JPH02311496A - ドラスタチン１５とその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、インド洋産の、外皮のよい軟体動物Ｄｏｌａ
ｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａから得られたドラ
スタチン１５　（Ｄｏｒａｓｔａｉｎ　１５）と命名さ
れた細胞活動停止性の鎖状デプシベブチドに関し、また
、ドラスタチン１５を必須の有効成分として含有する医
薬製剤に関し、さらに、細胞生長に苦しむ患者の該生長
を阻害するために該製剤を使用する方法に関するもので
ある。

（従来の技術） ローマの偉人な自然科学者ガイウス・プリニウス■世（
プリニー・ザ・エルダー）は西暦約６０年頃の研究にお
いて、インド洋産のドラヘラ属のアメフラシについて始
めて記述している。（ローマ人達は・ウサギの耳と、こ
の複足網動物の耳形の触角の類似性の故に、このアブリ
ント科の軟体動物を始めてアメフラシ（ｓｅａ　ｈａｒ
ｅ、すなわち「海うさぎ」〕と命名した）。

しかし、このインド洋産のトラベラ属動物を近代医学的
に考慮したのはごく最近のことである。

〔ドラスタチン１〜３についてのアメリカ特許４．４１
４，２０５（１９８３年１１月８日）、ドラスタチンＡ
及びＢについてのアメリカ特許４，４８６，４１４（１
９８４年１２月４日）及びドラスタチン１０についての
アメリカ特許４．８１６．４４４　（１９８９年３月２
８日）を参照されたし。〕 これらドラスタチンは、活性のあるり、ａｕｒｉｃｕ−
１ａｒｉａ成分と対応するものと考えられる。（１９６
９年の門、會ａｔｓｏｎ　（ハワイ）の学位論文「ハワ
イ産アメフラシ、特にり、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ及び
Ａｐｌｙｓｉａ　ｐｕｌ−ｍｏｎｉｃａの中腸腺毒素の
薬理学、化学及び生物学」（ミシガン州、アン・アーバ
ー市ユニバシティー・マイクロフィルムＩｎｃ、）を参
照されたし。〕Ｄ、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａのもつ生物
学的性質は何世紀にもにわたって追求されたが、このウ
ミアラシのインド洋産のものの抽出物が、アメリカ国立
がん研究所（ＮＣＩ）のネズミのＰ２Ｓ５　リンパ球白
血病（ＰＳ系）に対して有効（生存期間を１００％以上
延長させる）と当研究所において判明したのはようや＜
　１９７２年のことである。それ以来、当研究所はドラ
スタチンｌから１０と命名（ただし、該命名はその起源
によるものであって、化学構造上の類似性によるもので
はない）されたところの１０種の新規で強力な細胞生長
阻害物質及び／又は抗新生物性のペプチドを単離するの
に成功した。

当初はドラスタチン１が最も活性（最小用は）な抗新生
物剤（ｌ１ｇ／ｋｇでＮＣＩネズミ［１１６メラノーマ
に対し３３％の治癒率）であった。ドラスタチンの活性
の故に、これらペプチドの単離と構造決定には極めて少
量（１００ｋｇから１ｍｇ）のウミアラシが必要であっ
た。次いで、別の物質が単離され、ユニークな鎖式ペン
タペプチドであることが判り、ドラスタチン１０と命名
された。このものは、当時では、最も重要なり、ａｕｒ
ｔｃｕｌａｒｉａの抗新生物成分で、最も活性（最小用
量）な抗新生物剤であった。例えば、ドラスタチン１０
は、ＮＣＩのヒトのメラノーマ・キセノグラフ（ヌード
・マウス）に対し３．２５−２６μｇ／ｋｇで１７−６
７％の治癒反応を示し、Ｂ１６メラノーマでは、１．４
４−１１．１μｓ／ｋｇで４２−１３８％の延命率を示
しｐｓ白血病（ＥＤｓｏ＝　４．６　ｘ　１０−’ｐｇ
　／ｍｌ　）には１〜４μｓ／ｋｇで６９−１０２％の
延命率を示した。

これに対してドラスタチン１５はＥＤ、。０．００２４
μｇ／ｍ１）でＮＣＩの２３８８９７３球白血病（ＰＳ
系）　（シュミットほか：　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔａ、１
９７８．３４．６５９−６６０参照）細胞系に対し強度
に活性である。

このＰＳ系は、種々のタイプのヒト新生物病に対する活
性の、優れた予知物である。ウエンデッティほか：　Ｌ
ｌｏｙｄｉａ　、　３０．３２１以下（１９６７）及び
そこに引用されている文献を参照されたし。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、インド洋産の無外皮の軟体動物であるＤｏｌ
ａｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａから抽出され「
ドラスタチン１５」と命名された新規かつ有用な細胞制
御物質の発見に関するものである。本物質、その合成物
及び無毒の薬学的に許容される誘導体は、アメリカのＮ
ＣＩで使用され一般的に承認されているプロトコールで
測定したときに、認め得られかつ確認できる水準の細胞
生長阻害活性をもつところの有用な医薬製剤に処方する
ことができる。

従って、本発明の第一の目的は、悪性細胞の生長遅延や
寛解に有用な新規物質を提供することにある。

他の目的は、ヒトに発生するいろいろな新生物病の治療
や管理に容易かつを利に使用し得るように、水産動物か
ら細胞生長阻害物質をｉ離する方法を提供することにあ
る。

更に別の目的は、インド洋産の無外皮の軟体動物たるＤ
ｏｌａｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕｌａｒｔａから得た特
異的な細胞制御因子、その合成物及び無毒性の薬学的に
活性な誘導体を必須有効成分として含有するところの、
新生物病の治療や管理に有用な薬剤を作る手段や方法を
提供することにある。

以上の、及びこれ以外の本発明の目的は以下の実施例な
どから容易に理解されるであろう。

（課題を解決するための手段） （原料動物とその分類学） Ｄｏｌａｂｅｌｌａ　ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａはＭｏ１
ｌｕｓａ門のＧａｓ　ｔ−ｒｏｐｏｄａＸのＡｐｌｙｓ
ｉｄａｅ科に属する。Ｈ，エンゲルのｒＺｏｏｌｏｇｉ
ｓｃｈｅ　Ｍｅｄｅｄｅｅｌｉｎｇｅｎ　Ｊ　　（ライ
デン）２４．１９７−２３９（１９４５）には、Ｄｏｌ
ａｂｅｌｌａの標本の多くのカラー図がある。更に、こ
の文献には、後に到ってり、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａと
同定されるようになった種々のＤｏｌａｂｅｌｌａ属の
リストがある。それらの種名はり、ａｇａｓｓｉｚｉ　
％　Ｄ、ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ、口、ｈａｓｓｅｌｔｉ
ｉ　。

Ｄ、ｈｅｍｐｒｉｃｈｉｉ、　Ｄ、ｎｅｉｒａ　、、　
Ｄ、ｐｅｒｏｎｉｉ　ｓ　、Ｄ、ｒｕｍ−ｐｈｉｉ、、
Ｄ、ｔｅｒｅｍｉｄｉ、、Ｄ、ｔｏｎｇａｎａ　　、、
Ｄ、ｔｒｕｎｃａｔａｓ　　ロ。

ｖａｒｉｅｇａｔａ及びり、５ｃａｐｕｌａである々本
発明で使用されるＤｏｌａｂｅｌｌａ属の外観は、オリ
ーブグリーン色で、平均長さが１５−２０ｃｍの梨のよ
うな形をしている。前出Ｅｎｇｅｌの文献には、世界中
から採集されたＤｏｌａｂｅｌｌａ属についての詳しい
記述がある。

当初　トラスチン類の単離のために用いられたＤｏｌａ
ｂｅｌｌａ属は、インド洋のモーリシャス島の東部（南
緯２１度、東経５６度あたり）の海岸の水深４〜５フイ
ートから採取された。この他、フィリピンのネグロス島
近辺（北緯９度、東経１２３度あたり）からのものも用
いられた。５ケ所の異なる採集地からのＤｏｌａｂｅｌ
ｌａ属の標本はすべて抗新生物活性を有していた。

（ドラスタチン１５の単離と精製） アメフラシ標品から種々のドラスタチン類を単離し精製
するには、例えば溶媒抽出、分配クロマト、シリカゲル
クロマト、クレープ又はイト−の装置を用いての液々分
布、樹脂への吸着及び溶媒からの再結晶のようないろい
ろな方法を用いることができる。

（ドラスタチン１５０単離） Ｄ、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ　　（湿潤型ｉｔ　１，０
００ｋｇ　；　１９８２年採集）のエタノール−２−プ
ロパツール合併抽出液を一連の溶媒分布ステップにより
活性メチレンクロイド分画に濃縮する。ＰＳバイオアフ
セーによる勾配溶出法を用いてのカラムクロマト分離（
セファデックス上での立体排除及び分配、シリカゲルで
の分配及び吸着、そしてＨＰＬＣ）を行って、シリカゲ
ル上でメチレンクロリド・メタノール溶媒系中で、前述
のドラスタチン１ｏよりも僅かに敏速に移動する純ドラ
スタチン１５を６．２ｍｇ（＞Ｗったウミアラシ１６０
０ｋｇから４ｘｌＱ−”％の収率）を得る。ＲＰ８シリ
カゲル上でのＨＰＬＣ（１：　１メタノール水と１００
％メタノールでの勾配溶出）及びメタノールからの沈澱
という最終的精製により、ドラスタチン１５の純粋標本
を無定形粉末として得た。ｍｐ　１４３−１４８℃、　
　（α）ｏ２ｂ−２６’（Ｃ＝０．０１、Ｃ）１．ＯＨ
）、　Ｒｆ　Ｏ，６０（９０：１０：０．８メチＬ／７
クロリド・メタノール・水）、高分解能ＳＰ−５ＩＭＳ
’　（Ｍ＋Ｈ）　”　８３７．５１３５、Ｃ４５Ｈｈｅ
ＮｈＯｑとしての計算イ直は８７３．５１３６；　ＵＶ
（ＣＨｚＯＨ）　−−−（ｌｏｇ）　、２２０（３，１
１）、２．４２（２，９０）　、、　：　ＩＲ（ＮａＣ
Ｉ板）：λ、、、　２９６０．２９３０．２８６０．１
７３０．１６９０．１６６５．１６３ｏ、１４４ｏ、１
３０５．１２４５　　及び１１８０ｃｍ−’。バリン（
Ｖａｊｌ’）　、Ｎ−メチルバリン（ＭａＶａ　１　）
、及びドラバリン（口ＯＶ）の存在を、’Ｈ，’Ｈ−Ｃ
ＯＳＹ　、’Ｈ，＋３Ｃ−ＣＯ５Ｙ及び’Ｈ％’ＩＩ−
リレーＣ０３Ｙを用いる高領域（４００ＭＨｚ）　ＮＭ
Ｒで確認（パックスほか：　Ｊ、Ｍａｇｎ、Ｒｅｓ、　
１９８５．６１．３０６参照）。上記の２ＯＮＭＲを用
い、次いで等核ハル）７フーハー７２ｆ）実験（ＨＯ）
ＩＯＭＡ　、３３ｍ５　ＭＬＥＶ−１７（７）混合で記
録）（パックスほか：　Ｊ、Ｍａｇｎ、Ｒｅｓ、　１９
８５．６５．３５５参照）を行い２個のプロリン（Ｐｒ
ｏ）単位と１個の２−ヒドロキシイソ吉草酸（ｌｌｉｖ
ａ）単位を確認。ドラスタチン１５の分子式から誘導さ
れる６個の単位の元素組成を控除すると、第７番目の単
位はＣ＋ｔａＩＪＯｔとなる。ＮＭＲによれば、該セグ
メントは１個のフェニル環、１個の遊離オレフィン性メ
チン、１個のメトキシ基及び１個の′Ｍ離−Ｃ１１２Ｃ
旧が認め得るスピン系として含まれていることがわかる
。更に構造を知るにはＮＯＥとへテロ核多重結合相関（
ＨＭＢＣ）　Ｎ？ｌＲ（パックスほか：　Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、１９８６．１０８．２０９４参照
）を必要とする。

一連の’＋１　（’Ｈ）−ＮＯＥ差の実験によれば、フ
ェニル環は、メチレン基と結合してフェニルアラニン系
の一部を形成し、そしてメトキシ基は、オレフィン性メ
チンのプロトンの近傍にあることがわかる。

）ＩＭＢＣの試験結果（第２表参照）により、サブ単位
の最終的な組み立てが可能で、これまで未知であったフ
ェニルアラニン生合成生産物（ドラピロリドン、Ｄｐｙ
）と判明した。ｏｐｙは、多分、分子内結合によりＮ−
アセチルフェニルアラニン・メチルエステルから生合成
的に生じたものであろう。

関連したピロリドンＣ−末端単位は、既にストレプトミ
セス抗生物質のアルチオマイシン、スポンジ状の青緑色
の藻類成分のディシン及びマリンガミド並びにバケレイ
ミドタイプの青緑色の藻類成分中に見出されている。

ドラスタチン１５の′Ｈ−及び’　３Ｃ−ＮＭＲ化学シ
フトのアサインメントは第１表に示されている。ドラス
タチン１５の配列決定は’１１−　（’Ｈ）　ＮＯＥ及
びＨＭＢＣ実験からの長レンジプロトンカルボニルカッ
ブリング情報を用いて得られる（第２表参照）。

このアサインされた情報は、さらに、ＨＲＥＩ質量分析
の結果と合わせてのｓＰ−イオンの衝突活性分解（ＭＳ
／ＭＳ）により支持された。

ｅｔ　４３　ＮのＬｙｎＢｂｙａ属及びドラスタチン１
５中のどロリドン・メチルビニルエーテル基の出現は、
Ｄ、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａはそのような青緑細菌の成
分を得るか又は構造′的に変換したものであるという環
境的証拠をさらに与えるものである。

若し、この有効な細胞生長阻害及び／又は抗新生物剤の
外因性調達が真実であれば、特元構造をもつ細胞生長阻
害及び抗新生物剤を貯蔵し、及び／又は生産するという
り、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａの能力は驚（べきものであ
る。実際のところ、若し、これらの生合成生産物が外因
性に得られたことが判明すれば、このウミアラシの感覚
及び選択機作は偉人なものに相違ない。

ドラスタチン１５は次の構造式で示され、また既にのべ
た第１表と第２表も以下に示す。

ｈａ 遍」」曳 ドラスタチン１５．４００　ＭＨｚ　’Ｈ及びｌ　’Ｃ
−ＮＭＲ（重水素メチレンクロリドｉ　　ＴＭＳはｐｐ
ｍ　）ドラピロリドン単位：　’Ｈ；　４．７１（ｓ、
１ｌ−２）　、３．７４（ｓ、　３８．Ｈ−３ｂ）、４
．７７（ｄｄ、４．８．２．９．８−４）、３．５２（
ｄｄ。

１４．０，４．５．　Ｈ−４ａ）　、３−０４（ｄｄ、
１３−８＋３．５．Ｈ−４ａ’）、７．１４（ｍ、Ｈ−
４Ｃ）、？、２０（ｍ、Ｈ−４ｄ）、７．１８（ｍ、Ｈ
−４ｅ）、及び”Ｃ；１６９．２６（Ｃ−１）　、９４
．７３（Ｃ−２）、１７８．１６　（Ｃ−３）、５９．
８６　（Ｃ−４）、５８．２９（Ｃ−３ｂ）　、３４．
８７（ｃ−４ａ）、１３４、１６　（Ｃ−４ｂ）、１２
９．９７　（Ｃ−４ｃ）、１２８．１１　（Ｃ−４ｄ）
、１２６．９７（Ｃ−４ｅ）。

ヒドロキンイソ吉草酸単位：　’Ｈ、５，８９（ｄ、２
．７゜■−７）、２．１９（ｄｓｅｐｔ、２．７．６．
６　Ｈ−７ａ）、０．９１　（ｄ、６．６゜３Ｈ，Ｈ−
’Ｉｂ）、１．０７（ｄ、６．６．３Ｈ，Ｈ−７ｃ）　
、及び１３Ｃ；１６９．４７（Ｃ−６）　、７７．８３
（Ｃ−７）、２８．８６　（Ｃ−７ａ）、１５．７８（
Ｃ−７ｂ）　、１９．８２（Ｃ−７ｃ）。

プロリン−１単位：　ＩＩＩ　；　４．８３（ｄｄ、８
．９，２．７．ｌｌ−１０）　、２．３８（ｍ、Ｈ−１
１）、２．２２（ｍ、Ｈ−１１°）　、２．２５（ｍ、
Ｈ−１２）、２．０３（＋ｗ、　Ｈ４２’）、３．７５
（ｄｄ、１４．８，８．９．Ｈ−１３）、３．６０（ｄ
ｄ、１４．７．６．９．　Ｈ−１３’）、及びｌ’ｃ　
；　１７１．４４（Ｃ−９）、５８．２５（Ｃ−１０）
　、２８．５３（Ｃ−１１）　、２４．６１（Ｃ−１２
）、４６．３７　（Ｃ−１３）　。

プロリン−２単位−１１１，４，６３（ｄｄ、８．１，
４．８．１ｌ−１６）　、２．１３（ｍ、旧１７）、２
．１１（＋ｎ、Ｈ−１７’）　、２．１５（ｍ、Ｈ−１
８）、１．８５（＋＋、　　）ｌ−１８°）、３．９０
（ｄｄ、１６．７，７．１．）Ｉ−１９）、３．７８（
ｄｄ、１６．５，７．０．　Ｈ−１９′）、及び１３Ｃ
；　１７０．７９（Ｃ−１５）、５８．０４（Ｃ−１６
）　　、２８．３６（Ｃ−１７）　　、２４．６８（Ｃ
−１８）　　、４７．８０（Ｃ−１９）。

Ｎ−メチルバリン単位、＋Ｈ１５，１３（ｄ、１１．１
．旧２２）、２．２７（ｄｓｅｐｔ、　１１．２．６．
６．Ｈ−２２ａ）、０．７７（ｄ、６．６，３Ｈ，Ｈ−
２２ｂ）、１．０３（ｄ、６．６，３１１．Ｈ−２２ｃ
）、３．１７（ｓ、３１（、）Ｉ−２３ａ）及びｌ”Ｃ
、１６９，１２（Ｃ〜２１）、５９．１８（Ｃ−２２）
　、２７．２９（Ｃ−２２ａ）　　、１８．’５２（Ｃ
−２２ｂ）、１９．１０（Ｃ−２２ｃ）、３０．６８（
Ｃ−２３ａ）。

バリン単位：　’ＩＩ　；　４．７９（ｄｄ、９．３．
６．８．Ｈ−２５）、１．９８（ｏｃｔ、６．７．Ｈ−
２５ａ）　、０．９３（ｄ、６．６，６８．ｌｌ−２５
ｂ及びＨ−２５Ｃ）、６．８７（ｄ、９．２．Ｈ−２６
）、及びＩ３Ｃ；　１７２．９７（Ｃ−２４）、５３．
６ＨＣ−２５）　　、３１．１０（Ｃ−２５ａ）、１８
．０４（ｃ−２５ｂ）、１９．５９（Ｃ−２５ｃ）。

Ｎ、Ｎ−、ジメチルバリン単位：　’Ｈ；　　２．４４
（ｄ、６．４．Ｈ−２８）　、２．０７（ｏｃｔ、６．
４．８−２８ａ）　、０．９２（ｄ、６．６，３１１．
Ｈ−２８ｂ）、０．９９（ｄ、６．６，３１１．Ｈ−２
８ｃｃ）　、２．２４（ｓ、６８．ｆ（−２９ａ及びＨ
−２９ｂ）、１コＣ；　１７１．８０（ｃ−２７）、７
６．５４　（Ｃ−２８）、２７．６６（Ｃ−２８ａ）、
１７．６４（ＧＫ−２８ｂ）　　、２０．１７（ｃ−２
８ｃ）、４２．９５（Ｃ−２９ａ及びＣ−２９ｂ）　。

芽」１表 ドラスタチン１５ＮＯＥとＨＦＩＢＣの相関ｌＨ−位置
　　　−Ｎ　ＯＥ　　　　　　　ＩＩ　？Ｉ　Ｂ　Ｃ２
３ｂ　　　　　　　　１．４ ｂ２３ ４２．３ ４ａ　　　　　４　ｃ　　　　　　　　３７６．９ １３　　　　　１０、１２．１６ １６　　　　　１３．１８，１９　　　　１５１８　　
　　　１６、１９ ２２　　　　　１９　　　　　　　２１．２４２２ｂ　
　　　　２６ ２３ａ　　　　　２２ａ、　２２ｂ、　２５　　　２２
．２４２６　　　　　２８、２９ａｂ　　　　　　２７
２８２５．２６２７ ２９ａｂ　　　　　　　　　　　　　２８本発明の理解
を更に助けるため、実験方法を更に詳細に次に示す。

（一般的方法） クロマトに使用する溶媒は再蒸留する。ゲル透過クロマ
ト及び分配クロマトに用いるセファデックスＬＨ−２０
（２５−１００μ）はスウェーデン、ウプサラ市のファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢから入手。ギルシ
ンＨｈ　ｕｖ−可視ホロクローム検出器に接続するギル
シンＰＣ−２００レース・トラ・ツク及びＰＣ−８０マ
イクロフラツシヨネーターをクロマト分配実験用に使用
した。シリカゲルを用いてのカラムクロマト処理では、
Ｅ、メルク（ダルムシュタット）から提供されている７
０−２３０メツシエ又はシリカゲル６０のプレパックカ
ラムを用いた。パルティシルＭ９１０１５０００５−２
　　（Ｃ−１８逆相）カラム（内径９．４ｍｍ　ｘ　５
００ｍｍ）　（−’−ニーシャーシー州、クリフトンの
ワットマンＩｎｃ、から入手できる）を）ＩＰＬＣに使
用した。

分離用の層プレートもまたワットマンから入手でき、ま
たＴＬＣ用のシリカゲルＧＦユニプレートはプラウエア
州ニューアークのアナルテンクＩｎｃ、から人手できる
。ＴＬＣプレートは紫外線照射し、アニスアルデヒド・
酢酸・硫酸スプレー（約１０５℃に１０分間加熱）また
は硫酸セリウム・硫酸（１０分間加熱）で展開する。

アミノ酸分析はベックマンのモデル１２１ユニツトで行
う。紫外スペクトルは、ＨＰ７２２５プロッターを備え
たヒユーレット・パラカード８４５０Ａ　ＵＶ／ＶＩＳ
分光光度計を用いて記録する。赤外スベクタルはニコμ
ＭＸ−Ｉ　ＦＴ機器に記録する。

高分解能ＳＰ−ＳＩＭＳ質量スペクトルはり、Ｇ、アナ
ライザーＭＭ　ＺＡＢ−２Ｐ及びクラトスＭＳ−５０）
リプルアナライザー質量分光器を用いて得る。高分解能
電子衝皇質量スペクトル（ｍ＃ａ　１０，０００）は、
ＣＡＤスペクトルと共にクラトスＭＳ−８０及びＭＳ−
５０機器に記録する。適当な誘導体のガスクロマド質量
分光測定（ＧＣ−ＭＳ）はＪ＆Ｗ溶融シリカＤＢ５　（
０，２４３ｍｍ　ｘ　３０＋ｎ）のカラムを用いて行う
。引き続いてのＧＣ−ＭＳは化学的イオン化（ｍ／ｍ　
１０００．Ｎｔｌ＋試薬）、低分解能（ｍ／ｍ　１００
０）及び高分解能（ｍ／ｍ　３０００）の電子衝撃法を
用いる。

ＮＭＲ実験（ブランカ−５−ｍｍ　’）Ｉ”Ｃ二Ｍ変換
可能プローブヘッドを用いての種々の溶媒での）は、′
Ｈ−及び”Ｃ−）ＪＭＨに対しそれぞれ４００．１３＆
ヒ１００．６２　Ｍｌ；ｚ’作動すルＡＳＰＥＣＴ　３
０００電算機及びパルスプログラマ−と共にブラソヵー
ＡＭ−４００のナロー・ボア・スペクトロメーターを用
いて行う。

（原料の採取、抽出及び予備実験） 当初は西部インド洋（モーリシャス島）めアメフラシ（
Ｄ、ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ　）を１９７２年１０月に
採取した。１９７５年３月までに、ＮＣｉのＰ３８８リ
ンパ細胞白血病（ＰＳ系）に対するエタノール抽出物の
確実な活性が確立しＴ／Ｃ２３５（６００ｍｇ）がら１
６７（１７６ｍｇ／ｋｇ）と判明した。その後に採取し
たアメフラシについての一連の同様な抽出物も同等の結
果を与えた。ここに述べた実験は、エタノール中に保存
した１９８２年の採取品（同一地方）について行った。

動物（１０００に、ｇ）とエタノール保存品の総量は７
００ガロンである。

抽出及び溶媒分配の後、大スケールの分取ＨＰＬＣのた
めのメチレンクロリド濃縮物２．７５ｋｇが得られる。

シリカゲル（ダビシル６３３．２００−４００メツシユ
、７：３のヘキサン・酢酸エチル中にスラリーパンクさ
れている）を用いて２つのカラムを並列（６”　ｘｌＯ
“）にパンクする。濃色（濃緑）の濃縮物２．７５に、
を酢酸エチル２ガロンに溶かし、次の溶媒勾配を毎時６
０〜７２リツトル用いてカラムにポンプで送りクロマト
処理する。

フラクション リットル　Ｎｏ、　　　　　ｇ ７０／３０ヘキサン・酢酸エチル　　　　　２００　　
　１　　　　６４・９６０／４０ヘキサン・酢酸エチル
　　　　　１２０２〜８２８２５０１５０ヘキサン・酢
酸エチル　　　　　２４０８〜９７８１０〜１４　　１
６０．１ １５〜１６５８ １７〜１８　　　７２．２ １００χ　酢酸エチル　　　　　　　　　　１２０　　
１９〜２１　　　７４．９２２〜２５　　　７０．６ ９５１５１０．７酢酸エチル・メタノール・水　１２０
　　２６〜２８　　１５６．４２９〜３１　　　５０．
５ ８３／１７／１．４酢酸エチル・メタノール・水２４０
　　３２〜３５　　　４２．７３６〜３８　　　５０．
３ ３９　　　６６．２ ４１〜４５（Ａ）　　１３２ ６１／３３／２５１Ｍ１１チル・メ９　／−ルー水　２
４０　　４６〜５０（Ｂ）　　７２５２〜５５　　２０
９．５ ５０１５０１５酢酸エチル・メタノール・水　　　　　
５６〜６０５６４５／４５／偵酢酸エチル・メタノール
・水　　　　　６１〜６５　　１００６６〜６９　　　
３０．５ 各フラクションを溶媒２０リツトルで溶離し、（ＴＬＣ
で）比較できるフラクションを合併する。

（ドラスタチン１５の単離） 分取ＨＰＬＣフラクションのうち、次の二つがＰ２Ｓ５
系に対して優れた活性を示した。すなわち、フラクショ
ンＡ　（１３２，Ｏｇ　ＰＳ　Ｔ／Ｃ毒性−３０で１６
５−＋７．５　ｍｇ／ｋｇ及びＥＤｓｏ＜　１０−”）
　、及びフラクションＢ　（７２，Ｏｇ　　ＰＳ　Ｔ／
Ｃ毒性ム３５で１４１→８，７　ｍｇ／ｋｇ及びＥＤｓ
。＜１０−”）。

フラクションを合併し、乾燥して１９０．４ｇとする。

主要部分（１５２ｇ）は、次のチャート（その１．２及
び３）に示すように処理する。

ガ創チャート（そのｌ） フラクションＡ＋Ｂ　　（１５２ｇ） １．７９ｇ　　　　６．０７ｇ　　　　１２．５ｇＥＤ
ｓｏ　　約１領１１０−２〜１Ｏ−３１０−ＩＥＤ、。

２．１　ｘ　１０−”　　　　３．４−’分数１ヒ」Ｉ
已９１と ９１．６ｍｇ ＥＤｓｏ　　１．４　ｘ　１０” ％胆ジー上（シυと ２．４　ｘ　１０−” フラクションＡ（！＝８　（１５２ｇ）の大部分を、上
記の分離チャート（その１〜３）に示すように、５つの
１：ｌのメチレンクロリド−メタノールの部分にセファ
デフクスＬ１１−２０のカラム（１０ｘ１２０ｃｍ）で
クロマト処理する。活性フラクションを合併し、シリカ
ゲルのカラム（４，５ｘ８０ｃｍ；　ｆ、２ｋｇ）及び
段階勾配のメチレンクロリド−メタノール（４９：１．
２３：２．９：１．２２：３．１７：３．４：１．１：
１　、及び最後に１００χメタノール）を用いて分離し
て活性フラクションｂ　（６，８７ｇ）を得る。

このフラクションｂを、９９：１−１：ｌのメチレンク
ロリド−メタノール勾配を用いてシリカゲル（乾燥品）
で再クロマト処理する。得られた活性フラクションｄ−
ｉ（４，６ｇ）を合併し、９９：１−１＝１の酢酸エチ
ル−メタノール勾配を用いて、シリカゲル（乾燥カラム
）でクロマト処理して活性フラクションｊ及びｋ　（１
，２７ｋｇ）を得る。

両フラクション（ｊ及びｋを合併）を、５：５：１ヘキ
サン−メチレンクロリド−メタノール分配系を用いて、
セファデックスＬＨ−２０上でクロマト処理してフラク
ション翔を得る。このフラクション…を９９：１−ｉ：
ｔのメチ・レンクロリドーメタノール勾配を用いてシリ
カゲル（サイズＢ１メルク社のプレパック）上で分離し
て活性成分ｐ（３９，２ｍｇ）及びｑ　（４４ａ＋ｇ）
とする。ここでフラクションｐ及びｑを、分取ＴＬＣ（
９０：１０：　１酢酸’：Ｌチル−）夕／　−ルー水の
移動相）を用いて平行的に精製し、次いで５：５：ｌヘ
キサン−メチレンクロリド−メタノール、５：５：ｌヘ
キサン−酢酸エチル−メタノール及び最後は５：５：１
ヘキサン−トルエン−メタノール溶媒系で逐次セファデ
ックスＬＨ−２０分配を行う。

フラクションｐは８．６ｍｇの、フラクションｑは１１
．３ｍｇの純ドラスタチン１０を与え、総収量は２８．
７１１℃ｇで、メチレンクロリド−メタノールから無定
形で無色の粉末、ｍｐ１０７　１１２℃、となる。

高度に活性なフラクションｉを、９９：１→１：１のメ
チレンクロリド−メタノール勾配をシリカゲル（サイズ
Ｂ、メルク社のプレパック）上で分離して、活性フラク
ションｆ　４　（１２，８ｍｇ、　Ｅ［ｌｓｏ・７．２
ｘｌＯ−’）を、分離チャート（その３）に示すように
得る。得られた活性フラクションを、１　：　ｌ　−９
：１のメタノール−水勾配で、ＨＰＬＣ（シリカゲル０
０Ｓ−２カラム）を用いて、最終的に分離する。

以上の方法で、６．２ｍｇの純ドラスタチン１５が得ら
れた。

ドラスタチン１５の構造及びその物性やスペクトル値は
、既に本明細書中の適当な箇所や第１表及び第２表に記
載した。

ドラスタチンやその合成品及びその薬学的に活性で生理
的に禁避でない誘導体の投与は、例えば急性骨髄性白血
病、急性リンパ性白血病、悪性メラノーマ、肺がん、神
経芽腫、肺の小細胞がん、胸部がん、結腸がん、卵巣が
ん、膀胱がん等のヒトや動物の新生物病の治療に用いら
れる。

投与量は、新生物病のタイプや、年齢、健康状態、体重
のような患者の状態、同時に行われている治療法及び治
療の頻度と比率といった要因に依存する。

例えば、患者の体重１ｋｇ当りの活性成分の−ｇで表し
た量は、静脈注射では０．１から約２０ｍｇ、筋肉内注
射では１から５０ｗ＋ｇ、経口投与では約５から１００
ａ＋ｇ、経鼻吸入では５から約１’００ｍｇ、そしてエ
アゾルの場合は５から約１００ｍｇである。

濃度であられすと、局所への用途、例えば、経皮、経鼻
、経咽頭、経気管支、経膣、経直腸、または眼部からの
投与では、本発明組成物中の活性成分は約０．Ｏｌから
約５０ｗ／ｗｚ、又は好ましくは約１から約２０−／−
χであり、腸管外の用途では約０．０５％から約５０ｗ
／ｗＸであり、又は好ましくは約５％から約２０ｗ／ｗ
χである。

本発明の組成物は、好ましくは単位用量形態、例えば活
性成分の適量を含む錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒
、坐剤、無菌の腸管外用溶液、又は懸濁液、経口の溶液
、又は懸濁液の形でヒトや動物に投与する。

経口投与のためには、固形又は液状の単位用量形態が製
造される。

粉末剤は、活性成分を適当な細かいサイズに粉砕し希釈
剤と混合することにより極めて容易に得られる。希釈剤
は、例えば乳糖やデンプンのような可食性の炭水化物で
あって良い。好ましくは蔗糖のような甘味剤が賦香油と
同様に用いられる。

カプセル剤は、上述のような粉末をゼラチン製のカプセ
ルに充填して製造する。好ましくは充填の操作を助ける
ために、充填に先立ってタルク、ステアリン酸、マグネ
シウム、ステアリン酸カルシウム等のような滑剤を粉末
に加える。

ゼラチンの軟カプセル剤は、活性成分のスラリーを、植
物油、軽質の液状ベトロラクラム、その他の不活性油や
トリグリセリドと共に機械的カプセル化で製造する。

錠剤は、粉末混合物を準備し、顆粒化、又はスラッグ化
し、滑剤を加え、そして圧縮して製造する。粉末混合物
は、活性成分を混合し、希釈剤や基剤、例えばデンプン
、乳糖、カオリン、リン酸カルシウムなどと共に適宜細
粉化して製造する。

粉末混合物は、結合剤、例えばコーンシロップ、ゼラチ
ン液、メチルセルロース液やゴムのりで湿らせ、次いで
網目を強制通過させて顆粒とすることができる。顆粒化
する代わりに、粉末混合物を、例えば錠剤機の中を通し
、得られた不完全な形の錠剤を小片（スラグ）に粉砕し
てスラグ化することができる。スラグには、ステアリン
酸、ステアリン塩、タルクや鉱物油を添加して、錠剤成
形用の型に付着するのを防ぐため、潤滑化することがで
きる。潤滑化された混合物を圧縮して錠剤とする。

好ましくは、錠剤は、シェラツクの封止コーティングや
腸浴コーティング、糖やメチルセルロースのコーティン
グ及びカルナウバろうのポリッシュ・コーティングから
成る保護コーティングを施すことができる。

シロップ、エリキシル、懸濁液のような経口投与のため
の液状の単位用量形Ｂ（その−さし分が一定量の活性成
分を含むようにしたもの）とすることもできる。水溶性
の形態は、糖と香料と保存剤と一緒に水性ベヒクル中に
溶解してシロップとすることによって製造する。エリキ
シルは、水性アルコールベヒクルを適当な甘味剤と香料
と共に用いて製造する。懸濁剤は、アラビアゴムやトラ
ガカントやメチルセルロースのような懸濁用剤を用イ、
適当なベヒクルと共に不溶性の形でつくることができる
。

腸管外投与のために、活性成分と無菌ベヒクル（水が好
ましい）を用いて、液状の単位用量形態を製造する。活
性成分は、その形態や濃度に応じて、ベヒクル中に懸濁
させるか又は溶解させる。

溶液をつくるには、水溶液の活性成分を、注射用の水に
溶かし、適当なバイアル又はアンプルに封入する前に無
菌口過する。好ましくは、ベヒクル中に佐剤、例えば局
所麻酔剤、保存剤や緩衝剤を溶解させる。腸管外用懸濁
剤は、活性成分をベヒクル中に溶解させずに懸濁させ、
そして滅菌工程は口過によって完結しない点を除けば、
実質的に上記と同様にして製造される。

腸管外用懸濁剤に関して、活性成分は無菌ベヒクルに懸
濁する前に、好ましくはエチレンオキシドと接触させて
滅菌する。好ましくは、界面活性剤又は湿潤剤を組成物
に含有させ、活性成分の分布を均一にする。

経口及び腸管外投与のほかに、直腸や膣からのルートも
使用できる。活性成分は、坐剤という手段で投与できる
。融点がほぼ体温であるか又は容易に溶けるベヒクルが
用いられる。例えばカカオ脂や種々のポリエチレングリ
コール類（カーボワックス）が、高い効果をもつ坐剤用
のベヒクルとして使用できる。

鼻内滴下のためには、活性成分と適当な医薬ベヒクル（
好ましくはパイロジエンを含まない水）を用いて、液状
の単位用量形態を製造する。もし投与法として吸入が選
択されたときは、乾燥粉末が処方し得る。

エアロシンとしての用途のためには、活性成分を気体の
又は液化した噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタ
ン、二酸化炭素、窒素、プロパンなど）及び必要又は所
望に応じ通常の佐剤（例えば、共溶媒や湿潤剤）と共に
、加圧エアロゾル容器中に封入して製造する。

本願明細書において使用する「単位用量形態」という用
語は、ヒトや動物の単位用として適当な物理的に個々の
単位を意味し、ここに各々の単位は、必要な医薬用希釈
剤、担体又はベヒクルと一緒になって所望の治療効果を
生ずるように計算された量の活性成分を含有するもので
ある。本発明の所望な単位用量形態の明細は、次の条件
により指示され直接に依存する。すなわち、 （ａ）活性成分の特性及び特定の所望の治療効果及び （ｂ）この明細書に開示しであるように、ヒトにおける
治療用途のための活性成分を配合する技術に本質的な限
界。

これらは、本発明の特徴である。本発明における適当な
単位用量形態の例としては、錠剤、カプセル剤、トロー
チ、坐剤、粉末剤、カシェ剤、茶さじ用剤、大さじ用剤
、滴剤、アンプル剤、バイアル剤、以上のいずれかの複
合形態、その他ここに述べられるような他の形態がある
。

新生物病治療剤として用いられる活性成分は、それ自体
容易に入手でき、そして既に確立され、ここには再掲載
する必要のない方法で製造できるような医薬用材料を用
いることによって容易に単位用量形態としてつくること
ができる。

（実施例） 本発明の理解を更に助けるために、但し本発明を限定す
る意味ではなく、本発明を一層明瞭に開示するための実
施例を以下に掲げる。

大施皿−上 本発明の実施化のために幾つかの用量形態を製造した。

これは以下に例示される。

ここに「活性成分」とは、ドラスタチン１５とその合成
品及びその非毒性の薬学的に活性な諸条件をあられす。

組成物　Ａ　（硬ゼラチン　カプセル剤）ｌカプセル中
に活性成分２０ｍｇを含有する、二鞘式硬質ゼラチンカ
プセル剤１０００個を、次のタイプと分量の成分から製
造する。

活性成分（微粉化）　　　　　　　２０ｇトウモロコシ
デンプン　　　　　２０ｇタルク　　　　　　　　　　
　　　２０ｇステアリン酸マグネシウム　　　　２ｇエ
ア・マイクロナイザーで微粉化した活性成分を、他の微
粉化成分に加え、完全に混合し、常用に従ってカプセル
に充填する。

こ＼に得たカプセル剤は、１回１〜２カプセル１日１〜
４回経口投与すれば新生物病の治療に有用である。

上記方法に準じ、活性成分量を２０ｇの代りに５ｇ、２
５ｇ又は５０ｇ用いることにより、ｌカプセル中に活性
成分を夫々５■、２５ｍｇ又は５０■含有する製剤を製
造することができる。

組成物Ｂ（軟ゼラチンカプセル剤） まず最初に化合物をトウモロコシ油０．５ｍｌに懸濁し
て材料をカプセル化できるようにし、次いで上述の方法
でカプセル化して、１カプセル中に活性成分（エア・マ
イクロナイザーで微粉化）２０■を含有する経口投与用
の一鞘式ソフトゼラチンカプセル剤を製造する。

このカプセル剤は、１回１〜２カプセルを１日１〜４回
経口投与すれば新生物病の治療に有用である。

組成物Ｃ（錠剤） １錠中に活性成分２０■を含有する錠剤１０００錠を、
次のタイプと分量の成分から製造した。

活性成分（微粉化）　　　　　　　　　２０ｇ乳　　￥
＠　　　　　　　　　　　　　　　　３００ｇトウモロ
コシデンプン　　　　　　５０ｇステアリン酸マグネシ
ウム　　　　　４ｇ軽軽質液状ベトシレータム　　　　
　５ｇエアマイクロナイザーで微粉化した活性成分を他
の成分に加え、完全に混合しスラグ化し、このスラグを
１６番篩を通して力を加えて粉砕し、得られた課粒を圧
縮して錠剤とし、１錠中に活性成分が２００■含まれる
ようになる。

上述の錠剤は１回１〜２錠、１日１〜４回経口投与する
ことによって、新生物病を治療するのに有用である。

上述と同様にして、活性成分２０ｇの代りに２５ｇ又は
Ｌｏｇを用いることにより、１錠中に活性成分を２５■
又は１０■含有する錠剤を製造できる。

組成物Ｄ（経口用懸濁剤） 次のタイプと量の成分を用いてζ各条さじ１杯（５＋ｍ
ｌ）用量あたり５■の活性成分を含有する水性懸濁液１
０００■を製造する。

活性成分（微粉化）　　　　　　　　　１ｇクエン酸　
　　　　　　　　　　　　２ｇ安息加酸　　　　　　　
　　　　　１ｇ蔗　　　糖　　　　　　　　　　　　　
　７９０ｇトラガカント　　　　　　　　　　　５ｇレ
モン油　　　　　　　　　　　　　　２ｇ脱イオン水を
加え全量　　　１０１００Ｏクエン酸、安息香酸、蔗糖
、トラガカント及びレモン油を充分な量の水に分散させ
８５０１の懸濁　　＼液とする。エアマイクロナイザー
で微粉化した活性成分を、それが均一に分布するまでシ
ロップ中で攪拌し、充分な量の水を加えＩｏｏｏｍｌと
する。

このようにして製造された組成物は１凹条さじ１杯（１
５ｍｌ）１日３回投与することにより、新生物病を治療
するのに有用である。

組成物Ｅ（非経口用製品） 新生物病治療用活性物質３０■をその１ｍｌ中に含有す
る非経口注射用無菌水性懸濁液を、次のタイプと量の成
分から製造する９ 活性成分（微粉化）　　　　　　　３０ｇポリソルベー
ト８０　　　　　　　５ｇメチルパラベン　　　　　　
　　２．５ｇプロピルパラベン　　　　　　０．１７　
ｇ注射用水を加え全量　　　　１０００ｍｌｍｌ活性比
外のすべての成分を水に溶かし、溶液を濾過して無菌と
し、これにエアマイクロナイザーで微粉化した無菌の活
性成分を添加し、得られる懸濁液を無菌のバイアルに充
填し、バイアルを密閉する。

このようにして得られる組成物は、１回１ｍｌ（ＩＭ）
を１日３回用いることにより新生物病の治療に有用であ
る。

組成物Ｆ（経直腸及び経膣坐剤） 次のタイプ量の成分を用い、１個の重量２．５ｇでかつ
活性成分２０■を含有する坐剤１００ｏ個を製造する。

活性成分（微粉化）　　　　　　　　１．５ｇプロピレ
ングリコール　　　　１５０ｇポリエチレングリコール
４０００を加え全量５００ｇ 活性成分をエアマイクロナイザーを用いて微粉化し、プ
ロピレングリコールに添加し、混合物が均一に分散され
るまでコロイドミルを通過させる。

ポリエチレングリコールを融かし、プロピレングリコー
ル分散液を、ゆっ（りと攪拌しつつ添加する。この懸濁
液を、冷却してない型（４０’Ｃ）に注入し、組成物を
放冷して固化させ、型から取り出し、各々の坐剤をホイ
ルで包む。

上述の坐剤は新生物病の治療のために直腸又は膣に挿入
する。

組成物Ｇ（経鼻用懸濁剤） 次のタイプと分量の成分を用いて、１ｍｌあたり２０■
の活性成分を含有する経鼻点滴用の無菌水性懸濁液１０
１００Ｏを製造する。

活性成分（微粉化”）　　　　　　　１．５ｇポリソル
ベート８０　　　　　　５　ｇメチルパラベン　　　　
　　　　２．５ｇプロピルパラベン　　　　　　０．’
１７　ｇ脱イオン水を加え全１　　１０１００Ｏ活性成
分以外のすべての成分を水に溶かし、その溶液を濾過し
て無菌とし、この無菌液に、エアマイクロナイザーで微
粉化した無菌の活性成分を加え、得た懸濁液を無菌容器
へ無菌充填する。

この組成物は０．２〜０．５　ｍｌを１日１〜４回点鼻
することにより新生物病の治療に有用である。

活性成分はまた、非希釈の純品形態で皮膚、経鼻、経咽
喉頭、経気管支又は経口的に局所使用のために存在しう
る。

組成物Ｈ（粉末剤） バルク形態の活性成分５ｇをエアマイクロナイザーを用
いて微粉化し、シェイカータイプの容器に入れる。

上記組成物は１日１〜４回局所に適用することにより新
生物病の治療に有用である。

組成物Ｉ（経口用粉末剤） バルク形態の活性成分１００ｇをエアマイクロナイザー
を用いて微粉化し、各々２０■ずつ分包する。

上述の粉末は、１回１〜２包を１日１〜４回、コツプ一
杯の水に懸濁させて経口投与することにより、新生物病
の治療に有用である。

組成物Ｊ（吸入剤） バルク形態の活性成分１０ｇを、エアマイクロナイザー
を用いて微粉化する。

このものは３０■を１日１〜４回吸入することによって
新生物病の治療に有用である。

組成物に（硬ゼラチンカプセル剤） １カプセル当り２０■の活性成分を含有する、二鞘式ハ
ードカプセル剤１００個をつくる。

エアマイクロナイザーを用いて活性成分を微粉化し、こ
れを常法に従ってカプセル充填する。

上述のカプセルは、１回１〜２個、１日１〜４回経口投
与することにより新生物病の治療に有用である。

上述の方法により、活性成分２０ｇの代りに５ｇ、２５
ｇ又は５０ｇ用いて同様の操作により、夫々ｌカプセル
中に活性成分を５．２５及び５０■含有するカプセル剤
を製造できる。

太ｌ五−１ 実施例１に記載の組成物のようにして作ったドラスタチ
ン１５の単位用量形態を、リンパ球白血病Ｐ３８８につ
いてＣａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｒｅｐ
ｏｒｔｓ　。

第３部、３巻、２号、１９７２年９月、Ｐ、　　９以下
に記載のプロトコール１２００を用いてスクリーニング
を行った。

ドラスタチン１５は、生体外細胞系でＰ２Ｓ５の生長を
著しく阻害した（ＥＤｓ。＝２．４　Ｘｌ０−’μｇ／
蒙ｇ）。

−７′ｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される、ドラスタチン１５と命名された細胞成長阻
   害物質。 ２、次の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される天然若くは合成物質又はその非毒性の薬学的
   活性誘導体の有効量と、薬学的に許容し得る担体とから
   成る医薬製剤。 ３、次の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される天然若くは合成物質又はその薬学的に活性な
   非毒性誘導体の有効量と、薬学的に許容し得る担体を患
   者に投与することから成る、新生物病に罹っている患者
   の治療方法。 ４、体重１ｋｇ当り０．１ｍｇから約２０ｍｇの水準の
   用量で静脈内に該物質を投与する第３項の方法。 ５、体重１ｋｇ当り１ｍｇから約５０ｍｇの水準の用量
   で皮下に該物質を投与する第３項の方法。 ６、体重１ｋｇ当りｍｇから約１００ｍｇの水準の用量
   で経口的に該物質を投与する第３項の方法。 ７、新生物病がリンパ球白血病Ｐ３８８である第３項の
   方法。 ８、少なくはあるが、有効な量が、体重１ｋｇ当り約１
   ｇから４ｇから成る第７項の方法。