CN104458928A - 一种广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱检测技术及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种中药提取物广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊的指纹图谱检测技术及其指纹图谱的构建方法。包括用溶剂提取制备广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液液相色谱指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(V2.0)，计算广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊供试液指纹图谱的相似度，依据指纹图谱相似度应大于0.90，从而达到控制广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术对广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药提取物及中药制剂生产质量的关键技术。

Description

一种广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱检测技术及其应用

技术领域

本发明涉及一种中药材提取物和胶囊的指纹图谱检测技术及其指纹图谱的构建方法。

背景技术

广升麻又称广东升麻，是广东省做升麻入药的地方习用品种，而且在广东历年有出口外销。始载于《广东中药》，谓：“发痘疹，解毒”；以根条粗长，表面黑褐色，断面蓝紫色，质坚实，不带芦头，无须根者为佳。《广东中药》记载：广升麻“断面近栓皮处之皮部绿色者优，但不多见”。本品为菊科植物麻花头Serratula chinensis S.Moor的干燥块根。夏、秋季采挖，去净浮芦头及须根，烘干或晒干。本品呈长纺锤形，稍扭曲，两端稍尖、中部稍粗，长10-20cm，直径0.5-1cm，表面灰黄色、棕褐色或黑褐色，有粗纵皱纹和少数须根痕。质坚硬而脆，易折段。断面暗灰色或灰黄色，略呈角质状。气特殊；味淡，微苦涩。功能与主治是升阳、散风、解毒、透疹。用于风热头痛，咽喉肿痛，斑疹不透，中气下陷，久泻脱肛，子宫下坠。广升麻已收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药材第一册第7页及广东省中药材标准(2011年)37页。

广升麻总甾酮是从广升麻中提取的总甾酮类有效部位，按干燥品计算，含蜕皮甾酮(C₂₇H₄₄O₇)应不低于50.0％。；含总甾酮按蜕皮甾酮(C₂₇H₄₄O₇)计，应为65.0-95.0％。广升麻总甾酮胶囊是广升麻总甾酮提取物制成的胶囊。规格有10mg和5mg两个规格。用途：活血祛瘀，通脉活络，用于中风中经络症，用于脑卒中恢复期治疗。

中药成分复杂，以某一成分作为控制指标已经不适合中药质量控制的要求。中药指纹图谱鉴别是借用了法医学的指纹鉴定的概念，其应用解决了中药中成分复杂、有效成分不明的检测和证明产品批间质量的稳定性的问题，为中药质量的控制提供了一种较好的方法。为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控、中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。2000年8月国家药品监督管理局颁布《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)。国家药典委员会也于2002年4月制定了《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》。

目前对于广升麻的化学成分文献报道主要成分为蜕皮甾酮类化合物，主要有20-羟基蜕皮松(1)，podecdysone C(2)，3-氧-乙酰基-20-羟基蜕皮松(3)，20-羟基蜕皮松-20，22-缩丁醛(4)，shidasterone(5)，atrotosterone C(6)和carthamosterone(7)。关于广升麻质量标准的研究的报道主要是对于其蜕皮甾酮成分的含量的测定及限度的规定。目前尚无广升麻、广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊的指纹图谱研究的报道。

广升麻总甾酮胶囊活血祛瘀，通脉活络，用于中风中经络症，用于脑卒中恢复期治疗。动物药理和临床试验证实，本产品能有效促进脑部急慢性缺血后的神经恢复，抗血小板聚集，降低梗塞率。因此为便于广升麻总甾酮胶囊的质量管理，确保其质量稳定、可控，应该利用现代的分析技术更进一步的规范其质量。

因此，基于对广升麻总甾酮及其它制剂的质量的稳定、可控，结合高效液相色谱指纹图谱技术及有关对指纹图谱研究的技术要求和指南，探索了包括广升麻总甾酮、广升麻总甾酮胶囊的指纹图谱检测技术，包括将样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液的高效液相色谱指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(V2.0)(国家药典委员会)，计算广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的相似度。进而获得指纹图谱相似度数值，从而达到控制广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术对广升麻、广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药制剂生产质量的关键技术。

发明内容

广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊是广升麻药材中提取的总甾酮类有效部位，按干燥品计算，含蜕皮甾酮(C₂₇H₄₄O₇)应不低于50.0％。；含总甾酮按蜕皮甾酮(C₂₇H₄₄O₇)计，应为65.0-95.0％。通过对蜕皮甾酮的全波长扫描研究在243nm处有最大吸收。

本发明的指纹图谱检测技术，包括将样品用溶剂提取制备样品的供试品溶液，在一定的色谱条件下测试供试品试液的指纹图谱，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机辅助相似度评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(V2.0)，(国家药典委员会)，计算指纹图谱相似度，获得指纹图谱相似度数值。依据相似度数值，将指纹图谱检测技术用于广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊的质量控制。

供试液的制备方法：取广升麻总甾酮样品适量，精密称定用45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每1mL含600μg的溶液滤过，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得广升麻总甾酮供试液。取广升麻总甾酮胶囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置25ml量瓶中，加45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得广升麻总甾酮胶囊供试液。

所使用的一定的色谱条件包括如下因素：色谱柱；流动相；线性梯度洗脱程序；柱温：35℃；流速：1.0ml/min，紫外检测器；检测波长为243nm；进样量：20μl；运行60min。

对照指纹图谱的获取方法为13批广升麻总甾酮、10批广升麻总甾酮胶囊、按上述供试液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件获得高效液相色谱指纹图谱，用指纹图谱相似度软件分别对13批广升麻总甾酮、10批广升麻总甾酮胶囊指纹图谱进行分析得广升麻对照图谱、广升麻总甾酮对照图谱、广升麻总甾酮胶囊对照图谱。

色谱柱选用的是十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，选用的是Agilent ZORBAXSB-AQ柱。流动相，乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系。线性梯度洗脱程序。

经过研究，采用了如下的供试品溶液的制备方法：广升麻总甾酮供试液：取广升麻总甾酮提取物样品适量，精密称定用45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每1mL含600μg的溶液滤过，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。广升麻总甾酮胶囊供试液：取本品胶囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置25ml量瓶中，加45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。

经过研究，采用了如下的色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系，线性梯度洗脱程序：0～5min10％～15％乙腈；5～20min15％～19％乙腈；20～30min19％乙腈；30～40min19％～35％乙腈；40～50min35％～80％乙腈；50～60min80％乙腈。柱温35℃；流速1.0ml/min；紫外检测器检测；检测波长为243nm；进样量：20μl；运行60min。13批广升麻总甾酮、10批广升麻总甾酮胶囊样品的指纹图谱，用相似度软件进行分析，以该平均指纹图谱为对照指纹图谱。在此条件下获取广升麻总甾酮、广升麻总甾酮胶囊的对照指纹图谱见图1-2

通过研究表明，广升麻总甾酮对照图谱具有9个特征峰，图谱总长度为60min，广升麻总甾酮胶囊对照图谱具有9个特征峰，图谱总长度为60min；广升麻总甾酮峰3、广升麻总甾酮胶囊峰3均为蜕皮甾酮峰。

应用本发明，我们按合格产品的指纹图谱相似度大于0.90为检验质控标准，将广升麻总甾酮、广升麻总甾酮胶囊的生产检验质量控制，所得产品质量稳定可靠，真正实现了产品质量的稳定可控。

广升麻总甾酮、广升麻总甾酮胶囊的指纹图谱分析方法的建立及质量稳定性评价的具体情况如下：

1.1仪器与试剂

仪器：Agilent1100高效液相色谱仪，Agilent1100紫外检测器，工作站：Chem station forLC，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)

试剂：乙腈为色谱纯(product of Tedia，USA)，其它试剂均为分析纯，水为哇哈哈引用纯净水。

广升麻总甾酮(江苏柯菲平医药有限公司，批号：090101、090201、090202、0901、0902、111101、111102、111201、111202、S13-130101-M、S13-130102-M、S13-130201-M、S13-130202-M)

广升麻总甾酮胶囊(江苏柯菲平医药有限公司，批号：090301、090302、090303、09001、10001、111201、S13-130301、S13-130302、S13-130303、S13-130304)

1.2色谱条件优化

1.2.1流动相梯度的选择

选用了Aglient ZORBAX SB-AQ柱；流速：1.0ml/min；因蜕皮甾酮的最大吸收波长在243nm，故本实验检测波长暂定在243nm；柱温暂定35℃；进样量：20μl；考查了多种梯度洗脱条件，实验过程中共选择了4种流动相系统：

(1)甲醇：水梯度洗脱

表1 广升麻指纹图谱流动相梯度

(2)甲醇：0.1％醋酸水溶液梯度洗脱如下

表2 广升麻指纹图谱流动相梯度

(3)乙腈：水梯度洗脱

表3 广升麻指纹图谱流动相梯度

(4)乙腈为流动相A，以乙腈-0.04mol/L磷酸氢二钠溶液(5：95)混合溶液(用磷酸调pH值为3.0)为流动相B，梯度洗脱

表4 广升麻指纹图谱流动相梯度

结果表明，第一、第二、三种梯度洗脱条件下，蜕皮甾酮的峰型不好，不易达到基线分离；第四种梯度洗脱系统，色谱图中各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，综合广升麻药材情况选此流动相系统作为广升麻药材HPLC指纹图谱检测的流动相。见附图3。

1.2.2检测波长的选择

对蜕皮甾酮对照品、广升麻总甾酮和和广升麻总甾酮胶囊按照供试品制备的方法制备供试品，进行紫外波长扫描，结果是均在243±2nm处有最大吸收波长，故选指纹图谱的吸收波长为243nm，结果见附图4。以选定的色谱条件分别得到广升麻总甾酮和和广升麻总甾酮胶囊的色谱图，以兼顾各峰为原则，选取检测波长。试验过程中共选择了200nm、243nm、254nm、326nm、403nm五种波长，得出HPLC图。结果，243nm处蜕皮甾酮吸收值最大，广升麻药材信息较为全面；254nm处峰仅次于243nm处；在200nm处峰数多，且杂乱；在326nm、403nm处峰较少；故选指纹图谱的检测波长为243nm。见附图5-6。

1.2.3流动相不同流速的考察

在色谱条件考察过程中，发现供试品不同流速对出峰的保留时间有影响，因此分别考察了流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的出峰情况，其结果流速为1.0ml/min的峰的分离度较好，综合考虑最终选择流速为1.0ml/min作为指纹图谱研究的条件。具体色谱图见附图7-8。

1.2.4柱温的选择

在色谱条件考察过程中，发现柱温对蜕皮甾酮保留时间有影响，因此分别考察了30℃、35℃和40℃下样品的出峰时间。见附图9-10。结果：柱温升高，柱压下降，色谱峰的保留时间整体往前移动。色谱峰的分离度也稍有改善，但无显著差异。柱温升高，柱压下降，有利于色谱柱的保护，但柱温过高，对色谱柱中填料会有不利影响也亦引起样品中不稳定成分的变化，综合考虑各方面的因素，最后选择在35℃下进行指纹图谱的检查。

1.2.5不同流动相pH值考察在色谱条件考察过程中，发现pH值对峰保留时间及峰面积有影响，因此分别考察了pH值为2.8、3.0、3.2下样品的出峰情况，综合考虑，最后选择在pH值为3.0下进行指纹图谱的检查。见附图11-12。

1.2.6空白溶剂及样品2小时图

根据有关要求，采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，应提供2小时的记录图，以考察1小时后的色谱峰情况。其结果是1小时后未出现其它色谱峰。为考察溶剂空白对指纹图谱的影响，进行了空白溶剂2小时的指纹图谱研究，其结果是空白溶剂对指纹图谱无影响。结果见图13。

1.2.7指纹图谱峰的指认

根据现有文献的报道及前期的实验结果，对指纹图谱的峰进行指认。取蜕皮甾酮对照品，用甲醇溶解后按照指纹图谱方法进样。研究表明广升麻总甾酮峰3、广升麻总甾酮胶囊峰3、。结果见图14。

1.2.8梯度滞后时间考查

由于不同仪器的梯度滞后时间的不同，可能影响方法的重现性，因此提供本试验所用仪器的梯度滞后时间，以做参考。

方法可用一零死体积连接器代替色谱柱，以甲醇为溶剂A，含0.1％丙酮的甲醇为溶剂B，检测波长为260nm，运行0-100％B的线性梯度，梯度时间20分钟，流速1.0ml/min，记录梯度图形，测定梯度曲线中间点的时间，减去10分钟，即得。

结果梯度滞后时间的色谱图见附图，结果见表5。

表5 梯度滞后时间

1.3供试品制备方法的优化

1.3.1广升麻总甾酮提取方法的选择

广升麻总甾酮是广升麻的提取物，在供试品制备过程中精密称定用45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每1mL含600μg的溶液滤过，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

HPLC分析结果表明，该制备方法较为简便，且重现性好，与提取物及制剂指纹图谱间的相关性良好。

1.3.2广升麻总甾酮胶囊的提取方法选择

广升麻总甾酮胶囊是广升麻总甾酮加入其它辅料制成的胶囊，在供试品的制备过程中考察了2分钟、5分钟、10分钟、30分钟及60分钟超声处理对供试品的影响，结果5分钟后广升麻总甾酮完全被提取到供试品溶液中，综合考虑因此选择超声处理(功率300W，频率50kHz)10分钟。作为供试品制备时间。最终供试品的制备方法为：取广升麻总甾酮胶囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置25ml量瓶中，加45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得广升麻总甾酮胶囊供试液。

1.4广升麻总甾酮指纹图谱方法论证

1.4.1广升麻总甾酮精密度试验

取批号为0901的供试品，连续进样5次，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积。以蜕皮甾酮的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积。结果见下表

表6广升麻总甾酮指纹图谱精密度试验结果(相对峰面积)

表7广升麻总甾酮指纹图谱精密度试验结果(相对保留时间)

结果显示，样品共有峰的相对保留时间相对标准偏差均小于0.2％，相对积分面积的相对标准偏差小于3.0％。表明，本方法具有较好的精密度，仪器等整个检测系统的精密度良好。叠加色谱图见附图16。

结果表明，本方法具有较好的精密度，仪器等整个检测系统的精密度良好。

1.4.2广升麻总甾酮稳定性试验

取批号为0901的广升麻总甾酮提取物制备供试品，分别在0h，1h，3h，6h，10h，42h进样，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积。以蜕皮甾酮的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积。

表8广升麻总甾酮指纹图谱稳定性试验结果(相对峰面积)

表9广升麻总甾酮指纹图谱稳定性试验结果(相对保留时间)

结果显示，样品在42h内稳定，共有峰的保留时间和积分面积基本一致，相对保留时间相对标准偏差均小于0.2％，相对峰面积的相对标准偏差均小于3.0％。叠加色谱图见附图10-1-24～28，叠加色谱图见下附图17。

结果表明，制备样品稳定性较好，常温下42h内也能保持较好的稳定性。

1.4.3广升麻总甾酮重现性试验

取批号为0901的广升麻总甾酮提取物供试品5份，按上述方法进行制备并进行检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性。

表11广升麻总甾酮指纹图谱重现性试验结果(相对峰面积)

表12广升麻总甾酮指纹图谱重现性试验结果(相对保留时间)

结果显示，所考察的共有峰的相对保留时间及相对峰面积具有较好的重现性，其中相对峰面积相对标准偏差小于3.0％，相对保留时间的相对标准偏差小于0.2％。叠加色谱图见附图18。

1.5广升麻总甾酮胶囊指纹图谱方法论证

1.5.1广升麻总甾酮胶囊精密度试验

取批号为09001的供试品，连续进样5次，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积。以蜕皮甾酮的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积。结果见下表

表13广升麻总甾酮胶囊指纹图谱精密度试验结果(相对峰面积)

表14广升麻总甾酮胶囊指纹图谱精密度试验结果(相对保留时间)

结果显示，样品共有峰的相对保留时间相对标准偏差均小于0.4％，相对积分面积的相对标准偏差小于3.0％。表明，本方法具有较好的精密度，仪器等整个检测系统的精密度良好。叠加色谱图见附图19。

结果表明，本方法具有较好的精密度，仪器等整个检测系统的精密度良好。

1.5.2广升麻总甾酮胶囊稳定性试验

取批号为09001的广升麻总甾酮提取物制备供试品，分别在0h，1h，3h，6h，9h，23h进样，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积。以蜕皮甾酮的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积。

表15广升麻总甾酮胶囊指纹图谱稳定性试验结果(相对峰面积)

表16广升麻总甾酮胶囊指纹图谱稳定性试验结果(相对保留时间)

结果显示，样品在23h内稳定，共有峰的保留时间和积分面积基本一致，相对保留时间相对标准偏差均小于0.5％，相对峰面积的相对标准偏差均小于3.0％。叠加色谱图见下附图20。

结果表明，制备样品稳定性较好，常温下23h内也能保持较好的稳定性。

1.5.3广升麻总甾酮胶囊重现性试验

取批号为09001的广升麻总甾酮提取物供试品5份，按上述方法进行制备并进行检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性。

表17广升麻总甾酮胶囊指纹图谱重现性试验结果(相对峰面积)

表18广升麻总甾酮胶囊指纹图谱重现性试验结果(相对保留时间)

结果显示，所考察的共有峰的相对保留时间及相对峰面积具有较好的重现性，其中相对峰面积相对标准偏差小于3.0％，相对保留时间的相对标准偏差小于0.2％。见附图，叠加色谱图见附图21。

经过上述研究，我们采用了如下的供试品溶液的制备方法：取广升麻总甾酮样品适量，精密称定用45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每1mL含600μg的溶液滤过，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得广升麻总甾酮供试液。取广升麻总甾酮胶囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置25ml量瓶中，加45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得广升麻总甾酮胶囊供试液。

经过上述研究，本发明采用了如下的色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系；线性梯度洗脱程序：0～5min10％～15％乙腈；5～20min15％～19％乙腈；20～30min19％乙腈；30～40min19％～35％乙腈；40～50min35％～80％乙腈；50～60min80％乙腈。柱温35℃；流速1.0ml/min；紫外检测器检测；检测波长为243nm；进样量：20μl；运行60min。

附图说明

图1广升麻总甾酮对照指纹图谱

图2广升麻总甾酮胶囊对照指纹图谱

图3不同流动相对指纹图谱的影响

图4不同供试品的紫外扫描图

图5不同波长对广升麻总甾酮指纹图谱的影响

图6不同波长对广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的影响

图7不同流速长对广升麻总甾酮指纹图谱的影响

图8不同流速对广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的影响

图9不同柱温对广升麻总甾酮指纹图谱的影响

图10不同柱温对广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的影响

图11不同流动相pH对广升麻总甾酮指纹图谱的影响

图12不同流动相pH对广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的影响

图13空白溶剂及供试品的2H色谱图

图14蜕皮甾酮对照品色谱图

图15不同提取时间对广升麻总甾酮胶囊的指纹图谱的影响

图16广升麻总甾酮指纹图谱精密度试验

图17广升麻总甾酮指纹图谱溶液稳定性试验

图18广升麻总甾酮指纹图谱重现性试验

图19广升麻总甾酮胶囊指纹图谱精密度试验

图20广升麻总甾酮胶囊指纹图谱溶液稳定性试验

图21广升麻总甾酮胶囊指纹图谱重现性试验

图2213批广升麻总甾酮指纹图谱叠加图

图2310批广升麻总甾酮胶囊指纹图谱叠加图

具体实施方式

下面结合具体实施方式对方法进行进一步说明。

实施例1广升麻总甾酮对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价

1.1仪器与试剂

仪器：Agilent1100高效液相色谱仪，Agilent1100紫外检测器，工作站：Chem station forLC，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)

试剂：乙腈为色谱纯(product of Tedia，USA)，其它试剂均为分析纯，水为哇哈哈引用纯净水。

广升麻总甾酮(江苏柯菲平医药有限公司，批号：090101、090201、090202、0901、0902、111101、111102、111201、111202、S13-130101-M、S13-130102-M、S13-130201-M、S13-130202-M)

1.2供试品溶液的制备

取广升麻总甾酮样品适量，精密称定用45％甲醇适量，超声处理(功率300W，频率50kHz)至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每1mL含600μg的溶液滤过，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得

1.3色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系；线性梯度洗脱程序：0～5min10％～15％乙腈；5～20min15％～19％乙腈；20～30min19％乙腈；30～40min19％～35％乙腈；40～50min35％～80％乙腈；50～60min80％乙腈。柱温35℃；流速1.0ml/min；紫外检测器检测；检测波长为243nm；进样量：20μl；运行60min。

1.4测定

精密吸取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，照高校液相色谱法测定，得到13批指纹图谱。以该13批次指纹图谱为对照指纹图谱，扣除主峰分别计算各批次指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度，见图26。各批次广升麻总甾酮指纹图谱相似度结果见下表

结果：13批样品的相似度均大于0.99，结果说明：江苏柯菲平医药有限公司生产的广升麻总甾酮各批次间质量均一、稳定。

实施例2广升麻总甾酮胶囊对照指纹图谱的获取及质量稳定性评价

条件同上，广升麻总甾酮胶囊(江苏柯菲平医药有限公司，批号：090301、090302、090303、09001、10001、111201、S13-130301、S13-130302、S13-130303、S13-130304)

以该10批次指纹图谱为对照指纹图谱，扣除主峰分别计算各批次指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度，见图27结果各批次广升麻总甾酮指纹图谱相似度结果见下表

表2010批广升麻总甾酮胶囊指纹图谱相似度计算结果

结果：10批样品的相似度均大于0.9，结果说明：江苏柯菲平医药有限公司生产的广升麻总甾酮胶囊各批次间质量均一、稳定。

Claims (5)

1.一种广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

A.广升麻总甾酮供试液：取广升麻总甾酮提取物样品适量，用45％的甲醇溶液，超声处理至全部溶解，放冷摇匀后稀释成含蜕皮甾酮的溶液滤过，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；广升麻总甾酮胶囊供试液：取广升麻总甾酮胶囊内容物适量，精密称取约120mg置25ml量瓶中，加甲醇溶液适量，超声处理，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

B.液相色谱法测定供试液指纹图谱：将A步骤制备的供试液在一定色谱条件下进样即得；一定的色谱条件为：C18色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系；线性梯度洗脱程序；柱温35℃；流速1.0ml/min；紫外检测器检测；检测波长为243nm；进样量：20μl；运行60min。

2.权利要求1所述的广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的构建方法，所述的C18ODS色谱柱，Agilent ZORBAX SB-AQ柱尤其适用。

3.权利要求1所述的一种广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的构建方法，所述的对照指纹图谱的获得方法为：取广升麻总甾酮提取物样品适量，精密称定用45％甲醇适量，超声处理至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每1mL含600μg的溶液，过滤，取续滤液即得；取广升麻总甾酮胶囊，各取本品胶囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置25ml量瓶中，加45％甲醇适量，超声10分钟使溶解，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；按如下色谱条件分析：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系；柱温35℃；流速1.0ml/min；紫外检测器检测；检测波长为243nm；进样量：20μl；线性梯度，运行60min；获取广升麻总甾酮、广升麻总甾酮胶囊样品的指纹图谱，用相似度软件进行分析，以该平均指纹图谱为对照指纹图谱。

4.权利要求3所述的一种广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的构建方法，所述的一定的色谱条件下线性梯度洗脱程序，具体条件如下：乙腈(A)-0.04mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH为3.0)(5：95)体系；线性梯度洗脱程序：0～5min10％～15％乙腈；5～20min15％～19％乙腈；20～30min19％乙腈；30～40min19％～35％乙腈；40～50min35％～80％乙腈；50～60min80％乙腈。

5.权利要求4所述的一种广升麻、广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱的构建方法，所得的广升麻总甾酮对照图谱具有9个特征峰，以蜕皮甾酮对照品峰(即3号峰)，一其峰保留时间为1，计算共有指纹峰的相对保留时间，图谱总长度为60min，广升麻总甾酮胶囊对照图谱具有9个特征峰，10mg规格胶囊的相对保留时间/min(特征峰序号)0.70±10％(1)、0.71±10％(2)、1.00±10％(3[S])、1.13±10％(4)、1.31±10％(5)、1.44±10％(6)、1.76±10％(7)、1.90±10％(8)、2.06±10％(9)；5mg规格胶囊的相对保留时间/min(特征峰序号)0.70±10％(1)、0.71±10％(2)、1.00±10％(3[S])、1.13±10％(4)、1.31±10％(5)、1.44±10％(6)、1.76±10％(7)、1.90±10％(8)、2.06±10％(9)。