CN105352910B - 一种栀子萃取过程快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种栀子萃取过程快速检测方法，通过采集不同批次的栀子萃取液样本，测定栀子萃取液中的关键指标浓度，采集栀子萃取液样本的中红外光谱图；选择合适的光谱预处理方法和建模波段，采用偏最小二乘法，分别建立定量校正模型，利用该模型对验证集的栀子萃取过程样品进行浓度检测从而实现对未知栀子萃取过程样品的浓度检测。本发明引入中红外光谱技术作为栀子萃取过程的检测方法，可快速检测栀子萃取过程中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度变化，所建立的分析方法满足快速、有效的实际生产要求，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于中红外快速检测领域，具体涉及一种栀子萃取过程质控指标浓度的快速检测方法。
背景技术
栀子系茜草科植物栀子的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒及外用消肿止痛的功效。栀子主要含有环烯醚萜苷类、有机酸类、挥发油类、黄酮类、香豆素类等化合物，且以环烯醚萜苷类为其主要活性成分，该类成分具有保肝、利胆、解痉、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性，目前栀子已是“复方栀子止痛膏”、“热毒宁注射液”、“清开灵注射液”等中药大品种的主要原药材。栀子萃取过程作为生产浸膏的一个重要过程，其有效成分的变化对后续精制过程有重要影响。
中红外光谱技术，作为一种快速分析方法，具有很多优点: （1）快速，可实现现场和在线分析；（2）是一种无损分析技术；（3）环保；（4）可对固体、液体和气体样品直接进行测定，无需复杂的前处理过程。 中红外光谱技术在石油，烟草，药品等领域的应用也取得了良好进展，特别是近几十年来随着化学计量学的不断发展，中红外光谱在过程分析中的应用愈加广泛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种栀子萃取过程快速检测方法，通过以下步骤实现：
（1）采集热毒宁注射液大生产中6个不同批次的栀子萃取过程样本；
（2）采用高效液相色谱法测定这些样本的关键质控指标：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度；
（3）采集步骤（1）中6批栀子萃取过程样本的中红外镜反射光谱图；
（4）检测样本质量：选取5批栀子萃取过程样本作为校正集并通过偏最小二乘法建立栀子萃取过程中各质控指标的中红外定量模型，利用该模型对剩余的1批栀子萃取过程样本（验证集）进行预测并与步骤（2）中高效液相色谱法所测得值进行对比，从而实现对未知的栀子萃取过程样品进行浓度检测。
本发明方法的具体方案如下：
（1）采集热毒宁注射液大生产中6个不同批次的栀子萃取过程样品：
取5倍量正丁醇进行萃取，流速40-60 L/h，萃取塔200 L/组，母液罐2000 L，每批次得到萃取液2.5吨，萃取液储罐5000 L，用时6-8 h，间隔20~40 min取样，每次取样约10mL，共6个批次，所有样本均从萃取塔最上层同一位置采集。
（2）测定栀子萃取过程样本的关键质控指标：
采用高效液相色谱法测定栀子萃取过程样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度。
高效液相色谱法测定栀子萃取样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度：将栀子萃取液样品精密吸取1mL至50 mL量瓶中，加入体积分数为50%的甲醇的溶解，并稀释至刻度，然后用0.45 μm 有机滤膜滤过所得液，即为分析进样。液相色谱条件：色谱柱：XBridge C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈和体积分数0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0~10 min，体积分数5%~10%的乙腈；10~15 min，体积分数10%~14%的乙腈；15~20 min，体积分数14%的乙腈；体积流量1 mL/min；柱温：30 ℃；新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸检测波长为237 nm，京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷检测波长为324 nm，进样量10 μL。
3. 采集栀子萃取过程样本的中红外镜反射光谱图；
将栀子萃取样本取0.5 mL至BRUKER ALPHA中红外光谱仪准直镜面上，采用镜反射法采集中红外光谱，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1，通过3次重复装样扫描后求平均得到该样品的最终光谱图；以空气为参比，扫描光谱范围为600~4000 cm-1。
4. 检测样本质量：采用5批栀子萃取过程的样本通过偏最小二乘法建立栀子萃取过程中各质控指标的中红外定量模型，并利用该模型对剩余的1批栀子萃取过程样本（验证集）进行预测并与（2）中高效液相色谱法所测得值进行对比，从而实现对未知的栀子萃取过程样品进行浓度检测。
采用德国BRUKER公司配套的OPUS7.0数据处理软件，通过对光谱进行预处理和波段选择后采用偏最小二乘法（PLS）分别建立中红外光谱数据与新绿原酸浓度、中红外光谱数据与绿原酸浓度、中红外光谱数据与隐绿原酸浓度、中红外光谱数据与京尼平苷酸浓度、中红外光谱数据与去乙酰车叶草酸甲酯浓度、中红外光谱数据与京尼平龙胆双糖苷浓度及中红外光谱数据与栀子苷浓度的定量校正模型，并通过各模型评价指标考察模型性能。
具体地，在上述步骤（4）中，新绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择最大最小归一化处理，建模波段选择599~1958 cm-1和2297~2638 cm-1；绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择一阶导数加减去一条直线处理，波段选取为938~1602 cm-1和1958~2299cm-1；隐绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择多元散射矫正处理，建模波段选择938~1958 cm-1；京尼平甘酸浓度定量校正模型的预处理方法选择最小最大归一化处理，波段选取为599~1279 cm-1+1618~1958cm-1+2297~2638 cm-1和3656~3997 cm-1；去乙酰车叶草酸甲酯浓度定量校正模型的预处理方法选择多元散射矫正处理，波段选择为940~599 cm-1+1618~2299 cm-1+2638~2979 cm-1和3371~3658 cm-1；京尼平龙胆双糖苷浓度定量校正模型的预处理方法选择消除常数偏移，波段选取为1279~1958 cm-1和2638~2979 cm-1；栀子苷浓度定量校正模型的预处理方法选择一阶导数加减去一条直线处理，波段选取为938~1279 cm-1+1618~2299 cm-1和2638~2979 cm-1利用偏最小二乘法所建立的定量校正模型，其模型评价指标包括：留一交叉验证决定系数（R2）、校正集误差均方根（RMSEC）、留一交叉验证均方根差（RMSECV），新绿原酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的新绿原酸浓度预测偏差为7.90%；绿原酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的绿原酸浓度预测偏差为2.77%；隐绿原酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的隐绿原酸浓度预测偏差为9.51%；京尼平苷酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的京尼平苷酸浓度预测偏差为5.25%；去乙酰车叶草酸甲酯浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的去乙酰车叶草酸甲酯预测偏差为7.71%；京尼平龙胆双糖苷浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的京尼平龙胆双糖苷浓度预测偏差为5.59%；栀子苷浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的栀子苷浓度预测偏差为2.79%。
以下为模型性能评价指标的具体计算公式：
n为用于检验模型的验证集样本数， m为校正集样品数，Ci为校正集样品i的参考值，为建立模型与去除样品i时样品i的预测值。
当决定系数值接近于1，校正集误差均方根和留一交叉验证均方根差越小，说明模型的预测能力较高、稳定性好。
本发明引入中红外光谱技术作为栀子萃取过程的检测方法，可快速检测栀子萃取过程中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度变化，所建立的分析方法满足快速、有效的实际生产要求，应用前景广阔。本发明将中红外光谱技术结合偏最小二乘法，应用于栀子萃取过程中关键指标的测定。本方法实现简单，模型预测能力强，稳定性高，具有很强的外推、泛化能力。
附图说明
图1是栀子萃取过程中的原始中红外光谱。
图2是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的新绿原酸浓度预测值与实际测定趋势对照图。
图3是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的绿原酸浓度预测值与实际测定趋势对照图。
图4是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的隐绿原酸浓度预测值与实际测定趋势对照图。
图5是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的京尼平苷酸浓度预测值与实际测定趋势对照图。
图6是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的去乙酰车叶草酸甲酯浓度预测值与实际测定趋势对照图。
图7是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的京尼平龙胆双糖苷浓度预测值与实际测定趋势对照图。
图8是栀子萃取过程的中红外定量模型验证集样本的栀子苷浓度预测值与实际测定趋势对照图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1：采用偏最小二乘法建立新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度测定中红外定量分析模型。
1.栀子萃取液样品收集
栀子萃取过程用料配比为采用5倍量正丁醇进行萃取，流速40-60 L/h，萃取塔200L/组，母液罐2000 L，每批萃取液2.5吨，萃取液储罐5000 L，用时6-8 h，每批次间隔20~40 min取样，每次取样约10 mL，所有样本均从萃取塔最上层同一位置采集。
2.关键指标的测定
新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度测定：
样品预处理：将栀子萃取液样品精密吸取1 mL至50 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解，并稀释至刻度，然后用0.45 μm 有机滤膜滤过所得液，即为分析进样。
液相色谱条件：色谱柱：XBridge C18 （4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈和体积分数0.1%的磷酸水溶液，梯度洗脱：0~10 min，体积分数5%~10%的乙腈；10~15 min，体积分数10%~14%的乙腈；15~20 min，体积分数14%的乙腈；体积流量1 mL/min；柱温：30 ℃；新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸检测波长为237 nm，京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷检测波长为324 nm，进样量10 μL。
3.中红外光谱数据采集
精密量取栀子萃取样本0.5 mL至BRUKER ALPHA中红外光谱仪准直镜面上，采用镜反射法采集中红外光谱，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1，通过3次重复装样扫描后求平均得到该样品的最终光谱图。
栀子萃取过程中采集到的原始中红外光谱见图1。
4.偏最小二乘法定量模型的建立和对验证集样品的预测
（1）建模波段选择和光谱预处理
新绿原酸建模波段选择599~1958 cm-1和2297~2638 cm-1；绿原酸建模波段选取为938~1602 cm-1和1958~2299 cm-1；隐绿原酸浓度定量校正模型建模波段选择938~1958 cm-1；京尼平甘酸浓度定量校正模型波段选取为599~1279 cm-1+1618~1958cm-1+2297~2638cm-1和3656~3997 cm-1；去乙酰车叶草酸甲酯浓度定量校正模型波段选择为940~599 cm-1+1618~2299 cm-1+2638~2979 cm-1和3371~3658 cm-1；京尼平龙胆双糖苷浓度定量校正模型波段选取为1279~1958 cm-1和2638~2979 cm-1；栀子苷浓度定量校正模型的波段选取为938~1279 cm-1+1618~2299 cm-1和2638~2979 cm-1。
为有效消除基线偏移，减少峰与峰之间的重叠并使有效信息显现出来，常采用导数处理方法，而为了降低导数计算引进的噪音，降低信噪比，最终新绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择最大最小归一化处理，绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择一阶导数加减去一条直线；隐绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择多元散射矫正处理；京尼平甘酸浓度定量校正模型的预处理方法选择最小最大归一化处理；去乙酰车叶草酸甲酯浓度定量校正模型的预处理方法选择多元散射矫正处理；京尼平龙胆双糖苷浓度定量校正模型的预处理方法选择消除常数偏移；栀子苷浓度定量校正模型的预处理方法选择一阶导数加减去一条直线处理。
表1为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的中红外模型建模结果参数。从表1可以看出，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的偏最小二乘法建立的中红外模型线性良好，决定系数均大于0.98，说明所建立的中红外定量模型效果较优，稳健性佳。
。
（2） 偏最小乘法定量校正模型对验证集样品的预测：
将建立的中红外定量校正模型分别用于预测剩余的15个验证集样品的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度，所得浓度实测值和中红外预测值的比较参见图2至图8，可以看出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度实测值与中红外预测值十分接近，其定量模型验证集的相对预测偏差值分别为7.90%、2.77%、9.51%，5.25%、7.71%、5.59%和2.79%，均控制在10%以内，符合实际生产精度要求，说明偏最小二乘法建立的定量校正模型可以用于栀子萃取过程中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度预测，并达到一定的预测准确精度。
由上述实例可知，在经过预处理和建模波段选择后，中红外光谱数据结合偏最小二乘法所得到模型校正集留一交叉验证决定系数都大于0.97，其中绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸和栀子苷四种含量较高物质的模型校正集留一交叉验证决定系数都大于0.99；留一交叉验证均方根差均小于0.5；对于验证集样本的相对预测偏差值，都能控制在10%以内，表明在栀子萃取过程中，采用中红外光谱快速检测建模对于栀子萃取液的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的浓度有稳定、准确的检测效果。
Claims (2)
1.一种栀子萃取过程快速检测方法，通过以下步骤实现：
（1）采集热毒宁注射液大生产中6个不同批次的栀子萃取过程样本；
（2）采用高效液相色谱法测定这些样本中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷浓度；
（3）采集栀子萃取过程样本的中红外镜反射光谱图；
（4）选取5个批次为校正集，采用偏最小二乘法建立栀子萃取过程中各质控指标的中红外定量模型，并利用该模型实现对剩余的一个批次的栀子萃取过程样品进行浓度检测;
其特征在于：步骤（1）所述为在热毒宁注射液大生产中，栀子萃取过程中用5倍量正丁醇进行萃取，流速40-60 L/h，萃取塔200 L/组，母液罐2000 L，所有样本均从萃取塔最上层同一位置采集;
步骤（2）所述高效液相色谱法的色谱条件为： XBridge C18，4.6×250 mm，5 μm，色谱柱；流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0~10 min， 5%~10%的乙腈；10~15 min，10%~14%的乙腈；15~20 min， 14%的乙腈；体积流量1 mL/min；柱温：30 ℃；新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸检测波长为237 nm，京尼平苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷检测波长为324 nm;
步骤（3）中将栀子萃取样本精密量取0.5 mL至中红外光谱仪准直镜面上，采用镜反射法采集中红外光谱，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1，通过3次重复装样扫描后求平均得到该样品的最终光谱图；
步骤（4）中新绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择最大最小归一化处理，建模波段选择599~1958 cm-1和2297~2638 cm-1；绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择一阶导数加减去一条直线处理，波段选取938~1602 cm-1和1958~2299 cm-1；隐绿原酸浓度定量校正模型的预处理方法选择多元散射矫正处理，建模波段选择938~1958 cm-1；京尼平甘酸浓度定量校正模型的预处理方法选择最小最大归一化处理，波段选取599~1279 cm-1+1618~1958cm-1+2297~2638 cm-1和3656~3997 cm-1；去乙酰车叶草酸甲酯浓度定量校正模型的预处理方法选择多元散射矫正处理，波段选择为940~599 cm-1+1618~2299 cm-1+2638~2979 cm-1和3371~3658 cm-1；京尼平龙胆双糖苷浓度定量校正模型的预处理方法选择消除常数偏移，波段选取为1279~1958 cm-1和2638~2979 cm-1；栀子苷浓度定量校正模型的预处理方法选择一阶导数加减去一条直线处理，波段选取为938~1279 cm-1+1618~2299 cm-1和2638~2979 cm-1。
2.根据权利要求1所述的一种栀子萃取过程快速检测方法，其特征在于：步骤（4）中新绿原酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的新绿原酸浓度预测偏差为7.90%；绿原酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的绿原酸浓度预测偏差为2.77%；隐绿原酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的隐绿原酸浓度预测偏差为9.51%；京尼平苷酸浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的京尼平苷酸浓度预测偏差为5.25%；去乙酰车叶草酸甲酯浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的去乙酰车叶草酸甲酯预测偏差为7.71%；京尼平龙胆双糖苷浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的京尼平龙胆双糖苷浓度预测偏差为5.59%；栀子苷浓度定量校正模型对验证集的栀子萃取过程样品的栀子苷浓度预测偏差为2.79%。
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