CN101638402B

CN101638402B - 一种对丹酚酸b生产在线含量检测方法

Info

Publication number: CN101638402B
Application number: CN 200810054002
Authority: CN
Inventors: 刘岩; 张延莹; 张金巍
Original assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2028-07-30
Also published as: CN101638402A

Abstract

本发明提供了一种对丹酚酸B生产在线质量监控方法，以产业化生产丹酚酸B的主要工序-提取、纯化过程作为研究系统，以水提液、洗脱液中的主要有效成分-丹酚酸B的含量变化作为研究对象，利用NIR在线检测技术采集光谱，并结合含量测定检测技术和化学计量学的数据处理方法，分别建立提取、纯化过程的丹酚酸B含量检测模型，实现生产过程的全程实时质量监控。

Description

一种对丹酚酸B生产在线含量检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药生产的质量控制方法，尤其是涉及一种对丹酚酸B生产在线质量监控方法。

背景技术

我国现行中药生产工艺的控制模式，很少考虑工艺过程中的成分及含量变化，基本仍停留在传统的经验控制方法上，同时产品的离线检测方法无法适应生产过程在线检测的需要，因此这种落后的工艺控制模式直接导致了中药产品质量的不稳定，严重制约了中药产品的现代化、国际化进程，而实现生产过程的在线实时质量监控是保证中药质量稳定、均一的关键，也是实现中药生产现代化的技术瓶颈。

近红外(near infrared，NIR)光谱是近年来迅速发展的一种快速分析技术，它是被测样品的物质组成与结构信息的间接体现。样品NIR光谱的获取操作简便且成本低，无须复杂的样品前处理，符合在线检测的要求，可快速反馈实时信息，而且操作简单经济廉价，可以避免测量过程中可能带来的污染。随着化学计量学和计算机技术的发展，NIR技术在农业和石油工业领域得到了广泛应用。2002年，美国FDA把该项技术作为一种标准的检测方法，2005版《中国药典》已将“近红外分光光度法指导原则”列入目录。近年来，NIR技术在中药行业特别是中药生产过程的在线检测逐渐成为研究热点，有学者应用其检测丹参水提过程丹参酮和丹酚酸B的含量，也有对栀子药材提取和三七总皂苷模拟物系进行实时定量分析，最近还有应用NIR技术对黄连和枳壳提取物的纯化过程进行快速分析的报道，但这些仅局限于实验室规模的模拟生产研究，基于生产规模的中药提取、纯化过程的近红外在线检测技术的研究还未见报道，尤其是将近红外技术应用在质量监控上用于判断生产工艺是否正常、稳定的问题没有报道过。

丹酚酸B为唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根茎提取而得。本品为棕黄色干燥粉末，纯品为类白色粉末；味微苦、涩，具引湿性。可溶于水，乙醇、甲醇。丹参酸B是由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸缩合形成的，具有两个羧基，是以不同的盐的形式存在的(K+，Ca2+，Na+，NH4+等复合形式)，在煎煮、浓缩过程中，少部分水解生成紫草酸和丹参素，一部分丹参素在酸性条件下变为迷迭香酸；丹酚酸A，C在溶液中可以互变等。

【药理药效】

1、抗氧化作用

丹酚酸B具有很强的抗氧化作用，体内外实验证明，丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，其作用强度高于维生素C、维生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一.

2、对心脏的保护作用

2.1对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

动物实验研究显示丹酚酸B能减轻缺血再灌注损伤模型动物的心肌缺血程度，减小心肌梗死范围，减少LDH、CPK从胞体的溢出、降低缺血心肌组织中MDA的含量，提高SOD的活力，对抗氧自由基对心肌细胞的毒害作用，保护心肌细胞.

2.2对心脏微血管内皮细胞的延迟保护作用

通过对大鼠缺氧/复氧的心脏微血管内皮细胞损伤模型，采用分子生物学方法，观察到丹酚酸B预处理能增强蛋白激酶CmRNA、热休克蛋白70mRNA的表达，具有与缺氧预适应相类似的细胞保护效应，可增强细胞对随后较长时间缺氧/复氧损伤的耐受性，这可能是丹酚酸B预处理的细胞保护机制。

2.3对动脉粥样硬化的防治作用

2.4对细胞凋亡的影响丹酚酸B能诱导新血管内膜细胞的凋亡，从而可以防止新血管内皮的增厚。

2.5预适应的心脏细胞保护作用。

3、对脑的保护作用

3.1对脑缺血损伤的保护作用

3.2对学习记忆功能的影响：对记忆功能障碍有明显的改善作用

4抗肝脏纤维化作用

5抗肿瘤作用

【临床应用】本品具有活血化瘀，通经活络之功效，主治因瘀血阻滞经络所致缺血性中风，症见半身肢体麻木，虚弱无力，拘挛疼痛，或运动不遂，口眼歪斜等。

发明内容

为了实现上述问题，本发明提供了一种对丹酚酸B生产在线质量监控方法。本发明以产业化生产丹酚酸B的主要工序-提取、纯化过程作为研究系统，以水提液、洗脱液中的主要有效成分-丹酚酸B的含量变化作为研究对象，利用NIR在线检测技术采集光谱，并结合含量测定检测技术和化学计量学的数据处理方法，分别建立提取、纯化过程的丹酚酸B含量检测模型，实现生产过程的全程实时质量监控。

本发明是这样实现的：

一种对丹酚酸B生产在线质量监控方法，它包括以下步骤：

(1)在线生产丹参样品的选取：

(2)利用近红外光谱技术，建立样品中丹酚酸B含量检测模型；

(3)根据待测样品近红外光谱，运用近红外丹酚酸B含量检测模型判断工艺状况是否正常，如果待测样品中丹酚酸B含量变化趋势稳定，可判断生产工艺稳定，若不稳定，可分析待测样品中丹酚酸B含量值是否落入与真实值设定的差异范围内，若超出则对相关工艺进行相应的调整后，再返回上述步骤(1)或(2)继续监控。

本发明步骤(1)中所述的样品选自下述中的一种：丹参提取物、丹参提取物的纯化物、含丹参的组合物。

所述丹参的提取物不限于水提物或醇提物。丹参提取物的制备方法包括但不限于水浸提、水煎提、醇浸提、醇回流提取、醇渗漉等，也可以采用现有技术中的制备方法。

所述丹参提取物的纯化物制备方法包括但不限于：大孔树脂纯化、聚酰胺树脂纯化、硅胶柱纯化、氧化铝纯化等，离子交换吸附法，也可以采用现有技术中的制备方法等。

本发明步骤(2)中所述的丹酚酸B含量检测模型的建立，包括以下步骤：

a预先在欲控制的样品提取或纯化的工艺点上，利用近红外分析仪每隔2-5min在线采谱；

b对得到的近红外光谱数据进行预处理，所述的预处理方法包括：一阶微分、二阶微分、多元散射校正、标准正交变换、S-G平滑、Norris导数滤波平滑、背景扣减、归一化、标准化方法中的一种或多种联合使用；

c经过上述步骤(b)中的预处理后的近红外谱图，采用高效液相色谱法，紫外-可见分光光度法、气相色谱法、薄层色谱法中的一种或多种方法对样品中丹酚酸B含量测定，运用偏最小二乘法、主成分回归法、神经网络法和校正变换矩阵法中一种数学运算，得到近红外光谱的预测值与上述方法测定含量真实值之间的相关性，即得丹酚酸B含量检测模型。

其中步骤a中所述的近红外谱图在线采集具体为，在提取及纯化过程中每隔2-5min采集1次，每次采集2张谱图。

所述的近红外采集条件：优选为扫描范围：10000-4000cm^-1，扫描次数32，分辨率8cm^-1

其中步骤b中所述的近红外光谱数据预处理方法优选一阶导数和Norris导数滤波平滑联合处理的方式。

其中步骤c中所述的丹酚酸B的含量测定方法优选高效液相测定法，优选偏最小二乘法运算。所述的近红外光谱的预测值与测定含量真实值之间的相关性＜5％。

本发明所述的近红外丹酚酸B含量检测模型，优选建模波段为9815-5430cm^-1，模型相关系数R＝0.9776-0.9784，校正均方差RMSEC＝0.258-4.02。

本发明中优选待测样品为提取物时，近红外提取物中丹酚酸B含量检测模型：建模波段为9815-5430cm^-1，模型相关系数R＝0.9784，校正均方差RMSEC＝0.258。

本发明中优选待测样品为纯化物时，近红外提取物中丹酚酸B含量检测模型：建模波段为9815-5430cm^-1，模型相关系数R＝0.9776，校正均方差RMSEC＝4.02。

本发明步骤(3)所述的丹酚酸B含量值与真实值的差异范围为±20％。所述的含量变化趋势稳定，是指提取过程或纯化过程中的含量值曲线与真实值曲线均呈稳定，一致的，而且含量值与真实值之间的平均相对误差均在±20％。若超出±20％则对相关工艺进行相应的调整后，再返回上述步骤(1)或(2)继续监控。

本发明的监控方法具体如下：

若本发明步骤(3)中所述的丹酚酸B含量值与真实值设定的差异范围为±20％，则生产工艺稳定。

若本发明步骤(3)中所述的丹酚酸B含量值与真实值的差异为20-50％，则应当对相关工艺过程、参数进行调整后，再返回步骤(2)继续监控。

若本发明步骤(3)中所述的丹酚酸B含量与真实值的差异＞50％，此状态下停止机器运行检查异常或弃去该批样品重新选择后，再返回步骤(1)继续监控。

在丹酚酸B生产在线质量监控过程中，在谱图采集过程中，流通池中样品存在气泡，直接影响到光信号在流通池中的吸收与传播，造成采集到的光谱出现不规则峰型，谱图信息受到严重干扰，影响到含量预测值的准确度和精确度。本发明在提取和纯化过程的管路中增加了缓冲罐或在采集前停止搅拌，以减少气泡的产生，避免干扰。

不正常原因还可能是待测组分含量低于0.1％，目标组分的含量过低会给检测带来较大误差。通过异常现象的排除，还可以监控到原料药的优劣。

试验例1光谱数据的预处理

在实施例1的提取和纯化过程中，采集光谱，并将各种光谱预处理方法排列组合，考察其对提取模型和纯化模型相关系数、均方差及校正均方差的影响。结果如表1、表2。

表1不同光谱预处理方法对提取模型的影响

表2不同光谱预处理方法对纯化模型的影响

上表1、2中MSC为多元散射校正、SNV为标准正交变换、RMSECV内部交叉验证均方差。

从表1和表2计算结果可以看出提取和纯化模型均选择一阶+Norris的光谱预处理方式建立模型。

试验例2最佳主因子数的选择

采用偏最小二乘法建立定量模型时，为避免出现“过拟合”现象，需要对主因子数进行合理选择。本研究采用留一交叉验证法，考察了主因子数对内部交叉验证均方差(RMSECV)的影响。提取和纯化模型的交叉验证结果分别见附图1-2。

从附图1中可以看出，对于提取模型，当主因子数为5时，RMSECV为0.286，超过此主因子数时，RMSECV基本保持平稳，不再下降，因此确定最佳主因子数为5。从附图2中可以看出，对于纯化模型，当主因子数为6时，RMSECV为4.42，超过此主因子数时，RMSECV不下降反而有所上升，因此确定最佳主因子数为6。

本发明的有益效果

本发明提供的用近红外技术在丹酚酸B生产在线质量监控方法，能够快速反馈在中药生产过程中的各个工艺点信息，进行实时监控。运用本发明的丹酚酸B含量检测模型，能够判断生产过程中待测样品工艺信息是否正常，工艺是否稳定，如果正常可进入下一个检测点，如果不正常可提示尽快查找原因，调整工艺，这样可以节省大量时间，操作也简单。同时比离线检测更是节省资源。

附图说明

附图1提取模型最佳主因子数和交叉验证结果

附图2纯化模型最佳主因子数和交叉验证结果

附图3提取模型丹酚酸B预测值与真实值之间的相关系数图

附图4纯化模型丹酚酸B预测值与真实值之间的相关系数图

附图5提取过程丹酚酸B的HPLC值与预测值含量变化趋势图

附图6纯化过程丹酚酸B的HPLC值与预测值含量变化趋势图

具体实施方式

实施例1模型的建立

仪器ANTARIS傅立叶近红外分析仪(美国Thermo公司)，配有光纤配件及TQAnalyst分析软件；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国HP公司)；500L多功能提取装置(天士力现代中药资源有限公司)；150L不锈钢层析装置(天士力现代中药资源有限公司)。

丹参(陕西商洛)，经天士力现代中药资源有限公司质检部鉴定为丹参Salvia miltiorrhizaBge；丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇、乙腈为色谱纯(默克公司)；甲酸为分析纯(天津化学试剂有限公司)。

称取丹参药材共50kg，置于500L提取罐中，加5.5倍量水，煎煮提取1小时，得提取液；药渣进行第二次提取，加入3倍量水，煎煮提取0.5小时，得提取液。提取液合并后，用聚酰胺树脂或大孔树脂纯化。在提取及纯化过程中，每隔2-5min采谱1次，采集波段9815-5430cm^-1，每次采集2张谱图；采谱的同时取样进行HPLC检测，样品编号一一对应。

丹酚酸B含量的HPLC测定方法

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，5um，4.6*250mm；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水＝30∶10∶1∶59；检测波长：286nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：5ul；对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成浓度约为0.14mg/ml的溶液；供试品溶液的制备：精密量取适量提取液或洗脱液，用75％甲醇稀释至10ml，摇匀，用0.45um滤膜过滤，取滤液即得。

本发明对6批次丹酚酸B提取、纯化过程共计473个实验样本(其中提取过程222个，纯化过程251个)进行数据分析，采用一阶微分光谱对丹酚酸B含量进行PLS建模。根据交叉验证获得的结果如下：提取模型：最佳主因子数为5，相关系数R＝0.784，RMSEC＝0.258；纯化模型：最佳主因子数为6，相关系数R＝0.9776，RMSEC＝4.02。模型预测值与真实值的相关系数图如附图3-4。

实施例2模型预测效果验证

参照实施例1的生产条件及采集条件，分别采集提取样本19、纯化样本33个，用于模型的验证。丹酚酸B含量的预测值与真实值的变化趋势如附图5-6。

从附图5-6中可以看出，剔除个别异常数据点，提取过程和纯化过程的预测曲线与真实曲线均呈现稳定、一致的变化趋势，预测值与真实值之间的平均相对误差均＜5％，其中提取模型为3.2％，纯化模型为4.8％。

Claims

1.一种对丹酚酸B生产在线含量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

称取丹参药材共50kg，置于500L提取罐中，加5.5倍量水，煎煮提取1小时，得提取液；药渣进行第二次提取，加入3倍量水，煎煮提取0.5小时，得提取液，提取液合并后，用聚酰胺树脂或大孔树脂纯化；在提取及纯化过程中，每隔2-5mmin采谱1次，采集波段9815-5430cm^-1，每次采集2张谱图；采谱的同时取样进行HPLC检测，样品编号一一对应；

丹酚酸B含量的HPLC测定方法：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，5um，4.6×250mm；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水＝30∶10∶1∶59；检测波长：286nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：5ul；对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成浓度约为0.14mg/ml的溶液；供试品溶液的制备：精密量取适量提取液或洗脱液，用75％甲醇稀释至10ml，摇匀，用0.45um滤膜过滤，取滤液即得。