CN109932453A

CN109932453A - 一种防风的检测方法

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Publication number: CN109932453A
Application number: CN201910285933.2A
Authority: CN
Inventors: 乐智勇; 李婷; 董婧婧; 武拉斌; 许冬瑾
Original assignee: GUANGDONG KANGMEI PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE CO LTD; Kangmei (beijing) Pharmaceutical Research Institute Co Ltd; Kangmei Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG KANGMEI PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE CO LTD; Kangmei (beijing) Pharmaceutical Research Institute Co Ltd; Kangmei Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2019-06-25

Abstract

本发明公开了一种防风的检测方法，属于防风检测技术领域。所述防风的检测方法，包括含量测定法和UPLC指纹图谱检测法中的一种或两种，具体为：A：升麻素苷和5‑O‑甲基维斯阿米醇苷含量测定法；B：UPLC指纹图谱检测法。本发明的防风的检测方法，能有效监控各种不同剂型的防风产品的质量，具有简便、稳定、精密度高、重复性好等特点，方法科学可靠，有利于全面监控各种不同剂型的防风产品的质量。

Description

一种防风的检测方法

技术领域

本发明涉及一种防风的检测方法，属于防风检测技术领域。

背景技术

防风(Saposhnikoviae Radix)为传统中药之一，系伞科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.未抽花茎的干燥根，呈长圆锥形或长圆柱形，下部渐细，有的略弯曲，长15～30cm，直径0.5～2cm。表面灰棕色或棕褐色，粗糙，有纵皱纹、多数横长皮孔样突起及点状的细根痕。根头部有明显密集的环纹，有的环纹上残存棕褐色毛状叶基。体轻，质松，易折断，断面不平坦，皮部棕黄色至棕色，有裂隙，木部黄色。气特异，味微甘。

目前，由防风制成的中药剂型有防风饮片、防风标准汤剂和防风配方颗粒等。其中，防风饮片是由防风未抽花茎的干燥根除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥即得。外表皮灰棕色或棕褐色，有纵皱纹、有的可见横长皮孔样突起、密集的环纹或残存的毛状叶基。切面皮部棕黄色至棕色，有裂隙，木部黄色，具放射状纹理。气辛、味甘，性微温。归膀胱、肝、脾经。

防风标准汤剂冻干粉是由防风饮片，加水煎煮二次，趁热过滤，合并滤液，于≤50℃减压浓缩至得到清膏，冻干，即得。

防风配方颗粒是由防风饮片加水煎煮二次，滤过，合并滤液，于≤80℃减压浓缩得到清膏，滤过，喷雾干燥，加辅料，混匀，干法制粒，整粒，即得。

现有技术的防风产品的检测方法存在如下缺陷：操作过程复杂，分析时间长，对操作人员的操作技能要求高。

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。指纹图谱主要分为中药指纹图谱、DNA指纹图谱和肽指纹图谱。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。

目前最新的指纹图谱测试方法之一是超高效液相色谱(Ultra PerformanceLiquid Chromatography，UPLC)，这是最近几年出现的一种新型液相色谱技术，采用1.8μm的小粒径色谱柱填料，不仅使柱效得以提高，而且在较宽的流速范围内柱效保持恒定，从而有利于通过提高流动相的流速而缩短分析时间，提高分析通量。相对于常规HPLC(高效液相色谱，High Performance Liquid Chromatography)而言，UPLC有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度。但是，在防风药材分析技术领域，还仍未有用UPLC对防风药材进行质量控制分析以及报道其指纹图谱。

鉴于此，有必要提供一种新的防风的检测方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种防风的检测方法。本发明的防风的检测方法，能有效监控各种不同剂型的防风产品的质量，具有简便、稳定、精密度高、重复性好等特点，方法科学可靠，有利于全面监控各种不同剂型的防风产品的质量。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种防风的检测方法，包括含量测定法和UPLC指纹图谱检测法中的一种或两种，具体为：

A：升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量测定法

供试品溶液的制备：取防风产品粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入分析纯甲醇50ml，密塞,称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用分析纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；其中，所述防风产品具体为防风药材1.0g±0.5g、防风饮片1.0g±0.5g、防风标准汤剂冻干粉0.2g±0.05g或者防风配方颗粒0.2g±0.05g；

对照品溶液的制备：精密称取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加分析纯甲醇制成每1ml分别含60μg升麻素苷和60μg 5-O-甲基维斯阿米醇苷的混合溶液，摇匀，得到对照品溶液；

色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱，柱温为30℃，紫外检测波长为254nm，流速为0.3ml/min，进样量为1μl；

测定：分别精密吸取步骤1得到的供试品溶液和步骤2得到的混合对照品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，读取数据，即分别得到升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量；

B：UPLC指纹图谱检测法

测定：分别精密吸取步骤1得到的供试品溶液和步骤2得到的混合对照品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录9min内的色谱图，即得到防风产品的UPLC指纹图谱。

上述方法1中，升麻素苷(Prim-O-glucosylcimifugin)，分子式为C₂₂H₂₈O₁₁，结构式如下：

5-O-甲基维斯阿米醇苷(5-O-methylvisamminolβ-D-glucopyranoside)，分子式为C₂₂H₂₈O₁₀，结构式如下：

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述超声处理的功率均为500W，频率均为40kHz，时间均为30min。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，超声处理的效果好。

进一步，所述梯度洗脱具体为：

采用上述进一步的有益效果是：梯度洗脱采用上述参数，能确保2个指标峰峰形均较好，分析过程时间短，仅需9min。其中，升麻素苷峰的保留时间为2.382min、对称因子1.09、分离度大于1.5，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰的保留时间为5.071min、对称因子1.09、分离度大于1.5。

进一步，所述色谱柱的型号为Waters C18 Hss T3，长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述规格的色谱柱，可以充分利用小粒度色谱柱的优势，使色谱分离的解析度达到了新的高度，能够满足高速度、高分离度、高灵敏度的检测要求，缩短了分析时间，节约了人力、物力成本。

进一步，所述防风饮片是由防风未抽花茎的干燥根除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，即得；所述防风标准汤剂冻干粉是由防风饮片，加水煎煮二次，趁热过滤，合并滤液，于≤50℃减压浓缩至得到清膏，冻干，即得；所述防风配方颗粒是由防风饮片加水煎煮二次，滤过，合并滤液，于≤80℃减压浓缩得到清膏，滤过，喷雾干燥，加辅料，混匀，干法制粒，整粒，即得。

进一步，所述防风产品的UPLC指纹图谱的8个特征峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.46、0.79、1.00、1.24、1.31、1.37、1.43和1.47。

采用上述进一步的有益效果是：上述UPLC指纹图谱可用于防风的鉴别，全面反映防风中所含主要化学成分，进而对其质量进行整体的评价和描述，有效控制防风药材的质量，从而进一步评价、控制防风标准汤剂及配方颗粒质量的一致性。

更进一步，所述8个特征峰分别为：1号峰为升麻素苷，3号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷。

本发明的有益效果是：

1.本发明的防风的检测方法，能有效监控各种不同剂型的防风产品的质量，具有简便、稳定、精密度高、重复性好等特点，方法科学可靠，有利于全面监控各种不同剂型的防风产品的质量。

2.本发明的防风的检测方法以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷为对照品，分别建立防风产品中指标成分含量测定方法和指纹图谱检测方法，且两个方法中供试品溶液、对照品溶液的制备方法及色谱条件相同，检测人员无需更换检测条件，更加简便。

3.本发明的防风的检测方法选用的色谱柱规格，能充分利用小粒度色谱柱的优势，使色谱分离的解析度满足高速度、高分离度、高灵敏度的要求。

4.本发明的防风的检测方法，整个分析过程仅需9min，就能够获得有特征性的分离状态。相较于现有技术，大大缩短了检测用时。

4.本发明的防风的检测方法采用梯度洗脱，能有效分离升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰及各特征峰，8个特征峰分离度及对称因子均较好，供试品溶液中各特征峰24h内稳定性良好。

5.当紫外检测波长为254nm时，升麻素苷峰、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰及各特征峰数目较多且各峰响应值及分离效果较好。因指标成分含量测定及指纹图谱检测选用同一个波长，故检测过程中不是仅限用DAD检测器，可选用广泛使用的PDA检测器。

附图说明

图1为本发明色谱条件的流动相确定中，方法一的超高效液相色谱图。

图2为本发明色谱条件的流动相确定中，方法二的超高效液相色谱图。

图3为本发明色谱条件的流动相确定中，方法三的超高效液相色谱图。

图4为本发明色谱条件的波长确定中，波长为254nm的超高效液相色谱图。

图5为本发明色谱条件的波长确定中，波长为260nm的超高效液相色谱图。

图6为本发明色谱条件的波长确定中，波长为280nm的超高效液相色谱图。

图7为本发明色谱条件的波长确定中，波长为310nm的超高效液相色谱图。

图8为本发明色谱条件的专属性试验中，空白溶液的超高效液相色谱图。

图9为本发明色谱条件的专属性试验中，参照物溶液的超高效液相色谱图。

图10为本发明色谱条件的专属性试验中，防风标准汤剂供试品溶液的超高效液相色谱图。

图11为本发明色谱条件下，防风药材的超高效液相色谱图。

图12为本发明色谱条件下，防风饮片的超高效液相色谱图。

图13为本发明色谱条件下，防风配方颗粒的超高效液相色谱图。

图14为升麻素苷对照品的标准曲线图。

图15为5-O-甲基维斯阿米醇苷的标准曲线图。

图16为本发明的实验例中15批防风标准汤剂UPLC指纹图谱叠加图。

图17为本发明的实验例中15批防风标准汤剂对照指纹图谱。

图18为本发明的对比例1中，防风饮片的高效液相色谱图。

图19为本发明的对比例1中，防风药材的高效液相色谱图。

图20为本发明的对比例1中，防风标准汤剂冻干粉的高效液相色谱图。

图21为本发明的对比例1中，防风配方颗粒的高效液相色谱图。

图22为本发明的对比例2中，防风标准汤剂的高效液相色谱图。

图23为本发明的对比例2中，防风药材的高效液相色谱图。

图24为本发明的对比例2中，防风饮片的高效液相色谱图。

图25为本发明的对比例2中，防风标准汤剂冻干粉的高效液相色谱图。

图26为本发明的对比例2中，防风配方颗粒的高效液相色谱图。

图27为本发明的对比例3中，防风药材的高效液相色谱图。

图28为本发明的对比例3中，防风饮片的高效液相色谱图。

图29为本发明的对比例3中，防风标准汤剂冻干粉的高效液相色谱图。

图30为本发明的对比例3中，防风配方颗粒的高效液相色谱图。

图31为本发明的对比例4中，防风标准汤剂的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1色谱条件与系统适用性试验

1.1流动相确定

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；按以下各色谱条件对同一供试品溶液进行检测。

方法一:以乙腈为流动相A,0.1％的甲酸溶液为流动相B，按以下各色谱条件检测，流速为0.4ml/min。

方法二：以甲醇为流动相A,水为流动相B，按以下各色谱条件检测，流速为0.3ml/min。

方法三:以甲醇为流动相A,0.1％的甲酸溶液为流动相B，按以下各色谱条件检测，流速为0.3ml/min。

对照品溶液的制备：取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml分别含60μg升麻素苷和60μg 5-O-甲基维斯阿米醇苷的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备方法：取防风标准汤剂冻干粉粉末约0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞,称定重量，超声处理(功率为500W，频率为40kHz)30min，放冷，再称定重量，用分析纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。结果见图1-图3。

由图1-图3可知，方法三供试品溶液中升麻素苷峰及5-O-甲基维斯阿米醇苷峰响应值均较高，其对称因子和分离度均较好，故选择方法三作为防风标准汤剂冻干粉含量测定的流动相条件。

1.2波长确定

按流动相考察最终确定的色谱条件，检测同一份供试品溶液，选择不同波长的图谱进行考察，其结果见图4-图7。

通过比较不同波长254nm、260nm、280nm、310nm下供试品溶液中各色谱峰的峰形和响应值的强弱可知，254nm波长下供试品溶液中升麻素苷峰及5-O-甲基维斯阿米醇苷峰响应值均较高，且升麻素苷峰及5-O-甲基维斯阿米醇苷峰对称因子和分离度均较好，故防风标准汤剂冻干粉含量测定及指纹图谱测定方法波长选择254nm。

1.3专属性试验

按流动相考察及波长考察结果最终确定的色谱条件，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。其结果见图8-图10。

由检测结果可知，此色谱条件下空白溶液无干扰，对照品溶液和供试品溶液中各色谱峰对称因子和分离度均较好，理论塔板数按升麻素苷峰计算不低于2000，说明此色谱条件良好，符合要求。

最终确定色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A,0.1％的甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速0.3ml/min；理论板数按升麻素苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml各含60μg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

2供试品溶液制备方法的确定

2.1提取溶剂的确定

取防风标准汤剂冻干粉0.2g±0.05g，精密称定4份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50ml水、50ml分析纯甲醇、50ml的70％(v/v)分析纯甲醇、50ml的50％(v/v)分析纯甲醇，密塞,称定重量，超声处理(功率为500W，频率为40kHz)30min，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按上述测定方法，检测升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，结果分别见表1和表2。

表1不同提取溶剂对升麻素苷供试品溶液制备方法的影响比较

提取溶剂	水	分析纯甲醇	70％(v/v)分析纯甲醇	50％(v/v)分析纯甲醇
					升麻素苷	1.18	1.22	1.21	1.19

表2不同提取溶剂对5-O-甲基维斯阿米醇苷供试品溶液制备方法的影响比较

结果表明，四种提取溶剂提取供试品溶液中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的提取效果略有差异，根据滤过等操作的简便性，提取溶剂最终确定为分析纯甲醇。

2.2溶剂用量的确定

取防风标准汤剂冻干粉0.2g±0.05g，精密称定3份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入分析纯甲醇25ml、50ml、100ml，密塞,称定重量，超声处理(功率为500W，频率为40kHz)30min，放冷，再称定重量，用分析纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按上述的测定方法，检测升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，结果见下表3和表4。

表3不同溶剂用量对升麻素苷供试品溶液制备方法的影响比较

溶剂用量	25ml	50ml	100ml
				升麻素苷(％)	1.25	1.22	1.18

表4不同溶剂用量对5-O-甲基维斯阿米醇苷供试品溶液制备方法的影响比较

溶剂用量	25ml	50ml	100ml
				5-O-甲基维斯阿米醇苷(％)	0.70	0.69	0.67

结果表明，用25ml、50ml、100ml不同量的分析纯甲醇提取时，防风标准汤剂冻干粉中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的提取效果相近，根据滤过等操作的简便性，提取溶剂用量最终确定为50ml。

最终确定供试品溶液的制备方法：

取防风标准汤剂冻干粉0.2±0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入分析纯甲醇50ml，密塞,称定重量，超声处理(功率为500W，频率为40kHz)30min，放冷，再称定重量,用分析纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3防风的检测方法确定

经过本申请的发明人大量的试验摸索，最终防风产品的检测方法确定如下：

一种防风的检测方法，包括含量测定法和UPLC指纹图谱检测法中的一种或两种，具体为：

A：升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量测定法

B：UPLC指纹图谱检测法

其中，所述超声处理的功率均为500W，频率均为40kHz，时间均为30min。

所述梯度洗脱具体为：

所述色谱柱的型号为Waters C18 Hss T3，长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm。

所述防风饮片是由防风未抽花茎的干燥根除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，即得；所述防风标准汤剂冻干粉是由防风饮片，加水煎煮二次，趁热过滤，合并滤液，于≤50℃减压浓缩至得到清膏，冻干，即得；所述防风配方颗粒是由防风饮片加水煎煮二次，滤过，合并滤液，于≤80℃减压浓缩得到清膏，滤过，喷雾干燥，加辅料，混匀，干法制粒，整粒，即得。

4上述防风标准汤剂冻干粉含量测定法的方法学验证

4.1标准曲线绘制

精密称取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品各适量，加分析甲醇使溶解，稀释，得一系列对照品溶液。精密吸取1μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，分别以升麻素苷量(μg)、5-O-甲基维斯阿米醇苷量(μg)为横坐标作图，绘制标准曲线。结果见表5-表6、图11-图12。

表5升麻素苷线性关系考察结果

计算得升麻素苷回归方程：Y＝6168194.62X+2041.12，相关系数：R＝0.9998，线性范围：0.006～0.603μg。

表6 5-O-甲基维斯阿米醇苷线性关系考察结果

计算得5-O-甲基维斯阿米醇苷回归方程：Y＝5745039.98X+2592.70，相关系数：R＝0.9998，线性范围：0.006～0.593μg。

4.2精密度

按上述色谱条件和测定法，精密吸取同一份供试品溶液，重复测定6次，记录升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰面积，结果见表7、表8。

表7升麻素苷精密度试验结果

表8 5-O-甲基维斯阿米醇苷精密度试验结果

结果表明，供试品溶液中升麻素苷峰、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰峰面积的RSD小于3％，说明仪器精密度良好。

4.3重复性

用同一批样品制备6份供试品溶液，按上述色谱条件和测定法测定，计算升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，结果见表9、表10。

表9升麻素苷重复性试验结果

表10 5-O-甲基维斯阿米醇苷重复性试验结果

结果表明，样品中升麻素苷平均含量为1.20％，5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为0.67％，且升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的RSD均小于3％，说明方法重复性良好。

4.4稳定性

制备一份供试品溶液，分别在第0、2h、4h、10h、16h和24h测定，结果见表11、表12。

表11升麻素苷稳定性试验结果

表12 5-O-甲基维斯阿米醇苷稳定性试验结果

结果表明，供试品溶液中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷在24小时内稳定性良好，RSD小于3％，符合要求。

4.5加样回收率

采用加样回收法，取防风标准汤剂冻干粉0.1±0.05g，精密称定6份，置具塞锥形瓶中，分别精密称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品加入，再加入分析纯甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率为500W，频率为40kHz)30min，放冷，再称定重量，用分析纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表13、14。

表13升麻素苷加样回收率试验结果

表14 5-O-甲基维斯阿米醇苷加样回收率试验结果

结果表明，供试品溶液升麻素苷的加样回收率在98％～105％，供试品溶液5-O-甲基维斯阿米醇苷其的加样回收率在94％～101％，RSD均小于3％，说明该方法准确度良好，符合要求。

5上述防风UPLC指纹图谱的方法学验证

5.1稳定性

取同一份供试品溶液，按上述色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h、24h时进样，选择8个征峰，以3号峰(5-O-甲基维斯阿米醇苷)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。结果见表15、表16。

表15稳定性试验——相对保留时间及相对标准偏差

表16稳定性试验——相对峰面积及相对标准偏差(24h)

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD<1％，相对峰面积的RSD<3％(6号峰随着时间的增加峰面积减小，其RSD为10.78)，说明供试品溶液中大部分峰在24h内稳定性较好。

5.2精密度

取同一批标准汤剂供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，选择8个特征峰，以3号峰(5-O-甲基维斯阿米醇苷)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。结果见表17、表18。

表17精密度试验——相对保留时间及相对标准偏差

表18精密度试验——相对峰面积及相对标准偏差

结果表明，8个特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于<3％，说明仪器精密度良好。

5.3重复性

取同一批号的样品制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，选择8个特征峰，以3号峰(5-O-甲基维斯阿米醇苷)为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。结果见表19、表20。

表19重复性试验——相对保留时间及相对标准偏差

表20重复性试验——相对峰面积及相对标准偏差

结果表明8个特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，说明该方法重复性良好。

6实验例

6.1含量测定

按色谱条件及最终确定的供试品溶液制备方法对15批防风标准汤剂冻干粉中的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷进行含量测定，实验结果见表21、表22。

表21实验例中15批防风标准汤剂中升麻素苷含量测定结果

表22实验例中15批防风标准汤剂中5-O-甲基维斯阿米醇苷含量测定结果

由表21、表22可知，15批防风标准汤剂中的升麻素苷含量在1.35％–1.68％、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量在0.76％–1.00％。

6.2UPLC指纹图谱

15批样品的供试品溶液按上述确定条件进样，记录色谱图,结果见图16。利用中药指纹图谱相似度评价系统软件，采用自动匹配法生成共有模式对照特征图谱，结果见图17。

分析各样品之间共有峰和相似度，根据出峰时间稳定性和相对峰面积的大小确定特征峰，15批样品在2min后呈现8个特征锋，其中峰3与参照物中5-O-甲基维斯阿米醇苷峰的保留时间相同。

因5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰面积相对较大、出峰时间较稳定，以5-O-甲基维斯阿米醇苷参照峰相应的峰为S峰，计算各共有锋与S峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表23、表24。

表23实验例中15批样品特征峰相对保留时间

表24实验例中15批样品特征峰相对峰面积

8个特征峰的相对保留时间分别为0.46(峰1)、0.79(峰2)、1.00(峰S)、1.24(峰4)、1.31(峰5)、1.37(峰6)、1.43(峰7)、1.47(峰8)，相对保留时间RSD均小于1％，说明不同产地和不同批次的样品有较多相同的成分；相对峰面积差异较大，RSD介于7.16％～13.11％，说明不同产地和不同批次的样各成分差异较大，可能与原料质量有关。

本发明中供试品溶液制备、对照品溶液制备、色谱条件能同时实现指标成分含量测定及指纹图谱检测，使得实验方便简单，流动相选择甲醇-0.1％甲酸溶液时升麻素苷峰前面基线平稳，而选择甲醇-水作为流动相时2min左右基线波动。用上述梯度洗脱使得2个指标峰峰形均较好，升麻素苷峰的保留时间为2.382min、对称因子1.09、分离度大于1.5，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰的保留时间为5.071min、对称因子1.09、分离度大于1.5，其他各特征峰峰形较好。所用色谱柱的型号为Waters C18 Hss T3，长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm，充分利用了小粒度色谱柱的优势，使色谱分离的解析度达到了新的高度，检测过程能够满足高速度、高分离度、高灵敏度，缩短了分析时间,仅需9min。

7对比试验

7.1对比例1

以《中华人民共和国药典》(2015年版一部)中防风质量的检测方法作为对比例1。

《中华人民共和国药典》(2015年版一部)中规定防风的质量分析以升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷为指标性成分，也记载了防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的具体提取方法：取本品细粉约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，水浴回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

液相色谱检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(体积比40:60)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按升麻素苷峰计算应不低于2000。

采用上述方法，取防风饮片细粉0.25g的检测结果，见图18。

采用上述方法，取防风药材0.25g的检测结果，见图19。

采用上述方法，取防风标准汤剂冻干粉0.05g的检测结果，见图20。

采用上述方法，取防风配方颗粒0.05g的检测结果，见图21。

由图18-图21可知，对比例1的方法存在如下缺陷：(1)不能达到同时测定含量和指纹图谱的效果,因为不能实现升麻素苷对照品和5-O-甲基维斯阿米醇苷两个检测成分的有效分离；(2)检测分析时间长，因为含量测定至少需要30min，供试品溶液制备需要回流2h，操作复杂费时；(3)对照品溶液需分别配制并且分别进样检测。

7.2对比例2

以陈士林主编的《中药饮片标准汤剂》第一卷^[1]记载的防风标准汤剂中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的提取方法作为对比例2。

具体提取方法为：取防风标准汤剂摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，超声30min，冷却，甲醇定容摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml各含60μg的溶液，即得。

液相色谱检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长250nm，内径4.6mm，粒径5μm)；流动相为甲醇(A)-水(B),按下列规定进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样量为5μl。

采用上述方法，取防风标准汤剂，检测结果，见图22。

采用上述方法，取防风药材，检测结果，见图23。

采用上述方法，取防风饮片，检测结果，见图24。

采用上述方法，取防风标准汤剂冻干粉，检测结果，见图25。

采用上述方法，取防风配方颗粒，检测结果，见图26。

由图22-图26可知，上述方法虽然能在一个色谱条件下同时检测2个指标成分含量及指纹图谱，但是分析时间长，至少需要69min，指标峰峰型较差，供试品溶液中升麻素苷峰对称因子较差，有前沿，个别特征峰峰形也较差。

7.3对比例3

参考曹文正撰写的《防风饮片标准汤剂》^[2]记载的防风饮片标准汤剂中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定方法及指纹图谱测定方法作为对比例3。

具体提取方法为：取防风饮片的标准汤剂0.2mL置2mL量瓶中，定容后转移至2mL离心管中，离心(12000r·min^-1)5min，取上清液，即得。

对照品溶液的制备：取升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL各约含1mg储备液。取上述升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品储备液各120μL置2mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，充分摇匀，制成每1mL各含约60μg的溶液，即得。

HPLC含量测定

色谱条件：采用Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温40℃，流速1mL·min^-1；进样量为对照品3μL，供试品2μL^[2]；流动相水(A)-甲醇(B)(60:40)，检测波长为254nm。

HPLC指纹图谱测定

采用Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温25℃；检测波长254nm；流速1mL·min^-1；进样量10μL；流动相为水(A)-甲醇(B)。

梯度洗脱具体为：

采用上述HPLC指纹图谱测定方法，取防风药材，检测结果，见图27。

采用上述HPLC指纹图谱测定方法，取防风饮片，检测结果，见图28。

采用上述HPLC指纹图谱测定方法，取防风标准汤剂冻干粉，检测结果，见图29。

采用上述HPLC指纹图谱测定方法，取防风配方颗粒，检测结果，见图30。

由图27-图30可知，上述方法含量测定和指纹图谱色谱条件不同，含量测定色谱条件同2015年版《中国药典》第149页防风项下含量测定，指纹图谱色谱条件采用了梯度洗脱，洗脱时间较长，整个分析过程需要90min。

7.4对比例4

以本申请的发明人自建的防风标准汤剂冻干粉(HPLC)的检测方法作为对比例4。

供试品溶液的制备：取防风标准汤剂冻干粉0.2g±0.05g，置具塞锥形瓶中，精密加入分析纯甲醇50ml，密塞,称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用分析纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：精密称取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加甲醇制成每1ml各含60μg的混合溶液，摇匀，即得。

色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂；以甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱，柱温为30℃，紫外检测波长为254nm，流速为1ml/min，进样量为10μl。

由图31可知，上述方法虽然能在一个色谱条件下同时检测2个指标成分含量及指纹图谱，但是分析时间较长，至少需要60min，试剂消耗多。此外，如前述1.1流动相确定中，本发明的梯度洗脱参数，是本申请的发明人经过试验摸索出来的，能有效分离升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰及各特征峰，8个特征峰分离度及对称因子均较好，供试品溶液中各特征峰24h内稳定性良好。

对比例4和本发明的方法的具体比较，如表25所示。

表25对比例4和本发明的方法的具体比较

由此可见，本发明所提供的方法能有效监控各种不同剂型的防风产品的质量，具有简便、稳定、精密度高、重复性好等特点，方法科学可靠，有利于全面监控各种不同剂型的防风产品的质量。

参考文献：

1.陈士林.中药饮片标准汤剂：第一卷[M].北京：科学出版社,2017,86.

2.曹文正,苏文龙,李涵阳,俞月婷,苏鑫鑫,夏赫成,高红梅.防风饮片标准汤剂[J].中国实验方剂学杂志，2019，29(8)：1-9.

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种防风的检测方法，其特征在于，包括含量测定法和UPLC指纹图谱检测法中的一种或两种，具体为：

A：升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量测定法

对照品溶液的制备：精密称取升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加分析纯甲醇制成每1ml分别含60μg升麻素苷和60μg5-O-甲基维斯阿米醇苷的混合溶液，摇匀，得到对照品溶液；

B：UPLC指纹图谱检测法

2.根据权利要求1所述的防风的检测方法，其特征在于，所述超声处理的功率均为500W，频率均为40kHz，时间均为30min。

3.根据权利要求1所述的防风的检测方法，其特征在于，所述防风饮片是由防风未抽花茎的干燥根除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，即得；所述防风标准汤剂冻干粉是由防风饮片，加水煎煮二次，趁热过滤，合并滤液，于≤50℃减压浓缩至得到清膏，冻干，即得；所述防风配方颗粒是由防风饮片加水煎煮二次，滤过，合并滤液，于≤80℃减压浓缩得到清膏，滤过，喷雾干燥，加辅料，混匀，干法制粒，整粒，即得。

4.根据权利要求1所述的防风的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：

5.根据权利要求1所述的防风的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的型号为WatersC18 Hss T3，长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm。

6.根据权利要求1所述的防风的检测方法，其特征在于，所述防风产品的UPLC指纹图谱的8个特征峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.46、0.79、1.00、1.24、1.31、1.37、1.43和1.47。

7.根据权利要求6所述的防风的检测方法，其特征在于，所述8个特征峰分别为：1号峰为升麻素苷，3号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷。