CN114660212B - 一种伤科灵喷雾剂hplc特征图谱的建立方法及其同时测定4个成分含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法及其同时测定4个成分含量的检测方法，本研究采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，建立了伤科灵喷雾剂的特征图谱，共有18个共有峰，通过特征图谱与对照品图谱的相关性对比，相似度均大于0.877，全面地反应制剂中的整体内在质量；并建立了同时测定苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶4种成分的含量测定方法。经方法学验证，该方法简便可行，同时具备了定性和定量的双重作用，为伤科灵喷雾剂的质量控制和研究奠定了一定基础。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法及其同时测定4个成分含量的检测方法。
背景技术
伤科灵喷雾剂为贵州省苗药特色产品，由抓地虎、白及、见血飞、马鞭草、仙鹤草、铁筷子、草乌、莪术、山豆根、三棱等10味药组成，具有清热凉血，活血化瘀，消肿止痛的作用，用于软组织损伤、骨伤、Ⅱ度烧烫伤，湿疹、疱疹，临床疗效确切。伤科灵喷雾剂现行法定质量标准收载于《国家药品监督管理局国家药品标准》(WS-10226(ZD-0226)-2002-2012Z-20180)[1]。原标准测定项中仅对苦参碱和氧化苦参碱2个成分进行含量测定研究，其现行标准过于简单，专属性不强，难以全面控制制剂的内在质量，确保其用药安全和有效性。且目前未见文献报道关于伤科灵喷雾剂质量标准的研究，其质量控制研究存在较大的空缺。中药成分复杂，由多味药材组成的成方制剂所含成分则更多，仅通过单一成分的含量测定对中药成方制剂进行质量控制存在较大的缺陷。多成分含量测定能够更好地反应成方制剂的内在质量。中药特征图谱是一种综合的、可量化的质量分析方法，具有整体性和模糊性的特点，能够综合地、特征地体现中药制剂的内在整体质量，在中药质量控制中具有广泛的作用[2]。
为了更好地控制伤科灵喷雾剂的制剂质量，发明团队经过大量的实验，用 HPLC法建立了伤科灵喷雾剂的特征图谱，并建立了同时测定苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶4个成分含量的质量标准。经方法学验证，该方法简便可行，同时具备了定性和定量的双重作用，为伤科灵喷雾剂的质量控制和研究奠定了一定基础。
发明内容
本发明的目的提供一种伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法。
本发明的另一目的提供一种同时测定伤科灵喷雾剂中4个成分含量的检测方法。
本发明所述药物由抓地虎、白及、见血飞、马鞭草、仙鹤草、铁筷子、草乌、莪术、山豆根、三棱组成；其特征在于所述HPLC特征图谱的建立方法包括以下步骤：
(1)精密量取伤科灵喷雾剂，制备得到伤科灵喷雾剂供试品溶液；
(2)分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成混合对照品溶液；
(3)分别取缺山豆根药材和缺铁筷子药材的伤科灵喷雾剂，制备各阴性样品溶液；
(4)将伤科灵喷雾剂供试品溶液、混合对照品溶液、阴性样品溶液、采用高效液相色谱仪分析，得到伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱。
优选的，
本发明所述的供试品溶液的制备方法为:精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理 30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
优选的，
本发明所述的混合对照品溶液的制备方法为:分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、 50μg/mL、50μg/mL的混合对照品溶液。
优选的，
本发明所述高效液相色谱仪分析的色谱条件与系统适应性试验为：色谱柱，色谱柱规格，4.6mm×250mm，5μm；流动相，以0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min， 5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min， 33％→90％B；流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温35℃；进样量10μL。
本发明所得的HPLC特征图谱中包含18个共有峰。
本发明所述的HPLC特征图谱中包含18个共有峰中，经过指认出4个共有峰，分别为：苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶。
本发明所述同时测定伤科灵喷雾剂4个成分含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1～3mL氨试液浸润，加三氯甲烷30～70mL，混匀，称重，超声处理20～30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.05～0.1％磷酸水溶液或0.2％三乙胺水溶液为流动相A，乙腈或甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min， 5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min， 33％→90％B；流速0.8～1.2mL·min-1，检测波长210nm，柱温25～35℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10uL注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
优选的，
本发明4个成分含量检测方法所述的供试品溶液的制备方法为:精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
优选的，
本发明4个成分含量检测方法所述的色谱条件与系统适应性试验为:色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min， 5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～ 60min，33％→90％B；流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温35℃。
本发明所述的伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法或同时测定伤科灵喷雾剂4个成分含量的检测方法在检测和鉴别山豆根药材和铁筷子药材中的应用。
本发明的有益效果
1、本研究采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，建立了伤科灵喷雾剂的特征图谱，共有18个共有峰，通过特征图谱与对照品图谱的相关性对比，对其中四个色谱峰进行了归属，并用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版) 进行相似度分析，16批制剂的相似度均大于0.877，表明16批制剂间相似度相对较高，建立的特征图谱能较全面地反应制剂中的整体内在质量；并建立了同时测定苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶4种成分的含量测定方法。经方法学验证，该方法简便可行，同时具备了定性和定量的双重作用，为伤科灵喷雾剂的质量控制和研究奠定了一定基础。
2、本发明HPLC特征图谱的测定方法通过了方法学考察，精密度试验结果显示，以东莨菪内酯峰为参照峰，各共有峰的相对保留时间的RSD均<1.44％，相对峰面积的RSD均<4.21％，表明仪器精密度良好；稳定性试验结果显示，供试品溶液在0、2、7、12、24h进样测定，各共有峰的相对保留时间的RSD均<1.71％，相对峰面积的RSD均<4.97％，表明供试品溶液在24h内稳定；重复性试验结果显示，同一供试品进校6份检测，各共有峰的相对保留时间的RSD均1.47％，相对峰面积的RSD均<6.77％，表明该方法重复性良好。
3、本发明还建立了利用HPLC法同时测定伤科灵喷雾剂的4个化学成分，经方法学考察，线性关系考察结果显示，苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶分别在10～160、10～160、2.5～40、2.5～40μg/mL范围内线性关系良好；稳定性试验结果显示，同一供试样品分别在0、2、7、12、24h进行测定，苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的RSD分别为1.0％、2.0％、1.0％、2.0％，结果表明供试品溶液在24h内稳定；重复性试验结果显示，同一批样品重复制备6份供试溶液进样，苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的含量分别为30.404、47.664、13.604、12.394μg/mL，RSD分别为1.79％、1.27％、1.36％、 1.59％，结果表明该方法重复性良好；加样回收率试验结果显示，苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的平均加样回收率(n＝6)分别为106.35％、107.11％、 95.66％、94.32％，RSD分别为1.87％、1.14％、1.87％、1.40％。结果表明该方法准确度良好。
4、本发明通过伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法或同时测定伤科灵喷雾剂4个成分含量测定方法，达到了控制原药材山豆根和铁筷子的目的，同时也为山豆根和铁筷子药材的进一步研究提供参考。
附图说明
图1伤科灵喷雾剂色谱柱选择特征HPLC图谱；
图2伤科灵喷雾剂流动相选择特征HPLC图谱；
图3伤科灵喷雾剂柱温选择特征HPLC图谱；
图4伤科灵喷雾剂流速选择特征HPLC图谱；
图5混合对照品专属性特征HPLC图谱(图谱中：1.苦参碱2.氧化苦参碱 3.东莨菪内酯4.异嗪皮啶)；
图6伤科灵喷雾剂专属性特征HPLC图谱(图谱中：1.苦参碱2.氧化苦参碱3.东莨菪内酯4.异嗪皮啶)；
图7铁筷子阴性制剂专属特征HPLC图谱(图谱中：1.苦参碱2.氧化苦参碱3.东莨菪内酯4.异嗪皮啶)；
图8山豆根阴性制剂专属特征HPLC图谱(图谱中：1.苦参碱2.氧化苦参碱3.东莨菪内酯4.异嗪皮啶)；
图9HPLC特征图谱共有模式和对照特征图谱(图谱中：1.苦参碱2.氧化苦参碱3.东莨菪内酯4.异嗪皮啶；R.对照特征图谱)。
具体实施方式
实施例1 HPLC特征图谱
(1)精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
(2)分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL的混合对照品溶液。
(3)分别取缺山豆根药材和缺铁筷子药材的伤科灵喷雾剂，按照(1)制备各阴性样品溶液；
(4)色谱条件与系统适应性试验为：色谱柱，色谱柱规格，4.6mm×250mm，5μm；流动相，以0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B； 30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温35℃；进样量10μL，得到伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱。
实施例2含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～ 33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例3含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.2％三乙胺水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～ 33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例4含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加3mL氨试液浸润，加三氯甲烷30mL，混匀，称重，超声处理20min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.05％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～ 33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速0.8mL·min-1，检测波长210nm，柱温25℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例5含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加3mL氨试液浸润，加三氯甲烷30mL，混匀，称重，超声处理20min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.1％三乙胺水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速0.8mL·min-1，检测波长210nm，柱温25℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例6含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加2mL氨试液浸润，加三氯甲烷50mL，混匀，称重，超声处理25min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.08％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～ 33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1.2mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例7含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加2mL氨试液浸润，加三氯甲烷50mL，混匀，称重，超声处理25min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.3％三乙胺水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～ 33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1.2mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例8含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷40mL，混匀，称重，超声处理23min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.06％磷酸水溶液为流动相A，乙腈流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～ 33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速0.9mL·min-1，检测波长210nm，柱温28℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例9含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷40mL，混匀，称重，超声处理23min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.15％三乙胺水溶液为流动相A，甲醇为流动相 B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速0.9mL·min-1，检测波长210nm，柱温28℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10ul注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例10含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加3mL氨试液浸润，加三氯甲烷60mL，混匀，称重，超声处理28min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.06％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10uL注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实施例11含量测定
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤科灵喷雾剂5mL，水浴蒸发除去溶剂，加3mL氨试液浸润，加三氯甲烷60mL，混匀，称重，超声处理28min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL 的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：色谱柱规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：以0.25％三乙胺水溶液为流动相A，甲醇为流动相 B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B； 30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B；流速1mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃；
(4)测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液10uL注入高效液相色谱仪中测定，采用外标法计算苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量。
实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：
1仪器与试剂、对照品
1.1仪器：
UltiMate 3000型高效液相色谱仪，配备四元泵、进样器、柱温箱、紫外检测器(美国Thermo Fisher Scientific公司)，DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，ME104/02型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HB ECO S096型旋转蒸发仪(德国艾卡公司)，UPW-UP-10型纯水仪(成都天莘宁科技有限公司)。
1.2试剂：
乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，其余试剂均为分析纯。
1.3对照品及样品
对照品苦参碱(批号wkq21030302，含量≥98％)购自成都彼样生物科技有限公司，氧化苦参碱(批号GR-133-151-19，含量≥98％)购自南京广润生物制品有限公司、东莨菪内酯(批号CHB201202，含量≥95％)、异嗪皮啶(批号，含量≥95％)均购自成都克洛玛生物科技有限公司；编号为S1～S10的10批伤科灵喷雾剂均由贵州恒霸药业有限公司提供，规格：50mL/瓶，70mL/瓶，100mL/瓶，批号分别为15120102、15120201、15090102、15090202、18110503、19030103、 19050102、19060101、19080202、19080402、20120101、20120102、20120103、 21110101、21110102、21110103，山豆根阴性制剂、铁筷子阴性制剂由实验室按制剂工艺自制得到。
2伤科灵喷雾剂特征图谱方法的建立
2.1方法分析及来源
本品有十味药材组成，成分较复杂，原质量标准中测定了苦参碱和氧化苦参碱的含量，来源于本制剂中的山豆根药材，具有清热、解毒、消炎、止痛、利咽的功效[3]。制剂中的铁筷子为苗药习用药材，具清热解毒、活血散淤、消肿止痛之功效，其中的东莨菪内酯为铁筷子的主要活性及质量控制标志成分[4,5]，另有研究表明异嗪皮啶具有清热解毒、抗菌抗炎、祛风除湿、活血散瘀等功效，对治疗肺癌和直肠癌等一些肿瘤有明显效果[6-8]，因此，本次实验选择这四个成分进行含量测定。
根据《中国药典》(2020年版)[9]及相关文献报道[10,11]，结合二极管阵列检测器进行全波长扫描(190～400nm)结果，采用HPLC梯度洗脱法，根据各测定成分的光谱图，苦参碱与氧化苦参碱的最大吸收峰在分别在200.68和201.17nm，东莨菪内酯和异嗪皮啶的最大吸收峰在203.81和207.48nm处，四种成分在210 nm左右均有吸收，为减少在洗脱过程中变换波长引起基线漂移选择210nm作为检测波长。结果表明，210nm检测波长处各目标色谱峰均有较好吸收，且峰形和分离度较好，故选择210nm作为检测波长。再通过查阅相关文献资料和多次考察的结果，暂定伤科灵喷雾剂的特征图谱建立方法为：
混合对照品溶液分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱各5mg，东莨菪内酯、异嗪皮啶各0.5mg于5mL容量瓶，加适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得质量浓度为1mg/mL的苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液，质量浓度为0.5mg/mL 的东莨菪内酯、异嗪皮啶对照品储备液。分别精密量取苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液1mL，东莨菪内酯、异嗪皮啶对照品储备液0.5mL于5mL容量瓶，甲醇定容至刻度，摇匀，得苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶浓度分别为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL的混合对照品溶液，保存于4℃冰箱。
供试品溶液精密量取本品5mL，水浴蒸发除去溶剂，加3mL氨试液浸润，加甲醇50mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
阴性样品溶液按制剂处方比例及制备工艺，分别制备缺山豆根药材的阴性样品及缺铁筷子药材的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成各阴性样品溶液，即得。
色谱条件与系统适用性
采用(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇(B)-0.1％磷酸水溶液(A)为流动相，梯度洗脱(0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B；30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B)，流速 1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温30℃，进样量10μL。在上述色谱条件下，混合对照品及样品中苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶四个成分的理论塔板数均大于10000，各成分分离度均大于1.5。
2.2供试品溶液制备方法考察
2.2.1提取溶剂种类的考察
精密量取本品5mL，按“2.1”项下的方法检测，分别对70％甲醇、95％甲醇、甲醇、乙醇和三氯甲烷提取样品进行考察(加一定量氨水)进行考察，优选出最佳提取溶剂。结果见表1，仅三氯甲烷将苦参碱提取出来，其余四种溶剂都没有提取出苦参碱，故选择三氯甲烷作为提取溶剂。
表1不同提取溶剂对四种成分含量的影响
2.2.2提取溶剂用量的考察
精密量取本品5mL，用确定三氯甲烷作提取溶剂，按“2.1”项下的方法检测，分别对提取溶剂用量为30mL、40mL、50mL和70mL等进行考察，优选出最佳的提取溶剂用量。结果见表2，溶剂用量为70mL时，四种成分含量均最高，故选择70mL作为提取溶剂的量。
表2不同用量提取溶剂对四种成分含量的影响
2.2.3氨水用量的考察
精密量取本品5mL，按“2.1”项下的方法检测，分别对氨水用量1mL、2mL、 3mL进行考察，结果见表3，东莨菪内酯和异嗪皮啶在氨水用量为2mL和3mL 中提取量相对较于1mL较低，通过显著性差异分析，1m和2mL对比，东莨菪内酯成分减少了将近一半，因此最终选择了1mL作为氨水用量。
表3不同氨水用量对四种成分含量的影响
2.2.4供试品溶液制备方法优选结果
精密量取本品5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷 70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，
取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3色谱条件与系统适用性的考察
2.3.1色谱柱的考察
取按“2.2.4”项下制备的供试品溶液，按“2.1”项下的方法检测，分别对Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)、(4.6mm×250mm，5μm)、(4.6mm×250mm，5μm)3个不同的色谱柱进行考察，优选出最佳的色谱柱。结果见图1，/>色谱柱对伤科灵喷雾剂样品有较好的分离效果，选用色谱柱。
2.3.2不同流动相考察
取按“2.2.4”项下制备的供试品溶液，以为色谱柱，按“2.1”项下的方法检测，流动相分别考察乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％三乙胺水溶液、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水系统，结果见图2，以乙腈-0.1％磷酸水系统洗脱可使伤科灵喷雾剂样品得到较好的分离。
2.3.3柱温的选择
取按“2.2.4”项下制备的供试品溶液，以为色谱柱、以乙腈-0.1％磷酸为流动相，按“2.1”项下的方法检测，分别考察25℃、30℃、35℃几种不同的温度，优选出最佳的柱温。结果见图3，35℃下出峰较快，且异嗪皮啶的分离效果相对30℃和25℃更好，故选择35℃作为柱温。
2.3.4流速的选择
取按“2.2.4”项下制备的供试品溶液，以为色谱柱、以乙腈-0.1％磷酸为流动相，以柱温为35℃，按“2.1”项下的方法检测，分别考察 0.8mL·min-1、1.0mL·min-1、1.2mL·min-1几种不同的流速，优选出最佳的流速。结果见图4，三个流速下样品洗脱效果相似，随着流速加快而保留时间相应延后，选择1.0mL·min-1。
2.3.5色谱条件与系统适用性考察的优选结果
采用(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以乙腈(B)-0.1％磷酸水溶液(A)为流动相，梯度洗脱(0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B； 30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B)，流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温35℃，进样量10μL。在上述色谱条件下，混合对照品及样品中苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶四个成分的理论塔板数均大于10000，各成分分离度均大于1.5。
2.4特征图谱建立的确定
混合对照品溶液分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱各5mg，东莨菪内酯、异嗪皮啶各0.5mg于5mL容量瓶，加适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得质量浓度为1mg/mL的苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液，质量浓度为0.5mg/mL 的东莨菪内酯、异嗪皮啶对照品储备液。分别精密量取苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液1mL，东莨菪内酯、异嗪皮啶对照品储备液0.5mL于5mL容量瓶，甲醇定容至刻度，摇匀，得苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶浓度分别为200μg/mL、200μg/mL、50μg/mL、50μg/mL的混合对照品溶液，保存于4℃冰箱。
供试品溶液精密量取本品5mL，水浴蒸发除去溶剂，加1mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
阴性样品溶液按制剂处方比例及制备工艺，分别制备缺山豆根药材的阴性样品及缺铁筷子药材的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成各阴性样品溶液，即得。
色谱条件与系统适用性
采用(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以乙腈(B)-0.1％磷酸水溶液(A)为流动相，梯度洗脱(0～10min，5％B；10～30min，5％→25％B； 30～33min，25→33％B；33～45min，33％B；45～60min，33％→90％B)，流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温35℃，进样量10μL。在上述色谱条件下，混合对照品及样品中苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶四个成分的理论塔板数均大于10000，各成分分离度均大于1.5。
2.5特征图谱建立的方法学考察
2.5.1专属性试验
按“2.4”项下的测定方法，吸取混合对照品溶液、供试品溶液以及分别缺山豆根、缺铁筷子各阴性样品溶液进样，记录色谱图，结果见图5，图6，图7，图8，阴性样品溶液色谱图中相应位置上无干扰峰出现。
2.5.2精密度试验
精密称取编号为S7(批号19080402)的伤科灵喷雾剂5mL，按“2.4”项下的测定方法，制备同一供试品溶液，连续进样测定6次，记录各共有峰的保留时间及峰面积。以分离度较好，峰面积大，为各批样品共有的东莨菪内酯峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均<1.44％，相对峰面积的RSD均<4.21％，表明仪器精密度良好。
2.5.3稳定性试验
称取编号为S7(批号19080402)的伤科灵喷雾剂5mL，按“2.4”项下的测定方法，制备供试品溶液，分别在0、2、7、12、24h进样测定，记录各共有峰的保留时间及峰面积。以东莨菪内酯峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均<1.71％，相对峰面积的RSD均<4.97％，表明供试品溶液在24h 内稳定。
2.5.4重复性试验
称取编号为S7(批号19080402)的伤科灵喷雾剂5mL，平行6份，分别按“2.4”项下的测定方法，制备供试品溶液进样测定，记录各共有峰的保留时间及峰面积。以东莨菪内酯峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD 均1.47％，相对峰面积的RSD均<6.77％，表明该方法重复性良好。
2.5.5特征图谱的建立及共有峰指认
按“2.4”项下方法，制备编号为S1～S10的16批样品的供试品溶液进样，记录色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)。选取S10样品的色谱图为参照图谱，生成伤科灵喷雾剂的对照特征图谱，16批伤科灵喷雾剂的HPLC特征图谱匹配图。共确认18个共有峰，指认出4个色谱峰，以东莨菪内酯峰为参照峰，计算S1～S16号样品的特征图谱与对照特征图谱的相似度，结果分别为0.906、0.877、0.951、0.976、0.976、0.909、0.979、0.880、0.980、 0.983、0.968、0.972、0.973、0.980、0.981、0.988，均大于0.877。结果见表4、图9。
表4伤科灵喷雾剂特征图谱相似度分析结果
2.6伤科灵喷雾剂的4个成分含量测定
2.6.1线性关系考察
按“2.4”项下方法测定，精密吸取混合对照品溶液50、100、200、400、600、800μL稀释到1mL，以质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶回归方程分别为： Y＝0.1204X+0.9178(r2＝0.999)、Y＝0.1335X+0.9006(r2＝0.9991)、 Y＝1.3443X-0.2126(r2＝1.000)、Y＝1.6555X-0.1477(r2＝0.999 9)。结果表明，苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶分别在10～160、10～160、2.5～40、 2.5～40μg/mL范围内线性关系良好。
2.6.2精密度试验
按“2.4”项下方法测定，分别精密吸取同一混合对照品溶液10μL，重复进样6次，记录峰面积。按峰面积计算，结果苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的RSD分别为1.0％、2.0％、0.30％、1.0％、1.0％，结果表明仪器精密度良好。
2.6.3稳定性试验
取批号为190601015的伤科灵喷雾剂5mL，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件分别在0、2、7、12、24h进行测定，记录峰面积。按峰面积计算，结果苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的RSD分别为1.0％、2.0％、1.0％、2.0％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
2.6.4重复性试验
取同一批号伤科灵喷雾剂样品6份，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件分析，记录峰面积，计算含量及RSD。结果苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的含量分别为30.404、47.664、13.604、 12.394μg·mL-1，RSD分别为1.79％、1.27％、1.36％、1.59％，结果表明该方法重复性良好。
2.6.5加样回收率试验
取同一批号已知含量的伤科灵喷雾剂6份，每份2.5mL，分别加入混合对照品溶液(含77.6μg·mL-1苦参碱、284.5μg·mL-1氧化苦参碱、36μg·mL-1东莨菪内酯、32.3μg·mL-1异嗪皮啶1mL，按“2.4”项下方法制备供试溶液，按“2.4”项下色谱条件进样分析，分别计算各成分的平均加样回收率及RSD。结果苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶的平均加样回收率(n＝6)分别为106.35％、 107.11％、95.66％、94.32％，RSD分别为1.87％、1.14％、1.87％、1.40％。结果表明该方法准确度良好。
2.6.6样品含量测定
取16批伤科灵喷雾剂样品，按“2.4”项下方法测定，采用外标法计算含量，结果见表5。
表5伤科灵喷雾剂4个成分含量测定结果(μg·mL-1，n＝3)
3讨论
本文采用HPLC法对16批伤科灵喷雾剂进行了特征图谱研究，同时对制剂中所含的苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶进行了含量测定。特征图谱研究结果显示，不同批次制剂共确认出18个共有峰。4种成分含量测定结果显示，不同批次的成分含量有差异，且各成分之间的含量差异程度不同，这可能与制剂原药材来源于不同批次，药材生长的气候、环境不同所致其中的成分含量不同有关。
4结论
综上所述，本研究采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，建立了伤科灵喷雾剂的特征图谱，共有18个共有峰，通过特征图谱与对照品图谱的相关性对比，对四个色谱峰进行了归属，并用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012 版)进行相似度分析，16批制剂的相似度均大于0.877，表明16批制剂间相似度相对较高，建立的特征图谱能较全面地反应制剂中的整体内在质量；并建立了同时测定苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶4种成分的含量测定方法。经方法学验证，该方法简便可行，同时具备了定性和定量的双重作用，为伤科灵喷雾剂的质量控制和研究奠定了一定基础。
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虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法，所述伤科灵喷雾剂由抓地虎、白及、见血飞、马鞭草、仙鹤草、铁筷子、草乌、莪术、山豆根、三棱组成；其特征在于所述HPLC特征图谱检测方法包括以下步骤：
（1）精密量取伤科灵喷雾剂，制备得到伤科灵喷雾剂供试品溶液；
（2）分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成混合对照品溶液；
（3）分别取缺山豆根药材和缺铁筷子药材的伤科灵喷雾剂，制备各阴性样品溶液；
（4）将伤科灵喷雾剂供试品溶液、混合对照品溶液、阴性样品溶液、采用高效液相色谱仪分析，得到伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱；
所述的供试品溶液的制备方法为:精密量取伤科灵喷雾剂5 mL，水浴蒸发除去溶剂，加1 mL氨试液浸润，加三氯甲烷70mL，混匀，称重，超声处理30min，放置至室温，三氯甲烷补足减失重量，取三氯甲烷层，旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22µm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
所述的混合对照品溶液的制备方法为:分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶，加甲醇制成浓度依次为200 µg/mL、200 µg/mL、50 µg/mL、50µg/mL的混合对照品溶液；
所述高效液相色谱仪分析的色谱条件与系统适应性试验为：色谱柱，Ultimate®XB-C18；色谱柱规格，4.6 mm×250 mm，5 µm；流动相，以0.1%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～10min，5%B；10～30min，5%→25%B；30～33min，25→33%B；33～45min，33%B；45～60min，33%→90%B；流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，柱温35℃；进样量10μL；
所得的HPLC特征图谱中包含18个共有峰；所述的HPLC特征图谱中包含18个共有峰中，经过指认出4个共有峰，分别为：苦参碱、氧化苦参碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶。
2.根据权利要求1所述的伤科灵喷雾剂HPLC特征图谱的建立方法在检测和鉴别山豆根药材和铁筷子药材中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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