制标准曲线，采用GPC专用软件处理，计算。
4.取茯苓多糖散供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，利用标准曲线法，采用GPC专用软件处理，计算，得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布见表1所示。
茯苓多糖的重均分子量应为11.99万道尔顿，大于1.98万道尔顿的不得少于90％。
5.精密度考察
对同批次不同样品进行检查，重均分子量和分子量分布差见表2所示；
精密度实验结果表明：该方法测得的同批次不同样品的重均分子量和分子量分布差异较小，RSD值为1.54％，精密度试验符合规定。
实施例2：
Ⅰ仪器设备及原材料：
安捷伦1260液相色谱分析仪，配备示差折光检测器，ChemStation色谱工作站，多糖专用凝胶(PL aquagel-OH MIXED，7.5mm×300mm，8μm)色谱柱；
试剂：磷酸氢二钠(分析级)、氢氧化钠(分析级)、纯化水、葡聚糖系列标准品，茯苓多糖散。
Ⅱ茯苓多糖分析样品的制备：
1.色谱分析条件：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠；
流速：流速0.60ml/min；
柱温：35℃；
2.取茯苓多糖散10mg，加0.9mol/L氢氧化钠溶液1ml使溶胀，搅拌，再加流动相稀释至10ml，放置30分钟，摇匀，滤过。
3.标准品标准曲线的绘制取已知分子量的葡聚糖系列标准品PJT-180，PJT-10K，PJT-40K，PJT-70K，PJT-500K，PJT-2000K，重均分子量分别为180.00，1×104，4×104，7×104，5×105，2×106，分别用流动相溶解制成每1ml含1mg的溶液。分别取6个已知分子量的葡聚糖溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，输入各标样的重均分子量，绘制标准曲线，采用GPC专用软件处理，计算。
4.取茯苓多糖散供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，利用标准曲线法，采用GPC专用软件处理，计算，得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布见表3所示。
茯苓多糖的重均分子量应为11.59万道尔顿，大于1.95万道尔顿的不得少于90％。
实施例3：
Ⅰ仪器设备及原材料：
安捷伦1260液相色谱分析仪，配备示差折光检测器，ChemStation色谱工作站，多糖专用凝胶(PL aquagel-OH MIXED，7.5mm×300mm，8μm)色谱柱；
试剂：磷酸氢二钠(分析级)、氢氧化钠(分析级)、纯化水、葡聚糖系列标准品，茯苓多糖散。
Ⅱ茯苓多糖分析样品的制备：
1.色谱分析条件：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠；
流速：流速1.00ml/min；
柱温：35℃；
2.取茯苓多糖散10mg，加0.9mol/L氢氧化钠溶液1ml使溶胀，搅拌，再加流动相稀释至10ml，放置30分钟，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
3.标准品标准曲线的绘制取已知分子量的葡聚糖系列标准品PJT-180，PJT-10K，PJT-40K，PJT-70K，PJT-500K，PJT-2000K，重均分子量分别为180.00，1×104，4×104，7×104，5×105，2×106，分别用流动相溶解制成每1ml含1mg的溶液。分别取6个已知分子量的葡聚糖溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，输入各标样的重均分子量，绘制标准曲线，采用GPC专用软件处理，计算。4.取茯苓多糖散供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，利用标准曲线法，采用GPC专用软件处理，计算，得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布结果，结果见表4。
茯苓多糖的重均分子量应为12.32万道尔顿，大于1.97万道尔顿的不得少于90％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于，步骤包括：
S1、预处理：将茯苓多糖用氢氧化钠溶液溶胀，搅拌后采用流动相稀释，静置20～40分钟后摇匀、过滤，滤液作为供试品溶液；
S2、标准曲线绘制：选取多个重均分子量不同的葡聚糖标准品，分别用流动相稀释至标准品溶液浓度与供试品溶液浓度相等，然后取各标准品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，绘制标准曲线；
其中，所述液相色谱分析条件为：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液；
流速：流速0.60-1.20ml/min；
柱温：25-40℃；
检测器温度35℃；
S3、供试品溶液测定：取S1所得供试品溶液，注入液相色谱仪进行液相色谱分析，记录色谱图，通过S2所得标准曲线，利用标准曲线法得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布。
2.如权利要求1所述的茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于：所述液相色谱分析采用的色谱柱为凝胶色谱柱，色谱柱规格为长度7.5mm，内径300mm，填料粒径8μm；
所述液相色谱分析条件为：
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液；
流速：流速0.8ml/min；
柱温：35℃；
检测器温度35℃；
进样量：10μL。
3.如权利要求1所述的茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述用流动相稀释为用流动相稀释至茯苓多糖浓度为1mg/mL，步骤S2中，所述用流动相稀释为用流动相稀释至葡聚糖标准品的浓度为1mg/mL。
4.如权利要求1所述的茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述氢氧化钠溶液浓度为0.9mol/L。
5.如权利要求4所述的茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于：每10mg茯苓多糖用1mL氢氧化钠溶液溶胀。
6.如权利要求1所述的茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于：步骤S2中，所述葡聚糖标准品的重均分子量分别为180、1×104、4×104、7×104、5×105、2×106。
7.如权利要求1所述的茯苓多糖分子量与分子量分布的检测方法，其特征在于：采用GPC软件处理色谱检测结果，得到标准曲线，以及根据标准曲线得到茯苓多糖散的分子量与分子量分布。
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