CN104215614B - 一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷a、b和芦荟大黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱‑二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法。本发明使用高效液相色谱‑二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定待测液和对照品溶液,得到相应的峰面积;计算得到芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。本发明中待测成分与相邻色谱峰达到基线分离的效果,方法的回收率高,重现性好;能够使芦荟苷A和芦荟苷B的色谱峰被完全分离,可同时准确测定芦荟产品中微量的芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素;本发明对芦荟苷A的最低检测限LOD达到0.080(ug/mL);对芦荟大黄素的最低检测限LOD达到0.010(ug/mL)。可以很好的满足目前芦荟产业对芦荟食品、化妆品中微量芦荟苷与芦荟大黄素的同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及芦荟苷和芦荟大黄素检测的技术领域,更具体地,涉及一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法。
背景技术
现有研究表明蒽醌类化合物是芦荟的主要药效成分。其中芦荟苷是芦荟的标志性成分,它具有致泻、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病等活性,2010年版《中华人民共和国药典》将芦荟苷作为芦荟药材的质控成分,此外芦荟苷有一定的细胞毒性,在食品和保健品中芦荟苷则是一种限制性成分,因此芦荟苷成为评价芦荟品质优劣以及安全性的重要指标。但是,芦荟苷在溶液状态下很不稳定,最近我们的研究表明芦荟苷溶解于水后很不稳定,会立即发生分解与聚合,在中性(pH 7.0)、室温条件下600 ug/mL浓度的芦荟苷溶液1天后,芦荟苷降解了近50%,5天降解90%以上,在该条件下降解产物经分析鉴定为芦荟大黄素与elgonica-dimer,经细胞毒理MTT实验,结果表明后二者毒性远大于芦荟苷,也就是说,芦荟提取物配成水溶液放置后芦荟苷的量在不断降低,芦荟大黄素与elgonica-dimer在不断增加,因此仅仅对芦荟苷的含量进行测定无法满足对产品有效性和安全性的质量控制。对于芦荟产品,科学可靠的质量控制方法应该同时测定其中芦荟苷和芦荟大黄素的含量,以保证芦荟产品的安全有效,因此芦荟苷、芦荟大黄素高灵敏度同时测定的方法成为芦荟产品质量控制的关键技术。
另外,对于芦荟产品,国际芦荟科学委员会(IASC)建议其中芦荟苷含量不超过10ppm,因此芦荟产品中所含芦荟苷和芦荟大黄素含量很低,有的产品中芦荟苷含量可能低于1 ppm,因此需要建立一种灵敏度高(低于1 ppm)、专属性强、样品前处理简单、操作简便,同时进行芦荟苷和芦荟大黄素含量测定的方法。
目前,芦荟苷和芦荟大黄素的含量测定方法主要都有紫外-可见分光光度法、荧光光度法、电化学分析法、薄层扫描法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法;同时测定这两个化合物的方法主要有高效液相色谱法、电化学分析方法和高效液相色谱-质谱联用的方法。气质联用和液质联用可以有效的提高检测方法的灵敏度,但是气质联用需要复杂的衍生化过程,检测成本高,较为简便的方法中如电化学方法又存在重现性较差的问题,紫外可见分光光度法则专属性不强,灵敏度不高,荧光光度法的虽然灵敏度高但与紫外可见分光光度法类似专属性不强,很难排除芦荟产品中其它蒽醌和色酮类成分的干扰。
植物体中芦荟苷是以一对光学异构体芦荟苷A和芦荟苷B存在,然而上述检测方法在芦荟苷的测定中是往往仅测定了芦荟苷A的含量,漏掉了芦荟苷B的量,这主要存在以下原因,首先现有检测方法的存在色谱峰分离度不够高,易受其他蒽醌和色酮类成分的干扰;再者目前市场上供应的芦荟苷含量测定对照品仅有芦荟苷A,因此上述检测方法对芦荟苷的测定中是往往仅测定了芦荟苷A的含量,漏掉了芦荟苷B的量。这也就影响了现有检测方法的检测结果的准确性和可靠性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有微量芦荟苷和芦荟大黄素同时检测的技术问题,提供一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法。本方法大大提高了芦荟大黄素检测的灵敏度和保证了芦荟苷含量检测结果的准确性和可靠性。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现:
一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,采用色谱条件为:使用规格为250 mm×4.6 mm、5 µm 的Agilent TC-C18色谱柱;流动相为乙腈和超纯水;梯度洗脱程序为0至21 min,20%~26%乙腈、21至35 min,26%~45%乙腈、35至50 min,45%~55%乙腈;每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10 min;柱温为32~37℃,进样量为20 μL,流速为1.0 mL/min;二极管阵列检测器的检测波长为356nm;荧光检测器的检测波长为λex=428 nm,λem=520 nm;
所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。
一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,包括以下步骤:
S1. 按现有方法制备待测液与对照品溶液;
S2. 含量的测定:
采用高效液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定S1中的待测液和对照品溶液,得到相应的峰面积;
采用色谱条件为:使用规格为250 mm×4.6 mm、5 µm 的Agilent TC-C18色谱柱;流动相为乙腈和超纯水;梯度洗脱程序为0至21 min,20%~26%乙腈、21至35 min,26%~45%乙腈、35至50 min,45%~55%乙腈;每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10 min;柱温为32~37℃,进样量为20 μL,流速为1.0 mL/min;二极管阵列检测器的检测波长为356 nm;荧光检测器的检测波长为λex=428 nm,λem=520 nm;
S3. 根据S2中得到的待测液和对照品溶液的峰面积计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量;
所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。
本发明中,流动相的乙腈和超纯水按体积比混合。
芦荟大黄素在一定的激发波长下能发出较强的荧光,采用荧光检测器可以大大提高其检测灵敏度。本发明采用高效液相色谱-二极管阵列检测器串联荧光检测器的方法对低含量或微量的芦荟苷和芦荟大黄素进行检测,实现了芦荟苷和芦荟大黄素同时检测的目的,本方法还可排除样品中其他不会产生荧光物质的干扰,使其芦荟大黄素的检测专属性更强,其检测限可以比现有紫外检测法高出二个数量级。
芦荟苷A和芦荟苷B是一对异构体,如果没有合适的条件很难将其分离,而且这两种物质的峰重叠在一起往往是不规整的叠加,即使将其分离,也有可能因为基线分离不好,而导致难以准确计算其积分峰面积,使测量结果不准确。发明人发现,由于库拉索芦荟中除了芦荟苷、芦荟大黄素外,还有很多其他成分,其极性分布广,其中不少成分与芦荟苷A和B极性相近似、不少成分与芦荟大黄素极性相似,因此在洗脱时需要在本申请所限定的条件下缓慢的提高有机相的比例,才能保证芦荟苷A和芦荟苷B、芦荟大黄素有良好的分离度,并且使基线平整,为准确地测量待测物中芦荟苷的含量提供可能。
另外,现有技术中也有通过色谱柱及流动相的选择实现芦荟苷A和芦荟苷B的分离,但是流动相中通常需要采用乙酸,乙酸对色谱柱存在腐蚀性,长期使用会降低普通色谱柱寿命,要么需要选用一些耐pH值更好的色谱柱,这样会增加成本。而本申请中,仅使用乙腈水溶液即能很好地实现分离,乙腈不会腐蚀色谱柱,因此可以相对地延长色谱柱寿命,也可以减少对色谱柱的要求。
由于芦荟中的蒽醌类成分极性比较大,常规提取方法多采用低级醇类,如甲醇、乙醇是比较适合的溶剂。甲醇的提取速度快,没有区分效应,可以将样品中的化学成分全面提取,不易丢失成分。优选地,S1为往芦荟待测物中加入甲醇,再经超声处理后过滤,得到待测液;分别往芦荟苷A和芦荟大黄素的对照品中加甲醇溶解,得到芦荟苷A和芦荟大黄素的对照品溶液。
由于存在着芦荟苷A和芦荟大黄素的标准对照品,因此本发明中S3为根据S2中得到的对照品溶液的峰面积绘制标准曲线,并根据标准曲线计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。本发明使用标准曲线法操作更加简单方便,更适用于大批量样品的检测。
由于市面上没有芦荟苷B标准对照品出售,并且芦荟苷B很不稳定,因此发明人采用前期研究的方法(见《李婷,钟英,王芝,万金志. 芦荟苷A、B以及异芦荟色苷D的同时分离纯化[J]. 天然产物研究与开发,2011,05:878-881》)制备的芦荟苷B对照品,用来鉴定芦荟苷B色谱峰。
本发明在芦荟苷B含量的计算方法为,在DAD色谱图中计算出芦荟苷B的色谱峰面积,通过芦荟苷A对照品所得的标准曲线公式,计算出芦荟苷B的浓度值。
由于利用超声方式进行提取,可使甲醇快速地进入芦荟制品中,将其所含的芦荟苷和芦荟大黄素尽可能完全地溶于甲醇之中,大大提高提取效率,缩短提取时间。优选地,本发明所述S1中超声处理的时间为30 min,超声次数为1次。
优选地,本发明中所述S2中柱温为35℃。
本发明中所述芦荟待测物为库拉索芦荟的制品。库拉索芦荟为百合科芦荟属植物,具有抗癌、消炎、杀菌、抗病毒、保肝及增强免疫等药理作用。
优选地,所述库拉索芦荟的制品为库拉索芦荟花干粉、库拉索芦荟全叶粉、库拉索芦荟精粉、芦荟全叶冻干粉、芦荟全叶烘干粉、200:1凝胶喷干粉、200:1凝胶冻干粉、库拉索芦荟药材粉、10:1食品级凝胶汁冻干粉、库拉索芦荟凝胶冻干粉、含黄色汁液的芦荟凝胶冻干粉、漂洗的库拉索芦荟凝胶冻干粉、未漂洗的库拉索芦荟凝胶冻干粉。
库拉索芦荟凝胶冻干粉为库拉索芦荟新鲜叶片去皮后,匀浆后过滤、真空冷冻干燥制成。
相比现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明的检测方法能使待测成分与相邻色谱峰达到基线分离的效果,方法的回收率高,重现性好。本发明的检测方法对芦荟苷和芦荟大黄素分别在0.375~75.000 ug/mL和0.130~52.000 ug/mL浓度范围内呈现良好的线性关系(r 2 > 0.9998),最低检测限(LOD)分别为0.080 ug/mL和0.010 ug/mL,待检测组分的日内及日间精密度RSD均小于4%。对芦荟苷的LOQ可以完全满足IASC对1·口服芦荟产品中芦荟苷的含量限定(10 ppm)的检测要求。本发明为芦荟产品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的质量控制提供了一种有效方法。
本发明采用高效液相色谱-二极管阵列检测器串联荧光检测器的方法,本方法能够使芦荟苷A和芦荟苷B的色谱峰被完全分离,可同时准确测定芦荟产品中的芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素。本发明测定芦荟样品中的芦荟苷是计算芦荟苷总量即应该是芦荟苷B和芦荟苷A含量的总和,真实客观地体现芦荟苷的量。
附图说明
图1为不同超声次数对芦荟苷和芦荟大黄素的提取率的影响;
图2为芦荟苷的紫外吸收图;
图3为芦荟大黄素的激发光谱和发射光谱图;
图 4为对照品(a)及库拉索芦荟全叶粉(b)的HPLC分析色谱图(a1和b1为DAD色谱图,a2和b2为FLD色谱图);
图5为芦荟苷A的回归曲线(a)和芦荟大黄素回归曲线(b);
图6为对比例1中芦荟苷的色谱图(a)和芦荟大黄素的色谱图(b)。
图7为对比例2中芦荟苷的色谱图(a)和芦荟大黄素的色谱图(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明,本发明实施例中采用的原料和方法为本领域常规市购的原料和常规使用的方法。
以下各个实施例中使用的相同的仪器和药品如下:
LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括SIL-20A自动进样器,LC-20AD二元泵,CTO-20A柱温箱,SPD-M20A二极管阵列检测器,RF-20A荧光检测器;
AB135-S型十万分之一天平(德国瑞士梅特勒公司);
乙腈(色谱纯,Burdick&Jackson,美国);
超纯水(PureLab Ultra超纯水系统,英国ELGA公司);
所有其他试剂均为分析纯(天津大茂化学试剂厂);
芦荟苷A标准品(成都曼思特生物科技有限公司,批号:MUST-12121804);
芦荟大黄素对照品(上海同田生物技术有限公司,批号:10081531);
库拉索芦荟全叶粉样品。
实施例1
一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,包括以下步骤:
S1. 待测液的制备和对照品溶液的制备:
分别精确称取适量的芦荟待测物于50 mL容量瓶中,精密加入50 mL甲醇超声30min提取待测成分,放至室温后补足损失的甲醇,经0.22 um微孔滤膜过滤,得到待测液。
分别精密称取适量芦荟苷A和芦荟大黄素对照品,加甲醇制成芦荟苷A浓度为75.000 ug/mL、芦荟大黄素浓度为52.000 ug/mL的对照品溶液储备液,进一步用甲醇配制成不同浓度梯度的对照品溶液。
S2. 含量的测定:
采用高效液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定S1中的待测液和对照品溶液,得到相应的峰面积;
采用色谱条件为:使用规格为250 mm×4.6 mm、5 µm 的Agilent TC-C18色谱柱;流动相为乙腈和超纯水;梯度洗脱程序为0−21 min,20%−26%乙腈、21−35 min,26%~45%乙腈、35−50 min,45%~55%乙腈;每次进样之间以初始流动相比例 平衡色谱柱10 min;柱温为35℃,进样量为20 μL,流速为1.0 mL/min;二极管阵列检测器的检测波长为356 nm;荧光检测器的检测波长为λex=428 nm,λem=520 nm。
S3. 含量的计算:
根据S2中得到的对照品溶液的峰面积或峰高绘制标准曲线,并根据标准曲线计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。
实验结果
(1)样品制备超声提取次数的考察
用甲醇对库拉索芦荟全叶粉超声提取一次,取20 μL样品溶液按S2的HPLC条件进样分析,转移第一次提取液,再用甲醇对样品进行第二次超声提取,取同样体积的提取液进高效液相色谱检测,结果见图1,纵坐标为峰面积。结果表明用甲醇超声一次即可较好的提取芦荟苷和芦荟大黄素。
(2)色谱条件及样品制备方法
波长的选择:分析芦荟苷的紫外光谱图(图2),观察其最大吸收波长,发现芦荟苷在356 nm处有较强的紫外吸收,封顶较平缓,故选择测定芦荟苷的波长为356 nm。芦荟大黄素本身有很强的荧光,用荧光分光光度计分别扫描激发光谱和发射光谱(图3),发现芦荟大黄素的最大激发波长λex = 428 nm,最大发射波长λem= 520 nm,故荧光检测器的λex和λem分别设定为428 nm和520 nm。
流动相:采用乙腈-水体系时,芦荟苷A和芦荟苷B有良好的分离以及芦荟大黄素峰型良好,洗脱时间较快,故选择乙腈-水体系进行洗脱。在该条件下,库拉索芦荟全叶粉及芦荟苷和芦荟大黄素对照品分离色谱图见图4。
发明人前期已对芦荟苷A和芦荟苷B色谱峰的进行了鉴别并制备了芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素标准样品。制备方法参考《李婷,钟英,王芝,万金志. 芦荟苷A、B以及异芦荟色苷D的同时分离纯化[J]. 天然产物研究与开发,2011,05:878-881》。
(3)系统适用性考察
由于库拉索芦荟全叶粉中成分复杂,干扰成分较多,因此选取批号为20061001的库拉索芦荟全叶粉作为方法学考察样品。取同一份库拉索芦荟全叶粉按色谱条件连续进样6次,计算理论塔板数、分离度和拖尾因子。实验结果表明,芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素与相邻成分分离良好,不受其他组分的干扰,色谱柱的理论塔板数、分离度、拖尾因子见表1。
表1 系统适用性结果
a 表示未检测到该成分
(4)标准曲线和线性范围
分别精密量取芦荟苷A、芦荟大黄素的对照品贮备液适量,制备系列浓度的对照品溶液。按S2的色谱条件分别对不同浓度的对照品溶液进行分析,每样重复三次,以峰面积值Y为纵坐标,对照品溶液浓度X(ug/mL)为横坐标,进行线性回归。芦荟苷A和芦荟大黄素的回归方程、线性范围、相关系数见表2和图5。检测限(LOD)和定量限(LOQ)是当信噪比(S/N) 分别为3和10时化合物的浓度(ug/mL)。该方法对芦荟苷的定量限为0.300 ug/mL,可以满足IASC对口服芦荟产品中芦荟苷的含量限定(10 ppm)的检测要求。
芦荟苷B含量的计算方法与芦荟苷A的计算方法相同,用由芦荟苷A对照品所得的回归方程Y = 27411X-407.61(其中Y为峰面积值,X为浓度(ug/mL)),计算出芦荟苷B的浓度值计算。
表2 芦荟苷A和芦荟大黄素标准曲线(n=3)
a Y为峰面积值,X为浓度(ug/mL);a和b分别是回归方程的斜率和截距。
(5)精密度
分别按表3所列,取低、中、高三个浓度的混合对照品溶液,精密吸取20 uL按S2的色谱条件进行分析。每个浓度日内测6次,连续测3天,计算RSD。结果表明,芦荟苷A和芦荟大黄素的日内及日间测定浓度的RSD小于4%,同时准确度在99.68-104.49%之间,表明测定方法的精密度符合要求。具体结果见表3。
表3 日内与日间精密度试验(n=6)
a 表示均值±标准差。
(6)重复性
取同一批库拉索芦荟全叶粉6份,按照S1中待测液的制备方法制备,按S2的HPLC条件测定供试品中芦荟苷和芦荟大黄素的峰面积,计算RSD。芦荟苷A和芦荟大黄素的保留时间和峰面积测定值的RSD均小于3%,表明测定方法的重复性良好,符合含量测定方法学要求,具体结果见表4。
表4 重复性试验结果(n=6)
(7)样品稳定性
取同一份库拉索芦荟全叶粉样品,按照S1的方法制备待测液。分别于0、2、4、6、8、10 h进样,按S2的方法测定供试品中三种待测成分的峰面积。经计算结果见表5,芦荟苷A和芦荟大黄素的保留时间和含量测定值RSD均小于2%,表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。
表5 稳定性试验结果(n=6)
(8)回收率试验
精密称取已知含量的库拉索芦荟全叶粉样品9份,精密加入低、中、高三个浓度的混合对照品溶液,每个浓度平行操作三份,按供试品溶液制备方法制得待测溶液,取20 uL进样分析,计算加样回收率和RSD值,结果见表6。芦荟苷A和芦荟大黄素的平均加样回收率在95.79~103.64%范围内,RSD值均小于5%,表明方法的准确度良好。
表6 回收率试验(n=3)
a 表示均值±标准差。
对比例1
本对比例采用甲醇-水体系作为流动相,其余条件均与实施例1相同。
实验结果如图6所示,采用甲醇-水体系作为流动相时,由于库拉索芦荟全叶粉中与芦荟苷A和B极性相似的成分较多,芦荟苷、芦荟大黄素不能得到基线分离,难与杂质分开,芦荟大黄素受样品基质影响导致峰型不佳,且洗脱时间超过90 min。可见,使用甲醇-水体系作为流动相无法准确检测芦荟苷A和B、芦荟大黄素的含量。
对比例2
本对比例采用乙腈-水体系作为流动相,但不采用梯度洗脱程序,洗脱采用浓度为25%的乙腈水溶液,其余条件均与实施例1相同。
实验结果如图7所示,采用乙腈水溶液作为流动相,在某些条件下可以实现芦荟苷A和芦荟苷B的分离,基线分离度较采用甲醇流动相好,但仔细比较,仍存在较多的杂质峰,并且对于芦荟苷B的峰型,依然容易与杂质峰发生重叠。因此,仍无法满足准确测量。同时,芦荟大黄素的出峰时间过程,无法实现同时快速检测芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素。
应用例1 库拉索芦荟的制品中各含量的测定结果
取19批库拉索芦荟的制品(见表7)按本发明中S1的待测液制备方法配制样品,每批平行操作3份,按S2的测定方法进行测定并按S3计算结果,测定结果见表8。另外,采用现有方法对这19批库拉索芦荟的制品进行了检测,同样测定结果见表8。
表7中库拉索芦荟的制品由中山大学万金志副教授鉴定,其中:
芦荟凝胶冻干粉的制备方法为:库拉索芦荟新鲜叶片去皮后,匀浆后过滤、真空冷冻干燥制成。
漂洗的库拉索芦荟凝胶冻干粉的制备方法为:取新鲜的库拉索芦荟叶片,滤去叶片切口渗出的黄色汁液,去皮,取凝胶部分漂洗干净,匀浆后过滤、真空冷冻干燥制成冻干粉。
未漂洗的库拉索芦荟凝胶冻干粉的制备方法为:取新鲜的库拉索芦荟叶片,滤去叶片切口渗出的黄色汁液,去皮,不经漂洗,匀浆后过滤、真空冷冻干燥制成。
含黄色汁液的芦荟凝胶冻干粉的制备方法为:取新鲜的库拉索芦荟叶片,直接去皮后,连同叶片切口渗出的黄色汁液一同匀浆,过滤、真空冷冻干燥制成。
表7库拉索芦荟的制品的批号与来源
表8 19批库拉索芦荟样品中芦荟苷和芦荟大黄素的含量
a 表示均值±标准差。
b 表示未检测到该成分。
从表8中可知,本发明方法可以同时检测各种库拉索芦荟制品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。
Claims (8)
1.一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,
采用色谱条件为:使用规格为250 mm×4.6 mm、5 µm 的Agilent TC-C18色谱柱;流动相为乙腈和超纯水;梯度洗脱程序为0至21 min,20%~26%乙腈、21至35 min,26%~45%乙腈、35至50 min,45%~55%乙腈;每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10 min;柱温为32~37℃,进样量为20 μL,流速为1.0 mL/min;二极管阵列检测器的检测波长为356 nm;荧光检测器的检测波长为λex=428 nm,λem=520 nm;
所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。
2.一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1. 按现有方法制备待测液与对照品溶液;
S2. 含量的测定:
采用高效液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定S1中的待测液和对照品溶液,得到相应的峰面积;
采用色谱条件为:使用规格为250 mm×4.6 mm、5 µm 的Agilent TC-C18色谱柱;流动相为乙腈和超纯水;梯度洗脱程序为0至21 min,20%~26%乙腈、21至35 min,26%~45%乙腈、35至50 min,45%~55%乙腈;每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10 min;柱温为32~37℃,进样量为20 μL,流速为1.0 mL/min;二极管阵列检测器的检测波长为356 nm;荧光检测器的检测波长为λex=428 nm,λem=520 nm;
S3. 根据S2中得到的待测液和对照品溶液的峰面积计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量;
所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。
3.根据权利要求2所述高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,S1为往芦荟待测物中加入甲醇,再经超声处理后过滤,得到待测液;分别往芦荟苷A和芦荟大黄素的对照品中加甲醇溶解,得到芦荟苷A和芦荟大黄素的对照品溶液。
4.根据权利要求2所述高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,S3为根据S2中得到的对照品溶液的峰面积绘制标准曲线,并根据标准曲线计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。
5.根据权利要求2所述高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,所述S1中超声处理的时间为30min,超声次数为1次。
6.根据权利要求2所述高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,所述S2中柱温为35℃。
7.根据权利要求1或2所述高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,所述库拉索芦荟的制品为库拉索芦荟花干粉、库拉索芦荟全叶粉、200:1芦荟凝胶喷干粉、库拉索芦荟药材粉、库拉索芦荟凝胶冻干粉。
8.根据权利要求7所述高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法,其特征在于,库拉索芦荟凝胶冻干粉为库拉索芦荟新鲜叶片去皮后,匀浆后过滤、真空冷冻干燥制成。
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