CN104569192A - 一种大叶千斤拔的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大叶千斤拔的质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两个部分。本发明提供了一种常用中药材大叶千斤拔的质量检测方法。相对于现有技术，本发明提供的方法稳定性好，灵敏度高，能更简便、更直观的鉴定原药材，为大叶千斤拔的定性定量检测提供依据，而且可以更好的保障以大叶千斤拔入药的药物质量和疗效，更好的利用大叶千斤拔的药材资源。
Description
技术领域
本发明涉及中药的质量检测方法，具体涉及一种大叶千斤拔的质量检测方法。
背景技术
大叶千斤拔为蝶形花科千斤拔属大叶千斤拔Flemingia macrophylla(Willd.)Prain.的干燥根，为云南、湖南、广西、广东等省的常用中药，其中湖南、广西地方标准记载有千斤拔的原植物大叶千斤拔的质量标准仅有药材性状描述及显微特征记录，这对开发新药有很大程度的影响。
大叶千斤拔属植物主要含有黄酮、萜、甾类等成分，其中以黄酮类物质为主，大部分是异黄酮，而其中更是以异戊烯基取代的异黄酮类化合物占大多数。
近年来，随着研究的深入大叶千斤拔药材越来越多应用于临床的各种制剂，其表现很强的药理活性，主要有抗炎止痛，降血糖，抗癌，促骨髓细胞生成作用，免疫调节作用，抗疟疾，抗菌，收缩子宫平滑肌等方面。
大叶千斤拔药材在作为治疗妇科疾病药物中原药材应用已广泛推广，并投入工业生产多年。申请人的主导品种妇科千金片中的君药就以大叶千斤拔入药，效果显著，产品受到广泛消费者的亲睐。
大叶千斤拔尽管药用历史悠久，临床应用广泛，但一直以来对其有效成分缺乏系统研究，其质量缺乏有效的控制标准，阻碍了大叶千斤拔的深入开发利用。
现有文献中对大叶千斤拔的研究报道不多，现有文献中报道了染料木苷、染料木素，在大叶千斤拔中是活性较强的黄酮类化合物。
《染料木苷对FFAs诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的影响》，中西医结合研究2010年8月底2卷第4期，报道了，染料木苷具有改善胰岛素抵抗的作用等药理活性。
《燃料木素的药理作用》，药学与临床研究2010.Jun；18(3)，报道了，染料木素能显著降低去卵巢大鼠总胆固醇及肝胆固醇的含量，并能有效防治慢性缺氧性动脉高压，并报道染料木素具有较强的氧化应急损伤保护作用等药理活性。
因此，对大叶千斤拔的深入开发利用，寻找简便、高效的质量检测方法，提高其入药的药效，提高药品质量的可控性，降低成本是申请人要解决的一大难题。
有关千斤拔质量检测方法的报道如下：
《三种千斤拔的化学成分预分析和薄层鉴定》，西南民族大学学报.自然科学报公开了薄层色谱分析方法，取样品粉末(过3号筛)2g，加50mL甲醇，超声30min，过滤，将滤液挥干，残渣加1mL甲醇溶解，作为供试品。以染料木素、5，7，2'，4'-四羟基异黄酮、3，5，7，3'，5'-五羟基-4'-甲氧基黄烷的甲醇溶液作为对照品，照2010版《中国药典》薄层色谱法(附录ⅥB)实验.吸取适量供试品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(9:1)为展开剂，展开前饱和15min，之后展开，取出，晾干，喷10％硫酸乙醇溶液，105℃加热2-3min。从文中图谱显示，大叶千斤拔分离度较低。
CN201410015559.1(CN103760263A)提供了一种蔓性千斤拔的质量检测方法，其中供试品溶液的制备方法包括以下步骤：取蔓性千斤拔药材粉末(过四号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加20％甲醇溶液10mL使其溶解，加在聚酰胺柱(60-80目，5g，内径1.5cm)上，以80％甲醇溶液120mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使其溶解，转移至10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声处理(功率250W，频率50kHz)15分钟，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；供试品溶液的含量测定：C18色谱柱：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸溶液(B)梯度洗脱，见下表，流速1.0mL/min，检测波长为258nm，柱温30℃，进样量10μl。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-15 | 10 | 90 |
| 15-17 | 10-13 | 90-87 |
| 17-30 | 13 | 87 |
| 30-32 | 13-15 | 87-85 |
| 32-55 | 15 | 85 |
上述方法中供试品制备方法复杂，回收率低，最低检测限较高。
经过长期理论研究及工业生产实践，申请人找到了大叶千斤拔的最佳的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种大叶千斤拔的质量检测方法。
本发明提供的一种大叶千斤拔的质量检测方法，其中包括鉴别和含量测定两个部分。
作为本发明的质量检测方法的第一部分，所述鉴别包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照药材溶液的制备、检测。
上述鉴别方法中：
所述供试品溶液的制备，其优选方案一包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0-6.0g，加入100-200mL乙醇和水的混合物(乙醇和水的体积比为85：15，混合物中乙醇的浓度为84.15％，下同)，在30℃下60Hz超声提取30-50min，冷却后水浴蒸干，加10-30mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次100mL，后一次50mL)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
进一步优选，方案一包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL乙醇和水的混合物(V/V，85：15)，在30℃下60Hz超声提取40min，冷却后水浴蒸干，加20mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次100mL，后一次50mL)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
所述供试品溶液的制备，其优选方案二包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0-6.0g，加入100-200mL浓度为95％的乙醇，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入10-30mL水溶解，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
进一步优选，方案二包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL浓度为95％的乙醇，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入20mL水溶解，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
所述供试品溶液的制备，其优选方案三(检测效果较佳方案)包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0-6.0g，加入100-200mL浓度为95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入10-30mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v＝60:40-80:20，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
进一步优选，方案三(检测效果最佳方案)包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL浓度为95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入20mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v＝70:30，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
所述对照药材溶液的制备包括以下步骤：取购买的大叶千斤拔药材粉末1.0-2.0g，加20-30mL甲醇，热回流提取1h-3h，过滤，蒸干，加1-3mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。
优选地，所述对照药材溶液的制备包括以下步骤：取购买的大叶千斤拔药材粉末1.0g，加20mL甲醇，热回流提取1h，过滤，蒸干，加1mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。
所述检测方法包括以下步骤：取上述供试品溶液及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚-丙酮(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
作为本发明质量检测方法的第二部分，所述含量测定方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件和检测。
所述色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温：35℃；进样量：20μL。
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
表1 梯度洗脱程序
| 时间 | 乙腈 | 0.1％磷酸 |
| 0 | 3 | 97 |
| 35 | 38 | 62 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 3 | 97 |
具体的，所述含量测定方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：
方案一：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0-6.0g，加入100-200mL乙醇和水的混合物(85：15)，在30℃下60Hz超声提取30-50min，冷却后水浴蒸干，加10-30mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次100mL，后一次50m1)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
方案一优选：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL乙醇和水的混合物(85：15)，在30℃下60Hz超声提取40min，冷却后水浴蒸干，加20mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次l00mL，后一次50m1)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
所述供试品溶液的制备方法还可以用以下方案二代替方案一：
方案二：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0-6.0g，加入95％乙醇100-200mL，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入10-30mL水溶解，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
方案二优选：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入95％乙醇150mL，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入20mL水溶解，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
所述供试品溶液的制备方法还可以用以下方案三代替方案一或方案二：
方案三：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0-6.0g，加入100-200mL95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入10-30mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v，60:40-80:20，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
方案三优选：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL 95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入20mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v＝70:30，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
上述供试品溶液的制备方法中，最优选为方案三。
2)对照品溶液的制备：精密称取染料木苷和染料木素对照品各7.1mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成含染料木苷和染料木素0.71mg/mL和0.71mg/mL的混合对照品贮备溶液，分别吸取0.15mL，0.3mL，0.6mL，1.2mL，2.4mL于5mL的容量瓶中定容，配制成浓度分别为21.3μg/mL，42.6μg/m，85.2μg/mL，170.4μg/mL，340.8μg/mL，710.0μg/mL梯度试液；
3)含量测定：
取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰；
所述色谱条件下，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为(23-24)min和(37-38)min，且分离度较好；
优选地，所述色谱条件下，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.9min和37.6min，且分离度较好。
本发明提供的质量检测方法，所述染料木苷含量为：1.087-1.247mg/g，染料木素含量为：0.481-0.514mg/g。
与现有技术相比，本发明提供的大叶千斤拔的质量检测方法具有以下优点：
1、本发明提供的质量检测方法中：
1)供试品溶液的制备：
方案一与方案二中，用乙酸乙酯萃取，方便薄层点板，可以不用甲醇定容，直接用乙酸乙酯层点板，节省工序，既经济方便，又安全可靠。
方案三中，采用的是固相萃取，而固相萃取具有溶剂用量少，时间短，操作简便，省时省力，经济性强的特点，方法可靠，又方便实用，可大力推广。另外，固相萃取还能剔除供试品溶液中的一些如糖类、氨基酸、蛋白质、水溶性色素等杂质成分。
本发明在供试品溶液的制备中，用同种方法制备出来的供试品溶液既可以用来做薄层分析，又可以用来做高效液相分析，定性检测和定量检测可以共用同一种供试品溶液，大大节省了溶剂的使用量，也节省了时间和人力成本，简化了供试品溶液的前处理过程。
2)本发明提供的鉴别方法中：本发明中薄层色谱鉴别方法提供了一种更快速，更灵敏，分离和重现效果更好的检测方法。
3)高效液相色谱法同时检测染料木苷及染料木素两种典型的黄酮类化合物，这2个活性成分作为含量测定的指标，为评价该药材质量的优劣提供技术支持。
2、本发明提供了一种常用中药材大叶千斤拔的质量检测方法。相对于现有技术，本发明提供的方法稳定性好，灵敏度高，能更简便、更直观的鉴定原药材，为大叶千斤拔的定性定量检测提供依据，而且可以更好的保障以大叶千斤拔入药的药物质量和疗效，更好的利用大叶千斤拔的药材资源。
3、现有技术中，报道的总黄酮含量为2.5mg/g左右，而大叶千斤拔中黄酮类成分有几十甚至上百种，因此，本发明检测方法中，单体化合物的含量比现有技术中单体化合物的含量高。
附图说明
图1：染料木苷和染料木素与峰面积的线性关系；
图2：薄层分析色谱图(其中供试品溶液的制备方法按照实施例1中第3项下的方法八制备)；
图3：染料木苷和染料木素的标准品色谱图；
图4：含量测定色谱图(其中供试品溶液的制备方法按照实施例1中第3项下的方法八制备)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：检测
1材料、设备及试剂
1.1材料：
大叶千斤拔样品：来源于广西，采样时间为2014年04月20日。
对照品：染料木苷(供含量测定用，批号：MUST-120220707)购于北京恒元启天化工技术研究院；染料木素(供含量测定用，批号111704-200501)购于中国药品生物制品检定所。
对照药材：购自中国食品药品检定研究院，规格：2.5g。
1.2设备
Agilent Thchnologies 1200series高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；
AB204-S型1/10万电子分析天平(德国梅特勒-托利多仪器有限公司)；
KQ5200DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；
FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；
恒温水浴箱(金坛市大地自动仪器厂)；
OSB-2100油浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；
N-1100真空旋转式蒸发器(上海爱朗仪器有限公司)。
1.3试剂
乙腈(美国Merck公司，色谱纯)
甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)
冰醋酸(湖南汇虹试剂有限公司，分析纯)
磷酸(湖南汇虹试剂有限公司，分析纯)
乙酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)
三氯甲烷(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)
2、色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈和0.1％磷酸水溶液；洗脱程序：见表1；流速为1mL/min，柱温：35℃；进样量：20μL；理论塔板数：以染料木苷和染料木素计，不低于5000；分离度：以染料木苷和染料木素计算，大于1.50。
表1 梯度洗脱程序
| 时间 | 乙腈 | 0.1％磷酸 |
| 0 | 3 | 97 |
| 35 | 38 | 62 |
| 40 | 50 | 50 |
| 45 | 3 | 97 |
3、供试品溶液的制备：
方法一：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0g，加入100mL乙醇和水的混合物(体积比为85：15，折合乙醇的浓度为84.15％)，在30℃下60Hz超声提取30min，冷却后水浴蒸干，加10mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次100mL，后一次50mL)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
方法二：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL乙醇和水的混合物(体积比为85：15，相当于乙醇浓度为84.15％)，在30℃下60Hz超声提取40min。冷却后水浴蒸干，加20mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次100mL，后一次50mL)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
方法三：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)6.0g，加入200mL乙醇和水的混合物(体积比为85：15，相当于乙醇浓度为84.15％)，在30℃下60Hz超声提取50min，冷却后水浴蒸干，加30mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次(前两次100mL，后一次50mL)，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
方法四：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0g，加入100mL浓度为95％的乙醇，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入10mL水溶解，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL，摇匀得供试品溶液。
方法五：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL浓度为95％的乙醇，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入20mL水，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物甲醇定容至10mL，摇匀得供试品溶液。
方法六：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)6.0g，加入200mL浓度为95％的乙醇，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入30mL水，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液于真空旋转式蒸发器中蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL，摇匀得供试品溶液。
方法七：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)4.0g，加入100mL浓度为95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入10mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v＝60:40，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
方法八：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)5.0g，加入150mL浓度为95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入20mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v＝70:30，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
方法九：大叶千斤拔药材粉末(过40目筛)6.0g，加入200mL浓度为95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入30mL水，进行固相萃取(型号：C18)，先后以水(50mL)、甲醇和水的混合物(v:v＝80:20，50mL)为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
4、对照药材溶液的制备：
方法一：取购买的大叶千斤拔药材粉末2.0g，加30mL甲醇，热回流提取3h，过滤，蒸干，加3mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。
方法二：取购买的大叶千斤拔药材粉末1.0g，加20mL甲醇，热回流提取1h，过滤，蒸干，加1mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。
5、对照品溶液的制备
精密称取染料木苷和染料木素对照品各7.1mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成含染料木苷和染料木素0.71mg/mL和0.71mg/mL的混合对照品贮备溶液。分别吸取0.15mL，0.3mL，0.6mL，1.2mL，2.4mL于5mL的容量瓶中定容，配制成浓度分别为21.3μg/mL，42.6μg/mL，85.2μg/mL，170.4μg/mL，340.8μg/mL，710.0μg/mL梯度试液。
6、标准曲线制作
用已制备的梯度浓度过0.45μm的滤膜，色谱仪中按上述2设定的色谱仪参数进行检测，并记录峰面积。以峰面积为纵坐标，染料木苷和染料木素的浓度(μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，得到染料木苷的回归方程为Y＝85.252X+538.42，r＝0.9998染料木素的回归方程为Y＝107.14X+1170.3，r＝0.9983，结果表明，染料木苷和染料木素在浓度为4.26μg/mL-710μg/mL范围内线性关系良好，具体如图1所示。
6.1精密度实验
用“5”项下制得的混合对照品溶液，按“2”项色谱条件下进行测定，重复进样6次，记录峰面积，计算精密度。
结果见表2。
表2 染料木苷和染料木素精密度实验结果
表2结果显示：染料木苷和染料木素的RSD分别为0.92％和1.54％，结果表明仪器精密度良好。
注：在含量测定过程中，检测精密度是为了证明检测仪器的精密度良好，不会影响试验结果的准确度。
6.2稳定性实验
6.2.1取千斤拔样品，按“3”项(方法二)方法下处理，制备供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，24h时，按“2”项色谱条件下测定，记录检测的峰面积。
结果见表3。
表3 染料木苷和染料木素稳定性比较
表3结果显示：染料木苷和染料木素峰面积的RSD分别为1.92％和1.41％，说明其有效成分染料木苷和染料木素的含量均在24h内稳定可控。
注：方法七、方法八、方法九可以只做一个稳定性实验，因为其制备方法一样，唯一的区别就在于参数。
6.2.2取大叶千斤拔样品，按“3”项(方法五)方法下处理，制备供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，24h时，按“2”项色谱条件下测定，记录检测的峰面积。
结果见表4。
表4 染料木苷和染料木素稳定性比较
表4结果显示：染料木苷和染料木素峰面积的RSD分别为2.93％和1.60％，说明其有效成分染料木苷和染料木素的含量均在24h内稳定可控。
注：方法四、方法五、方法六可以只做一个稳定性实验，因为其制备方法一样，唯一的区别就在于参数。
6.2.3取大叶千斤拔样品，按“3”项(方法八)方法下处理，制备供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，24h时，按“2”项色谱条件下测定，记录检测的峰面积。
结果见表5。
表5 染料木苷和染料木素稳定性比较
表5结果显示：染料木苷和染料木素峰面积的RSD分别为2.19％和1.59％。
结果说明：其有效成分染料木苷和染料木素的含量均在24h内稳定可控。
注：方法一、方法二、方法三可以只做一个稳定性实验，因为其制备方法一样，唯一的区别就在于参数。
6.3重复性试验
6.3.1取大叶千斤拔样品6份，精密称定，按照“3”项(方法二)方法下处理，平行制备6份供试品溶液，在“2”项色谱条件下测定，分别测定6份样品中的染料木苷和染料木素的含量，计算RSD值。
结果见表6。
表6 染料木苷和染料木素重复性实验结果
表6结果显示：染料木苷和染料木素的RSD值分别为2.71％和0.88％。
结果表明，该方法重复性良好。
注：方法一、方法二、方法三可以只做一个重复性实验，因为其制备方法一样，唯一的区别就在于参数。
6.3.2取大叶千斤拔样品6份，精密称定，按照“3”项(方法五)方法下处理，平行制备6份供试品溶液，在“2”项色谱条件下测定，分别测定6份样品中的染料木苷和染料木素的含量，计算RSD值。
结果见表7。
表7 染料木苷和染料木素重复性实验结果
表7结果显示：染料木苷和染料木素的RSD值分别为0.81％和0.65％。
结果表明，该方法重复性良好。
注：方法四、方法五、方法六只需做一个重复性实验，因为其制备方法一样，唯一的区别就在于参数。
6.3.3取大叶千斤拔样品6份，精密称定，按照“3”项(方法八)方法下处理，平行制备6份供试品溶液，在“2”项色谱条件下测定，分别测定6份样品中的染料木苷和染料木素的含量，计算RSD值。
结果见表8。
表8 染料木苷和染料木素重复性实验结果
表8结果显示：染料木苷和染料木素的RSD值分别为0.72％和0.54％。
结果表明：该方法重复性良好。
注：方法七、方法八、方法九可以只需做一个重复性实验，因为其制备方法一样，唯一的区别就在于参数。
7、检测方法：
7.1鉴别：
7.1.1取上述供试品溶液(方法一)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.2取上述供试品溶液(方法二)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.3取上述供试品溶液(方法三)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.4取上述供试品溶液(方法四)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.5取上述供试品溶液(方法五)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.6取上述供试品溶液(方法六)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.7取上述供试品溶液(方法七)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.1.8取上述供试品溶液(方法八)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。(色谱图见附图2)
7.1.9取上述供试品溶液(方法九)及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上。以石油醚和丙酮的混合物(V/V，2:1)为展开剂，展开，取出晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰。日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
7.2含量测定：
7.2.1取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法一)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为24.0min和38.0min，且分离度较好，峰面积分别为401258和498568，含量分别为1.087和0.481。
7.2.2取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法二)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为24.0min和37.6min，且分离度较好。峰面积分别为402965和485785，含量分别为1.147和0.489。
7.2.3取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法三)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.2min和38min，且分离度较好。峰面积分别为401254和498856，含量分别为1.124和0.483。
7.2.4取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法四)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.5min和37.9min，且分离度较好。峰面积分别为413368和501245，含量分别为1.129和0.485。
7.2.5取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法五)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.9min和37.7min，且分离度较好。峰面积分别为409985和504452，含量分别为1.158和0.491。
7.2.6取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法六)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.0min和37.0min，且分离度较好。峰面积分别为415245和511242，含量分别为1.132和0.487。
7.2.7取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法七)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.7min和37.8min，且分离度较好。峰面积分别为420152和520012，含量分别为1.210和0.501。
7.2.8取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法八)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.9min和37.6min，且分离度较好。峰面积分别为422515和523365，含量分别为1.247和0.514。(色谱图见附图3、附图4)
7.2.9取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液(方法九)分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
结果显示，染料木苷和染料木素在HPLC图中的保留时间分别为23.8min和37.5min，且分离度较好。峰面积分别为421544和521145，含量分别为1.213和0.510。
实施例2：
1、对比例1：取本发明中的大叶千斤拔药材粉末(过四号筛)2g，按CN201410015559.1发明内容中供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，并按CN201410015559.1发明内容中的色谱条件测定染料木苷与染料木素的含量。
2、取本发明中的大叶千斤拔药材粉末(过四号筛)2g按照本发明实施例中供试品溶液的制备方法(方法一、方法二、方法三、方法四、方法五、方法六、方法七、方法八、方法九)制备供试品溶液，按CN201410015559.1发明内容中的色谱条件，测定染料木苷与染料木素的含量。
实验结果见表9：
表9 染料木苷与染料木素的含量对比
以上结果表明：用本发明供试品溶液的制备方法制备的供试品溶液，在含量测定过程中，含量均比对比例1的含量高。
结果表明，本发明的检测方法较现有技术好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种大叶千斤拔的质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两个部分。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述鉴别包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照药材溶液的制备和检测。
3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述含量测定方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件和检测。
4.根据权利要求2或3所述的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末4.0-6.0g，加入100-200mL体积比为85：15的乙醇和水的混合物，在30℃下60Hz超声提取30-50min，冷却后水浴蒸干，加10-30mL蒸馏水溶解，然后乙酸乙酯萃取3次，前两次l00mL，后一次50m1，放置20min，取上层合并蒸干，加10mL色谱纯甲醇充分溶解，滤过，取滤液，即得。
5.根据权利要求2或3所述的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末4.0-6.0g，加入100-200mL浓度为95％的乙醇，于70℃回流提取1h，过滤，回收乙醇，得浸膏，浸膏加入10-30mL水溶解，加入200mL乙酸乙酯萃取，取上层清液蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL，摇匀得供试品溶液。
6.根据权利要求2或3所述的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：大叶千斤拔药材粉末4.0-6.0g，加入100-200mL浓度为95％的乙醇，于水浴中80℃回流提取1h，过滤，滤液加入10-30mL水，进行固相萃取，先后以50mL水、50mL体积比为60：40-80：20的甲醇和水的混合物为洗脱剂，洗脱液浓缩蒸干，蒸干后的固体物用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀得供试品溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述鉴别包括以下步骤：
供试品溶液的制备：采用权利要求4-6任一项所述的供试品溶液的制备方法；
对照药材溶液的制备：取购买的大叶千斤拔药材粉末1.0-2.0g，加20-30mL甲醇，热回流提取1h-3h，过滤，蒸干，加1-3mL甲醇溶解，作为对照药材溶液；
所述检测方法：取上述供试品溶液及对照药材溶液各15μL，分别点于同一硅胶G板上，以体积比为2：1的石油醚-丙酮为展开剂，展开，取出晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液适量，在105℃加热至斑点清晰，日光下检视，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置显相同颜色的斑点。
8.根据权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈和0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温：35℃；进样量：20μL。
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
表1 梯度洗脱程序
。
9.根据权利要求1-6任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：选用权利要求4-6任一项所述的供试品溶液的制备方法；
2)对照品溶液的制备：精密称取染料木苷和染料木素对照品各7.1mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成含染料木苷和染料木素0.71mg/mL和0.71mg/mL的混合对照品贮备溶液，分别吸取0.15mL，0.3mL，0.6mL，1.2mL，2.4mL于5mL的容量瓶中定容，配制成浓度分别为21.3μg/mL，42.6μg/m，85.2μg/mL，170.4μg/mL，340.8μg/mL，710.0μg/mL梯度试液；
3)色谱条件：所述色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温：35℃；进样量：20μL；
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
表1 梯度洗脱程序
4)测定方法：取大叶千斤拔样品，将等量的对照品溶液和供试品溶液分别稀释25倍，微孔滤膜过滤后，按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰。
10.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，所述染料木苷含量为：1.087-1.247mg/g，染料木素含量为：0.481-0.514mg/g。
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