CN107632086B - 一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法及应用,其方法包括:供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件的优化、确定和指纹图谱测定,以及对得到的参枝苓口服液指纹图谱进行分析处理,本发明采用不同固定相的色谱柱直接串联,同一流动相梯度洗脱,多种特征性指标成分得到了良好分离,相比于现有建立的指纹图谱法,能实现参枝苓口服液尽可能多的特征性成分被分离检测,得到更多的指纹图谱特征峰,更全面地反映参枝苓口服液的成分信息,该方法还具有操作简便、精密度高、稳定性和重复性良好等优点,可以为参枝苓口服液质量控制评价提供更有效、更全面的方法依据,确保药品的有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及高效液相色谱利用领域以及中药制剂分析质量控制领域,具体地,涉及一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法及应用,尤其是涉及一种基于色谱柱串联建立的改进的参枝苓口服液HPLC指纹图谱的构建方法以及由此方法得到的指纹图谱在参枝苓口服液的质量控制中的应用。
背景技术
参枝苓口服液由党参、桂枝、白芍、甘草、茯苓、石菖蒲、远志、干姜、龙骨、牡蛎十味药材制成,具有良好的益气温阳、化痰安神的功效,适用于轻中度阿兹海默病所显现的心气不足证,主要表现为健忘、心悸、头晕、失眠、少气烦言、舌质淡、表情淡漠、神疲乏力、脉虚无力等症。
目前,参枝苓口服液的质量标准中只有肉桂酸和芍药苷作为含量测定指标,标准中的质量控制方法对于处方复杂、成分繁多的参枝苓口服液不能全面反映其质量。中药指纹图谱在中药质量控制和药效成分研究等方面具有重要作用,具有信息量大、特征性强、整体性和系统性的特点。能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系,体现了中药成分的复杂性和相关性,与中医药的传统理论相适应,能对中药内在质量进行有效表征和综合评价。国内有文献分别对党参、桂枝、白芍、甘草、干姜、石菖蒲、桂枝甘草汤、桂枝茯苓胶囊等药材及制剂进行了高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的研究,但少有报道对复方制剂参枝苓口服液的指纹图谱的分析。CN104849364A公开了一种参枝苓口服液指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与应用,初步实现了参枝苓口服液多化学成分的分析及其质量控制;乜红磊等也试验了参枝苓口服液的HPLC指纹图谱的构建,基本上能够快速从整体上较全面地对不同批次参枝苓口服液的质量进行评价。然而对于成分繁多的参枝苓口服液,上述方法的分离度、峰容量等相对有限。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题,发明人在前述研究的基础上进一步改进优化,针对参枝苓口服液作为一种中药复方制剂,由10味处方药材组成、成分非常复杂多样的特点,通过研究试验,进一步对参枝苓口服液中特征性成分有效分离,使其形成特征峰多且有效表征制剂质量的指纹图谱,最终形成本发明。
发明人研究发现,目前建立的指纹图谱特征性成分分离能力有限,对复杂样品往往不能达到理想的分离效果,无论是采用synergi Hydro-RP色谱柱抑或是Sunfire C18色谱柱,其建立的参枝苓指纹图谱方法反映的复方制剂特征性成分数量相对较少。因此,开发建立一种简便、易行、能够提高选择性及分离能力的指纹图谱构建方法具有重要意义。
本发明的目的之一在于提供一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,相对于目前常用的建立的指纹图谱方法来说,本发明通过试验将不同极性的固定相色谱柱直接串联在一起,可以发挥不同极性色谱柱的分离选择性,改善特征性成分的分离效果、提高峰容量和分离度,使建立参枝苓口服液指纹图谱反映的成分信息更加丰富、全面,为参枝苓口服液质量控制及评价提供更有效的参考方法。
本发明的目的之二在于通过上述构建方法构建的指纹图谱的应用。通过检测获得待测参枝苓口服液指纹图谱与参枝苓口服液对照指纹图谱进行相似性比较,可以用来进行参枝苓口服液的质量控制。
具体的,为实现上述发明目的,本发明涉及以下技术方案:
首先,本发明公开了一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:取参枝苓口服液,加入甲醇,超声提取,冷藏放置0.5-1小时,恢复至室温,过滤,取续滤液,即得供试品溶液;
(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、甘草酸铵对照品,分别加入甲醇制成对照品溶液;
(3)测定:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪经HPLC分离检测,流动相的组成为乙腈-0.1%磷酸水溶液,采用梯度洗脱,色谱柱由C1(TMS)串联C18形成,用指纹图谱软件对高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理,即得参枝苓口服液指纹图谱。
优选的,本发明所述步骤(1)中,供试品溶液的制备方法为:精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,取续滤液即得供试品溶液。
优选的,本发明所述步骤(2)中,对照品溶液的制备方法为:分别精密称取芍药内酯苷标准品、芍药苷标准品、甘草苷标准品、肉桂酸标准品和甘草酸铵标准品10.25mg、5.78mg、10.30mg、8.68mg、11.05mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,作为储备液。
优选的,本发明步骤(3)中,色谱条件为:色谱柱为YMC-Pack TMS串联JADE-PAKODS-AQ色谱柱串联形成。
更为优选的,其中一根为C18柱(JADE-PAK ODS-AQ色谱柱(5μm,150×4.6mm;即填料粒径为5μm,柱长为150mm,柱内径为4.6mm),另一根为C1柱(YMC-Pack TMS(5μm,100×4.6mm;即填料粒径为5μm,柱长为100mm,柱内径为4.6mm);流动相A为0.1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱;流动相流速为0.8ml/min;检测波长为254nm;柱温为30℃。串联顺序是TMS柱在前,C18柱在后。
其中,梯度洗脱过程中,流动相A和流动相B的变化为:0-10min,流动相A 95%-88%,流动相B 5%-12%;10-30min,流动相A 88%-72%,流动相B 12%-28%;30-42min,流动相A72%-65%,流动相B 28%-35%;42-50min,流动相A 65%-55%,流动相B 35%-45%;50-60min,流动相A 55%-40%,流动相B 45%-60%;60-65min,流动相A 40%-30%,流动相B 60%-70%;65-75min,流动相A 30%-5%,流动相B 70%-95%;75-80min,流动相A 5%-5%,流动相B95%-95%;80-90min,流动相A 5%-95%,流动相B 95%-5%。
优选的,本发明步骤(3)中,分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
其次,本发明公开了上述构建方法构建的指纹图谱的应用。
基于该应用,本发明公开了一种参枝苓口服液的质量控制方法,所述方法包括:
(1)取多个批次的参枝苓口服液按照上述构建方法得到参枝苓口服液样品指纹图谱,将该多个批次(一般10个批次以上)参枝苓口服液样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱;
取待检测样品制备供试品溶液,按照上述构建方法的步骤进行操作,获得待检测样品指纹图谱;
(2)将待检测样品指纹图谱与参枝苓口服液对照指纹图谱进行相似性比较,采用向量夹角余弦法进行相似性比较,与参枝苓口服液对照指纹图谱相比,相似度不低于0.900为待检测样品质量合格。
优选的,相似度不低于0.950为待检测样品质量合格;更优选的,相似度不低于0.960为待检测样品质量合格。
本发明取得了以下有益效果:
与现有的单一C18柱建立的参枝苓口服液指纹图谱相比,本发明将不同极性固定相的色谱柱(C1和C18色谱柱)直接串联,在总柱长并未明显变化的条件下,建立了参枝苓口服液指纹图谱的改进方法,并测定相应指纹图谱,通过梯度洗脱方式,在不同极性柱上能改善特征性成分的分离选择性,进而提高分离能力,使得到的指纹图谱特征峰相对较多(峰容量较大),更能全面反映参枝苓口服液的物质成分信息,有效表征该制剂质量。而且本发明所述方法简便易行,所有检测的组分均在90min内被分离,精密度高,重现性好,得到的指纹图谱基线平稳、分离度较好、特征峰多、各峰响应强度较均匀,能全面、客观地评价参枝苓口服液质量,可用于参枝苓口服液的质量控制。
附图说明
图1为基于C1和C18色谱柱串联建立的各批次参枝苓口服液HPLC指纹图谱
图2为基于C1和C18色谱柱串联建立的对照品混合液指纹图谱和专利(CN104849364B)建立的对照品混合液图谱(为了便于比较,双柱串联的检测波长为254nm,单柱检测波长为254nm和230nm)
图3为在相同色谱条件下,单一Hydro-RP色谱柱及双柱建立的三个批次参枝苓口服液指纹图谱
图4为在相同色谱条件下,单一Hydro-RP色谱柱与双柱测定的相同批次参枝苓口服液对比图
图5为图4的前15分钟局部放大图
图6为专利(CN104849364B)参枝苓指纹图谱构建方法条件下建立的三个批次指纹图谱
图7为在相同色谱条件下,选用另一单一C18色谱柱(phenomenex luna C18)与双柱测定的相同批次参枝苓口服液指纹图谱的对比图
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
诚如背景技术所述,目前指纹图谱的建立分离能力有限,对复杂样品往往不能达到理想的分离效果,本发明针对现有固定相色谱柱建立指纹图谱过程中分离能力不足的问题,提供一种基于色谱柱串联的参枝苓口服液指纹图谱构建改进方法,并建立了相应的指纹图谱。本发明通过对不同极性色谱柱直接串联组合的研究,提供了一种分离能力更好、峰容量更多、操作较为简便的参枝苓口服液指纹图谱色谱柱串联构建方法,为提升和完善参枝苓口服液的质量控制技术提供参考。
本发明的一个具体实施方式中公开了一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:取参枝苓口服液,加入甲醇,超声提取,冷藏放置0.5-1小时,恢复至室温,过滤,取续滤液,即得供试品溶液;
(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、甘草酸铵对照品,分别加入甲醇制成对照品溶液;
(3)测定:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪经HPLC分离检测,流动相的组成为乙腈-0.1%磷酸水溶液,采用梯度洗脱,色谱柱由C1(TMS)串联C18形成,用指纹图谱软件对高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理,即得参枝苓口服液指纹图谱。
优选的实施例中,本发明所述步骤(1)中,供试品溶液的制备方法为:精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,取续滤液即得供试品溶液。
优选的实施例中,本发明所述步骤(2)中,对照品溶液的制备方法为:分别精密称取芍药内酯苷标准品、芍药苷标准品、甘草苷标准品、肉桂酸标准品和甘草酸铵标准品10.25mg、5.78mg、10.30mg、8.68mg、11.05mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,作为储备液。
优选的实施例中,本发明步骤(3)中,色谱条件为:色谱柱为YMC-Pack TMS串联JADE-PAK ODS-AQ色谱柱串联形成。
更为优选的,其中一根为C18柱(JADE-PAK ODS-AQ色谱柱(5μm,150×4.6mm;即填料粒径为5μm,柱长为150mm,柱内径为4.6mm),另一根为C1柱(YMC-Pack TMS(5μm,100×4.6mm;即填料粒径为5μm,柱长为100mm,柱内径为4.6mm);流动相A为0.1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱;流动相流速为0.8ml/min;检测波长为254nm;柱温为30℃。串联顺序是TMS柱在前,C18柱在后。
其中,梯度洗脱过程中,流动相A和流动相B的变化为:0-10min,流动相A95%-88%,流动相B 5%-12%;10-30min,流动相A88%-72%,流动相B 12%-28%;30-42min,流动相A72%-65%,流动相B 28%-35%;42-50min,流动相A65%-55%,流动相B 35%-45%;50-60min,流动相A55%-40%,流动相B45%-60%;60-65min,流动相A 40%-30%,流动相B60%-70%;65-75min,流动相A30%-5%,流动相B 70%-95%;75-80min,流动相A5%-5%,流动相B95%-95%;80-90min,流动相A5%-95%,流动相B 95%-5%。
优选的实施例中,本发明步骤(3)中,分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
在本发明指纹图谱的建立过程中,为了得到尽可能多的指纹图谱特征峰、较好的分离度、峰形等,通过科学实验对不同长度性质的色谱柱串联组合、检测波长、色谱条件、流速、进样量等进行了优选。
本发明考察了多种色谱柱串联组合的选择:试验了JADE-PAK C8(3.5μm,50×4.6mm)串联JADE-PAK ODS-AQ(5μm,150×4.6mm),JADE-PAK C8(3.5μm,50×4.6mm)串联Phenomenex Luna C18(5μm,250×4.6mm),HILIC柱(5μm,l50×4.6mm)串联PhenomenexLuna C18(5μm,250×4.6mm),YMC-Pack TMS(5μm,100×4.6mm)串联JADE-PAK ODS-AQ(5μm,150×4.6mm)。结果表明:串联顺序是TMS柱在前,C18柱在后。TMS串联C18时分离度、分离能力得到明显提高,可将口服液成分进一步分离,得到较多的色谱峰。
高效液相色谱中影响物质分离度的因素有多种,包括柱效、选择性、容量因子等,本发明着重考察了选择性的因素来提高参枝苓口服液中成分的有效分离,本发明通过C1(TMS)串联C18,尤其是总柱长并未明显变化的条件下,柱效没有明显提高,而在不同极性的色谱柱上,通过分离选择性的改进提高了分离度,并且峰容量增大,使得到的指纹图谱更能全面反映参枝苓口服液的物质成分信息,有效表征该制剂质量。
本发明考察了色谱条件的选择:试验了流动相乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水对色谱分离效果的影响。试验结果表明:流动相乙腈-磷酸水色谱分离效果较好,基线平稳,分离度、峰形较好,柱效最佳,因此流动相确定为:A相(0.1%磷酸水)-B相(乙腈)。并对梯度洗脱条件进行优化,各色谱峰保留时间适中,确定了合适的检测时间为90分钟。
本发明考察了不同流速(0.6ml/min,0.7ml/min,0.8ml/min和0.9ml/min)、柱温(如25℃,30℃,35℃和40℃)、检测波长包括210nm,230nm,237nm,245nm,254nm,267nm,280nm和290nm)、进样量(5μL、10μL、15μL)对指纹图谱检测的影响,结果表明在流动相流速为0.8ml/min、检测波长为254nm、柱温为30℃、进样量10μL条件下分离效果最佳,各色谱峰保留时间适宜,响应强度比例适中,色谱峰较多,信息量大,分离度好。
所测定的参枝苓口服液指纹图谱得到的共有特征峰为26个,以肉桂酸峰为参照,其相对保留时间分别为0.2138、0.2613、0.2848、0.3238、0.3443、0.3542、0.4425、0.4977、0.5211、0.5325、0.5690、0.6669、0.6773、0.6907、0.7474、0.8569、0.8758、0.9635、1.0000、1.1527、1.2422、1.2835、1.2986、1.3186、1.3404、1.4510。
本发明的具体实施方式中还公开了上述构建方法构建的指纹图谱的应用。
基于该应用,本发明公开了一种参枝苓口服液的质量控制方法,所述方法包括:
(1)取多个批次的参枝苓口服液按照上述构建方法得到参枝苓口服液样品指纹图谱,将该多个批次(一般10个批次以上)参枝苓口服液样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱;
取待检测样品制备供试品溶液,按照上述构建方法的步骤进行操作,获得待检测样品指纹图谱;
(2)将待检测样品指纹图谱与参枝苓口服液对照指纹图谱进行相似性比较,采用向量夹角余弦法进行相似性比较,与参枝苓口服液对照指纹图谱相比,相似度不低于0.900,优选的,相似度不低于0.950,更优选的,相似度不低于0.960为待检测样品质量合格。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明,但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1:基于双柱串联的参枝苓口服液指纹图谱的构建及其应用
色谱条件为:色谱柱为YMC-Pack TMS(5μm,100×4.6mm)串联JADE-PAK ODS-AQ色谱柱(5μm,150×4.6mm);流动相:流动相A为0.1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈,洗脱方式:梯度洗脱;流速0.8ml/min,柱温30℃,检测波长254nm,进样量10μl,理论塔板数按肉桂酸色谱峰计算不低于8000,所有组分均在90min内被检测完。其中,流动相线性梯度如表1所示:
表1色谱流动相梯度洗脱条件
(1)供试品溶液的制备:精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,即得稀释20倍的供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备:分别精密称取芍药内酯苷标准品、芍药苷标准品、甘草苷标准品、肉桂酸标准品和甘草酸铵标准品10.25mg、5.78mg、10.30mg、8.68mg、11.05mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,作为储备液;
(3)图谱测定:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,测定12个批次的参枝苓口服液和对照品图谱(图1)。
(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行分析处理,即得各批次参枝苓口服液指纹图谱(如图1)。图谱共有26个共有特征峰,以肉桂酸峰为参照(19号峰),其相对保留时间分别为:0.2138、0.2613、0.2848、0.3238、0.3443、0.3542、0.4425、0.4977、0.5211、0.5325、0.5690、0.6669、0.6773、0.6907、0.7474、0.8569、0.8758、0.9635、1.0000、1.1527、1.2422、1.2835、1.2986、1.3186、1.3404、1.4510。混合对照品的指纹图谱如图2所示,1-5号色谱峰分别为芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、肉桂酸和甘草酸铵。
将所测的12批参枝苓口服液(批号:5250403、5250404、5250705、5260301、5260503、5260504、5261005、5261006、5270102、5221201、14311、14312)图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件分析,进行色谱峰匹配。以S1作为参照图谱,生成的对照指纹图谱为R(采用平均法,见图1)。各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱以及各样品之间指纹图谱的相似度结果见表2。
表2 12个批次参枝苓口服液指纹图谱的相似度值
由表2可以看出,S1到S9相似度较高,在0.979以上,而S10、S11、S12三个批次相似度相对较低。其中S1到S9为2015、2016年生产的产品,处于保质期内成分稳定。S10、S11、S12三个批次为过期产品,可能是产品成分组成和/或含量比例发生了变化,因而相似度较低。
实施案例2:方法学考察
方法学考察主要考察了精密度、稳定性和重复性,考察方法和结果如下:
(1)精密度实验取同一批次参枝苓口服液样品,经预处理后,在最优色谱条件下,采用双柱直接串联法,连续测定6次,记录色谱图,结果见表3。由表可见,各主要色谱峰其相对保留时间比值无明显变化,RSD为0.037%~0.31%。除14号色谱峰外,各主要色谱峰相对峰面积RSD为0.7%~4.2%,RSD<5.0%,说明仪器的精密度良好。由于14号共有峰峰面积较小(<总面积1%),其RSD值较大。
(2)稳定性实验取同一批次参枝苓口服液样品,经预处理后,在最优色谱条件下,采用双柱直接串联法,分别于0h,2h,4h,8h,12h和24h进样分析,记录色谱图,结果见表3。由表3可见,除14号色谱峰外(峰面积<总面积1%,RSD值较大),各主要色谱峰相对峰面积和其相对保留时间比值无明显变化,RSD分别为0.3%~4.8%和0.043%~0.37%,说明供试品溶液的成分在24h内稳定。
(3)重复性实验取5份同一批次的参枝苓口服液样品,经预处理后,在最优的色谱条件下,采用双柱直接串联法,分别进样分析,记录色谱图,结果见表3。各共有色谱峰相对峰面积和其相对保留时间比值无明显变化,RSD分别为0.7%~4.8%和0.012%~0.13%,RSD<5.0%,说明该实验方法的重复性较好。
表3参枝苓口服液指纹图谱方法学验证结果
注:肉桂酸作为参考峰,其值为定值,因此略去。
实施例3:基于双柱串联的参枝苓口服液指纹图谱与单柱指纹图谱分离效果的对比
1.单一hydro-RP色谱柱与串联双柱在相同色谱条件建立的参枝苓口服液指纹图谱对比
色谱条件为:色谱柱为phenomenex Synergi Hydro-RP(4μ,250×4.6mm);流动相:流动相A为0.1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈,洗脱方式:梯度洗脱;流速0.8ml/min,柱温30℃,检测波长254nm,进样量10μl,流动相梯度同表1。
供试品溶液的制备:精密量取三个批次各1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,即得稀释20倍的供试品溶液。
图谱测定:精密吸取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,测定得到参枝苓口服液图谱,如图3所示d、e、f三个图谱。
为试验双柱串联分离能力,在相同的色谱条件下,与专利(CN104849364B)使用的相同的Hydro-RP色谱柱比较,采用双柱串联测定混合标准溶液和三个批次的参枝苓口服液,得到了三个批次的参枝苓口服液指纹图谱,如图3所示a、b、c三个图谱,其与双柱峰容量对比结果见表4。选取其中一个批次色谱图与双柱同批次色谱图进行比较(见图4,图4a为单柱图谱,图4b为双柱串联图谱),局部放大图如图5所示,图5a为单柱图谱,图5b为双柱串联图谱。并对指标成分间进行了分离度比较和说明,结果见表5。
表4双柱与单柱峰容量结果
表5双柱与单柱对五种指标成分之间的分离度对比
R<sub>芍药内酯苷-芍药苷</sub> | R<sub>芍药苷-甘草苷</sub> | R<sub>甘草苷-肉桂酸</sub> | R<sub>肉桂酸-甘草酸铵</sub> | |
单柱 | 4.73 | 13.23 | 45.00 | 24.60 |
双柱 | 5.18 | 15.25 | 38.04 | 40.72 |
由表4可得单柱与双柱串联建立的指纹图谱峰容量结果,批次1单柱得到色谱峰25个(峰面积≥1%),而双柱串联测定同一样品得到色谱峰28个(峰面积≥1%);批次2单柱得到色谱峰23个(峰面积≥1%),双柱串联测定得到色谱峰29个(峰面积≥1%);批次3单柱得到色谱峰25个(峰面积≥1%),而双柱串联测定得到色谱峰29个(峰面积≥1%)峰容量均增加。
由表5可看出双柱串联测得的五种指标成分间的分离度有三个大于单柱,同时由图4和图5(如保留时间为4min左右的峰簇)可观察到双柱串联可将部分成分进一步分离。综合表4和图4与图5,在相同色谱条件下,双柱串联和单柱相比一些特征成分的分离度得到改善,指纹图谱的峰容量得到提高,能够获得更多的色谱峰,说明双柱串联比单柱具有更强的分离能力。
2.专利(CN104849364B)参枝苓口服液指纹图谱建立法与双柱串联法分离效果对比
在专利(CN104849364B)参枝苓口服液指纹图谱建立法发明条件下测定三个批次样品。
色谱条件为:色谱柱为phenomenex Synergi Hydro-RP(4μ,250×4.6mm);流动相:流动相A为0.3%磷酸水溶液,流动相B为乙腈,洗脱方式:梯度洗脱;流速0.8ml/min,柱温30℃,检测波长230nm,进样量10μl,流动相梯度见表6。
表6专利(CN104849364B)法色谱流动相梯度洗脱条件
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 95 | 5 |
5 | 95 | 5 |
10 | 92 | 8 |
20 | 80 | 20 |
25 | 77.5 | 22.5 |
40 | 67 | 33 |
50 | 60 | 40 |
60 | 50 | 50 |
80 | 15 | 85 |
90 | 5 | 95 |
100 | 95 | 5 |
供试品溶液的制备:精密量取三个批次各1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,即得稀释20倍的供试品溶液。
图谱测定:精密吸取供试品溶液10μL和混合标准溶液10ul,注入高效液相色谱仪,测定参枝苓口服液图谱,如图6所示。
相同的三个批次样品及混合标准溶液在双柱串联色谱条件下进行测定,将其指纹图谱(图3中a,b和c)与专利(CN104849364B)指纹图谱建立法得到图谱进行峰容量比较,结果如表7所示。双柱串联法与专利(CN104849364B)测得的五种指标成分分离度对比结果见表8。
表7双柱串联法与CN104849364B峰容量结果
表8双柱串联法与CN104849364B对五种指标成分之间的分离度对比
本发明测得的三个批次参枝苓口服液指纹图谱峰容量分别为28,29和29(计峰面积≥1%),而专利(CN104849364B)三个批次的峰容量分别为20,17和22(计峰面积≥1%);对混合标准溶液进行测定,结合表8和图2可看出双柱串联法的色谱峰分离度优于专利(CN104849364B),说明本发明具有更好的分离能力,得到的指纹图谱分离度较好、色谱峰更多、各峰响应强度较均匀,可对参枝苓口服液进行更全面、客观地评价。
3.另一单一C18色谱柱与串联双柱在相同色谱条件建立的参枝苓口服液指纹图谱对比
为了比较不同型号的C18色谱柱,我们选用另一C18色谱柱与双柱串联进行比较。色谱条件为:色谱柱为phenomenex luna C18(2)(5μm,250×4.6mm);流动相:流动相A为0.1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈,洗脱方式:梯度洗脱;流速0.8ml/min,柱温30℃,检测波长254nm,进样量10μl,流动相梯度同表1。
供试品溶液的制备:精密量取一个批次1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,即得稀释20倍的供试品溶液。
图谱测定:精密吸取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,测定得到参枝苓口服液图谱。
采用双柱串联方法在相同条件下测定该批次的参枝苓口服液指纹图谱,将双柱串联法得到的色谱图与另一单一C18柱测得的色谱图进行比较,如图7所示,局部放大图(1)可看出双柱串联可以提高分离能力,将单柱的单峰分离为两个峰,进一步分离口服液中的物质成分。由局部放大图(2)、(3)也可以看出双柱串联可以改善分离度,获得更多的色谱峰,更全面的反映参枝苓口服液的成分信息。
Claims (12)
1.一种参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:取参枝苓口服液,加入甲醇,超声提取,冷藏放置0.5-1小时,恢复至室温,过滤,取续滤液,即得供试品溶液;
(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、肉桂酸、甘草酸铵对照品,分别加入甲醇制成对照品溶液;
(3)测定:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪经HPLC分离检测,流动相的组成为乙腈-0.1%磷酸水溶液,采用梯度洗脱,色谱柱由C1(TMS)串联C18形成,用指纹图谱软件对高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理,即得参枝苓口服液指纹图谱;
所述流动相A为0.1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈;所述梯度洗脱过程中,流动相A和流动相B的变化为:0-10min,流动相A 95%-88%,流动相B 5%-12%;10-30min,流动相A88%-72%,流动相B 12%-28%;30-42min,流动相A 72%-65%,流动相B 28%-35%;42-50min,流动相A 65%-55%,流动相B 35%-45%;50-60min,流动相A 55%-40%,流动相B45%-60%;60-65min,流动相A 40%-30%,流动相B60%-70%;65-75min,流动相A 30%-5%,流动相B 70%-95%;75-80min,流动相A 5%-5%,流动相B 95%-95%;80-90min,流动相A 5%-95%,流动相B 95%-5%。
2.根据权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,供试品溶液的制备方法为:精密量取1.25ml参枝苓口服液于25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声提取5min,于4℃冰箱中放置0.5小时,恢复至室温,经0.22μm有机系滤膜过滤,取续滤液即得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,对照品溶液的制备方法为:分别精密称取芍药内酯苷标准品、芍药苷标准品、甘草苷标准品、肉桂酸标准品和甘草酸铵标准品10.25mg、5.78mg、10.30mg、8.68mg、11.05mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,作为储备液。
4.根据权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,步骤(3)中,色谱条件为:色谱柱为YMC-Pack TMS串联JADE-PAK ODS-AQ色谱柱串联形成。
5.根据权利要求4所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,JADE-PAKODS-AQ色谱柱填料粒径为5μm、柱长为150mm、柱内径为4.6mm,YMC-Pack TMS填料粒径为5μm、柱长为100mm、柱内径为4.6mm。
6.如权利要求5所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于;流动相流速为0.8ml/min;检测波长为254nm;柱温为30℃。
7.根据权利要求1所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,步骤(3)中,分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,所述指纹图谱中的共有峰为26个。
9.根据权利要求8所述的参枝苓口服液指纹图谱的构建方法,其特征在于,所述26个共有特征峰,以肉桂酸为参照,其相对保留时间分别为:0.2138、0.2613、0.2848、0.3238、0.3443、0.3542、0.4425、0.4977、0.5211、0.5325、0.5690、0.6669、0.6773、0.6907、0.7474、0.8569、0.8758、0.9635、1.0000、1.1527、1.2422、1.2835、1.2986、1.3186、1.3404、1.4510。
10.一种参枝苓口服液的质量控制方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)取多个批次的参枝苓口服液按照权利要求1-9任一项所述的构建方法得到参枝苓口服液样品指纹图谱,将10个批次以上的参枝苓口服液样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱;取待检测样品制备供试品溶液,按照权利要求1-9任一项构建方法的步骤进行操作,获得待检测样品指纹图谱;
(2)将待检测样品指纹图谱与参枝苓口服液对照指纹图谱进行相似性比较,采用向量夹角余弦法进行相似性比较,与参枝苓口服液对照指纹图谱相比,相似度不低于0.900为待检测样品质量合格。
11.根据权利要求10所述的参枝苓口服液的质量控制方法,其特征在于,相似度不低于0.950为待检测样品质量合格.
12.根据权利要求11所述的参枝苓口服液的质量控制方法,其特征在于,相似度不低于0.960为待检测样品质量合格。
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