JP2024532537A - 真核生物における遺伝暗号の拡張のための新規アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、改良された新規アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体に関し、遺伝暗号の拡張に有用である。本発明はまた、対応するコード配列およびそのコード配列を含む真核細胞株に関する。本発明はまた、新規アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体によって組み込まれた１つ以上の非天然アミノ酸残基を含む目的のタンパク質（ＰＯＩ）を調製する方法に関する。本発明はまた、ポリペプチド結合体（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製する方法に関し、該方法では本発明のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体によって生成されたＰＯＩを、１つ以上の結合相手分子と反応させる。最後に、本発明は、１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むこのＰＯＩを調製するために必要な構成要素を含むキットに関する。

Description

本発明は、改良された新規アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体に関し、遺伝暗号の拡張に有用である。本発明はまた、対応するコード配列およびそのコード配列を含む真核細胞株に関する。本発明はまた、新規アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体によって組み込まれた１つ以上の非天然アミノ酸残基を含む目的のタンパク質（ＰＯＩ）を調製する方法に関する。本発明はまた、ポリペプチド結合体（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製する方法に関し、該方法では本発明のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体によって生成されたＰＯＩを、１つ以上の結合相手分子と反応させる。最後に、本発明は、１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むこのＰＯＩを調製するために必要な構成要素を含むキットに関する。

遺伝暗号の拡張（ＧＣＥ）は、非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を部位特異的にタンパク質に組み込むための汎用性の高いツールである。これらのｎｃＡＡは、タンパク質の蛍光標識または毒性ペイロードの抗体との結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）など、タンパク質工学に用いることができる。翻訳中にｎｃＡＡをタンパク質に組み込むために、ｎｃＡＡを認識でき、そうでなければ宿主生物と直交する特殊なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ（ａａＲＳ／ｔＲＮＡ）対が必要である。

現在、このようなａａＲＳ／ｔＲＮＡ対がいくつか知られており、例えばＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ、またはＭｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓなどの古細菌由来のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌがある。ＰｙｌＲＳ合成酵素には結合部位があり、本来はピロリジンを認識する。この結合部位に特定のアミノ酸を連鎖させることにより、様々なｎｃＡＡをこの合成酵素に認識させることができる。

一方、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ対と組み合わせて使用できるｎｃＡＡは２００を超えて存在する。

ｎｃＡＡの特定の群には、Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（「Ｂｏｃ」）、シクロオクチン－リジン（「ＳＣＯ」）、ビシクロ［６．１．０］ノニン－リジン（「ＢＣＮ」）、トランス－シクロオクト－２－エン－リジン（「ＴＣＯ^＊Ａ」）およびトランス－シクロオクト－４－エン－リジン（「ＴＣＯ－Ｅ」）が含まれ、例えば、非特許文献１に記載されている。テトラジンとクリックケミストリーを介して反応するこれらのｎｃＡＡは、この反応が非常に速く、生体直交型であるため、非常に興味深い。

ＰｙｌＲＳの結合ポケットにある２つのアミノ酸は、このような嵩高いアミノ酸の組み込みを容易にするために重要であることがよく知られている。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳを参照して、以下の配列位置を変更した：嵩高いアミノ酸を組み込むことができるように、チロシン３０６をアラニン（Ｙ３０６Ａ）に変更する必要があり、さらにチロシン３８４をフェニルアラニン（Ｙ３８４Ｆ）に変異させる必要があった。結果として、ＰｙｌＲＳ変異型ＰｙｌＲＳ^ＡＦが得られた。様々なｎｃＡＡの組み込み効率は、非常に低いものから高いものまで様々である。特にＴＣＯ－ＥというｎｃＡＡは、ＰｙｌＲＳ^ＡＦにあまり受け入れられない。

特許文献１には、Ｍ．ｍａｚｅｉ由来の変異型ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素が開示されている。特に、一重変異体Ｙ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆ、ならびに３０６位および３８４位の対応する二重変異体がそこに記載されている。さらに、二重変異体Ｌ３０９ＡおよびＣ３４８Ａもそこに記載されている。前記変異体はＢｏｃをアミノアシル化できることが報告されている。

特許文献２には、Ｍ．ｍａｚｅｉ由来の改変されたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を適用して非天然タンパク質を生産する方法が記載されている。以下の置換の少なくとも１つを含む：Ａ３０２Ｆ、Ｙ３０６Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｎ３４６Ｓ、Ｃ３４８Ｖ／ＩおよびＹ３８４Ｆ。

特許文献３には、ＢＣＮ基を含むアミノ酸を、それをコードする直交コドンと、Ｌ３０１Ｖ、Ｌ３０５Ｉ、Ｙ３０６Ｆ、Ｌ３０９ＡおよびＣ３４８Ｆから選択される変異を含むＭ．ｍａｚｅｉ由来の直交ＰｙｌＲＳ合成酵素を用いて、ポリペプチドに組み込む方法が記載されている。

したがって、本発明が解決しようとする課題は、ＰＯＩのアミノ酸配列への嵩高いｎｃＡＡの（特に、トランス－シクロオクト－２－エン－リジン（「ＴＣＯ^＊Ａ」）、トランス－シクロオクト－４－エン－リジン（「ＴＣＯ－Ｅ」）およびＨ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（「Ｂｏｃ」）およびそれらの組み合わせから選択されるｎｃＡＡ残基の）、（特に先行技術の変異型ＰｙｌＲＳ^ＡＦと比較して）改良された組み込みを示す新規アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の提供に関する。

欧州特許出願ＥＰ－Ａ－２１９２１８５ 欧州特許出願ＥＰ－Ａ－２２２１３７０ 欧州特許出願ＥＰ－Ａ－２８０４８７２

Ｒｅｉｎｋｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃｈｅｍ（２０２１）２７（１９）６０９４－６０９９

上述の課題は、驚くべきことに、先行技術の合成酵素ＰｙｌＲＳ^ＡＦの特定の重要な位置の系統的変異、および得られた変異体の特定の位置において引き続いて逆変異を行うことによって解決することができる。

本発明者らは、２０個の可能なアミノ酸のいずれかに５つの位置を変異させた親遺伝子Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来のＰｙｌＲＳ^ＡＦを使用してライブラリー選択を行った。この遺伝子ライブラリーは、ポジティブとネガティブの反復スクリーニングで選択された。このスクリーニングの結果、本発明者らは、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｂ１１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｃ１１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｇ３およびＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｈ１２と呼ぶ、２つまたは３つのアミノ酸残基がさらに変異したＰｙｌＲＳ^ＡＦ合成酵素のいくつかの変異体を得ることができた。Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆの変異が嵩高いｎｃＡＡの組み込みに本当に重要かどうかを調べるため、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１変異体において、部位特異的変異誘発によってこれらのアミノ酸を元のアミノ酸に戻した。したがって、新しい変異体はＹ３０６ＡとＹ３８４Ｆの変異を含まず、ＰｙｌＲＳ Ａ１と呼ばれる。Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆの変異を含まない変異体がさらに調製された。これは３０６Ｍ ３０９Ｍ ３４８Ａの変異を有し、ＰｙｌＲＳ ＭＭＡと呼ばれる（表１）。

これらの新しいＰｙｌＲＳ変異体は、蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）によって蛍光レポーターを利用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した。レポーターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合した赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）を含み、Ｙ３９の位置にアンバー終止コドンを有し、ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}と呼ばれる。新しい変異体はすべて、今回試験した両方のｎｃＡＡを組み込むことができた。さらに、ＴＣＯ－Ｅを用いた場合、すべての新しい変異体はＰｙｌＲＳ^ＡＦと比較してより強い緑シグナルを示す。さらに驚くべきことに、ＰｙｌＲＳ^ＡＦのＹ３０６ＡとＹ３８４Ｆの変異は、嵩高いｎｃＡＡｓの組み込みに実際には重要ではないことが観察された。特に、新しい「非ＡＦ」変異型ＰｙｌＲＳ Ａ１は、既知のＰｙｌＲＳ ＡＦ変異体と比較して、嵩高いｎｃＡＡｓに対してより優れた合成酵素となる変異を含む。

ＰｙｌＲＳ Ａ１と同様に、さらに「非ＡＦ」変異体、すなわちＰｙｌＲＳ Ｂ１１、ＰｙｌＲＳ Ｃ１１、ＰｙｌＲＳ Ｇ３およびＰｙｌＲＳ Ｈ１２が提供された（表２参照）。

本発明に従って使用される以下のプラスミドのプラスミドマップが示されている：レポータープラスミドｐＣＩ－ｉＲＦＰ－ＥＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}－６Ｈｉｓ（配列番号９７）（図１Ａ；上図）。プラスミドｐＣＭＶ－ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ－Ｕ６ｔＲＮＡｒｖ（配列番号９８）（図１Ａ；下図）。プラスミド、ｐＢＫ－ＰｙｌＲＳ^ＷＴ（配列番号９９）（図１Ｂ；上図）。プラスミドｐＲＥＰ－ＰｙｌＴ（配列番号１００）（図１Ｂ；下図）。プラスミドｐＹＯＢＢ２－ＰｙｌＴ（配列番号１０１）（図１Ｃ；上図）およびｐＡＬＳ－ｓｆＧＦＰ^{Ｎ１５０ＴＡＧ}－ＭｂＰｙｌ－ｔＲＮＡ（配列番号１０２）（図１Ｃ；下図）。 様々なｎｃＡＡを使用した様々なＰｙｌＲＳ変異体（ＰｙｌＲＳ ＡＦ、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｂ１１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｃ１１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｇ３、およびＰｙｌＲＳ ＡＦ Ｈ１２）のＦＦＣ実験のデータを示す。特に、ＴＣＯ^＊Ａ（図２Ａ）およびＴＣＯ－Ｅ（図２Ｂ）を組み込む能力を示す。図２Ｃは、ｎｃＡＡ非存在下での発現プロファイルを示す。 この図は、様々なＰｙｌＲＳ変異体であるＰｙｌＲＳ ＡＦ、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１、ＰｙｌＲＳ Ａ１、およびＰｙｌＲＳ ＭＭＡのＦＦＣ分析によって得られたデータを棒グラフで示す。ＴＣＯ－Ｅ（図３Ａ）、ＴＣＯ^＊Ａ（図３Ｂ）、およびＢｏｃ（図３Ｃ）を組み込む能力を示す。上段の各棒グラフは、それぞれＦＦＣによって得られた平均ＧＦＰシグナルを平均ｉＲＦＰシグナルで割った比率を示しており、これは組み込み効率を反映する。中央の各棒グラフは、それぞれ同じデータを示しているが、１００μＭ ｎｃＡＡを用いたＰｙｌＲＳ ＡＦ変異体で観察された比率に正規化したものである。下段の棒グラフは、それぞれ平均ＧＦＰ／平均ｉＲＦＰの比を、所望のｎｃＡＡ濃度でＰｙｌＲＳ ＡＦ変異体について得られた平均ＧＦＰ／平均ｉＲＦＰの比に対して正規化したものである。これらの棒グラフは、ＰｙｌＲＳ ＡＦと比較して、各変異体の組み込み効率がどれだけ高いかを示す。 様々な古細菌ＰｙｌＲＳタンパク質の配列アラインメントを示す。 嵩高いｎｃＡＡシクロオクチン－リジン（ＳＣＯ）の様々な濃度における変異型ＰｙｌＲＳ Ａ１の組み込み効率を評価したＦＦＣデータを示す。

［発明の詳細な説明］
Ａ．略語
Ｂｐｓ＝塩基対
ＢＣＮ＝２－アミノ－６－（９－ビオシクロ［６．１．０］ノナ－４－イニルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイド酸
ＢＯＣ＝２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸；実施例では、「ＢＯＣ」は特に（２Ｓ）－２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸＝Ｂｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ－ＯＨ＝Ｎ－α－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リジンを指す。
Ｃｍ＝クロラムフェニコール
ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス
Ｃｒｍ１＝染色体領域維持１、カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる。
ＤＨ１０Ｂ＝大腸菌株Ｆ－ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ－ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ－ｒｐｓＬ（Ｓｔｒ^Ｒ）ｎｕｐＧ
ｄｓＲＮＡ＝二本鎖 ＲＮＡ
ｄＳＴＯＲＭ＝直接確率的光学再構築顕微鏡法
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＡＩ＝大腸菌株ＢＦ^－ｏｍｐＴ ｇａｌ ｄｃｍ ｌｏｎ ｈｓｄＳ_Ｂ（ｒ_Ｂ ^－ｍ_Ｂ ^－）λ（ＤＥ３［ｌａｃＩ ｌａｃＵＶ５－Ｔ７ｐ０７ ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）［ｍａｌＢ^＋］_Ｋ－１２（λ^Ｓ）ａｒａＢ：：Ｔ７ＲＮＡＰ－ｔｅｔＡ
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ＧＣＥ＝遺伝暗号の拡張
ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質
ｓｆＧＦＰ＝スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド
ｉＲＦＰ＝赤外蛍光タンパク質
Ｋａｎ＝カナマイシン
ｎｃＡＡ＝非標準アミノ酸
ＮＥＳ＝核外搬出シグナル
ＮＬＳ＝核局在化シグナル
ＮＮＫ＝飽和変異誘発に使用される特定の種類の縮重コード
Ｏ－ｔＲＮＡ＝直交ｔＲＮＡ
Ｏ－ＲＳ＝直交ＲＳ
ＰＡＩＮＴ＝ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのための点集積
ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水
ＰＯＩ＝目的のポリペプチド、
ｐＲＳ＝原核生物ＲＳ
ｐｔＲＮＡ＝原核生物ｔＲＮＡ
ｐｔＲＮＡ－リボザイム＝ｐｔＲＮＡと少なくとも１つのリボザイムを含む原核生物ＲＮＡ分子
ＰｙｌＲＳ＝ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素
ＰｙｌＲＳ^ＡＦ＝アミノ酸置換Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリジルｔＲＮＡ合成酵素
ＲＰ－ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＳ＝アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
ＲＴ＝室温
ＳＣＯ＝２－アミノ－６－（シクロオクト－２－イン－１－イルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸

ＳＯＣ＝形質転換培地（例：０．５％酵母エキス；２％トリプトン；１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４；２０ｍＭグルコース）
ＳＰＡＡＣ＝（銅フリー）歪み促進逆アルキン－アジド環状付加反応
ＳＰＩＥＤＡＣ＝（銅フリー）歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応
ＳＲＭ＝超解像顕微鏡法
ＳＶ４０＝サル空胞ウイルス４０
Ｔ７ＲＮＡＰ＝Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
ＴＣＯ－Ｅ＝トランス－シクロオクト－４－エン－Ｌ－リジン

ＴＣＯ^＊Ａ＝トランス－シクロオクト－２－エン－Ｌ－リジン

Ｔｅｔ＝テトラサイクリン
ｔｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサー
ｔｅｔＯ＝テトラサイクリンオペレーター
ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ＝野生型または改変型ＰｙｌＲＳによってピロリジンでアシル化されることができるｔＲＮＡである。ｎｃＡＡをＰＯＩに部位特異的に組み込むために、好ましくはセレクターコドンの逆相補体であるアンチコドンを有する。（実施例で用いたｔＲＮＡ^Ｐｙｌでは、アンチコドンはＣＵＡである。）
ＵＮＡＡ＝非天然アミノ酸、ｎｃＡＡと同義語。
Ｕ６プロモーター＝哺乳動物細胞において、通常Ｕ６ ＲＮＡ（小核ＲＮＡ）の発現を制御するプロモーター

Ｂ．定義
本明細書中で別途に定義されない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。用語の意味及び範囲は明確であるべきである。しかしながら潜在的な多義性がある場合、本明細書に規定される定義はあらゆる辞書又は外部の定義よりも優先される。さらに、状況による別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。

ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）はアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）である。ＲＳは、ｔＲＮＡをアミノ酸又はアミノ酸類似体でアシル化できる酵素である。適切には、本発明のＰｙｌＲＳは酵素的に活性であり、すなわちｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）を特定のアミノ酸又はアミノ酸類似体、好ましくはＵＮＡＡ又はその塩でアシル化することができる。

本明細書で使用される「古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素」（「古細菌ＰｙｌＲＳ」と略される）という用語は、少なくともＰｙｌＲＳアミノ酸配列のセグメント又は全ＰｙｌＲＳアミノ酸配列が、古細菌由来の天然ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列又はその天然ＰｙｌＲＳの酵素的に活性なフラグメント（断片）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するＰｙｌＲＳを意味する。

本発明のＰｙｌＲＳは、変異型古細菌ＰｙｌＲＳ、又はその酵素的に活性なフラグメントを含むことができる。

通常、「変異型古細菌ＰｙｌＲＳ」または「変異した古細菌ＰｙｌＲＳ」は、１つ以上のアミノ酸残基の付加、置換及び／又は欠失を含む点で、対応する野生型ＰｙｌＲＳとは異なる。好ましくは、これらは、ＰｙｌＲＳ安定性を改善し、ＰｙｌＲＳ基質特異性を改変し、及び／又はＰｙｌＲＳ酵素活性を増強する修飾である。特に好ましい「変異型古細菌ＰｙｌＲＳ」または「変異した古細菌ＰｙｌＲＳ」については、本明細書中で以下に詳述する。

用語「核外搬出シグナル」（「ＮＥＳ」と略される）は、それを含むポリペプチド（本発明のＮＥＳ含有ＰｙｌＲＳ等）が真核細胞の核から搬出されるように指示できるアミノ酸配列を意味する。該搬出は、大部分がＣｒｍ１（染色体領域維持１；カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる）によって媒介されると考えられている。ＮＥＳは当技術分野において公知である。例えば、データベースＶａｌｉｄＮＥＳ（ｈｔｔｐ：／／ｖａｌｉｄｎｅｓｓ．ｙｍ．ｅｄｕ．ｔｗ／）は、実験的に検証されたＮＥＳ含有タンパク質の配列情報を提供する。さらに、例えばＮＥＳｂａｓｅ１．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｄａｔａｂａｓｅｄ／ＮＥＳｂａｓｅ－１．０／；Ｌｅ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１），２００３参照）等のＮＥＳデータベースや、ＮＥＳ予測のためのツール、例えばＮｅｔＮＥＳ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＥＳ／；Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）、ＮＥＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＮｅｔＮＥＳ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｄ３３８－Ｄ３４３，２０１３；Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）及びＮＥＳｓｅｎｔｉａｌ（ＶａｌｉｄＮＥＳと組み合わせたウェブインターフェース）が一般に向けて利用可能である。疎水性のロイシンに富むＮＥＳが最も一般的であり、現在までに最もよく特徴がわかっているＮＥＳのグループを示す。疎水性ロイシンに富むＮＥＳは、３又は４個の疎水性残基を有する非保存的モチーフである。これらのＮＥＳの多くは、保存されたアミノ酸配列パターンＬｘｘＬｘＬ（配列番号１１１）又はＬｘｘｘＬｘＬ（配列番号１１２）を含む。なお、各Ｌはロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンのアミノ酸残基から独立して選択される。また各ｘは、任意のアミノ酸から独立して選択される（Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）。

用語「核局在化シグナル」（「ＮＬＳ」と略され、当技術分野では「核局在化配列」とも呼ばれる）は、それを含むポリペプチド（例えば、野生型古細菌ＰｙｌＲＳ）を真核細胞の核に取り込むように指示できるアミノ酸配列を意味する。前記輸送は、核膜孔を通って移動する複合体を形成するための、ＮＬＳ含有ポリペプチドのインポーチン（カリオフェリンとしても知られる）への結合によって媒介されると考えられている。ＮＬＳは当技術分野で公知である。多数のＮＬＳデータベース及びＮＬＳ予測のためのツールが一般に向けて利用可能である。例えば、ＮＬＳｄｂ（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１），２００３参照），ｃＮＬＳ Ｍａｐｐｅｒ（ｗｗｗ．ｎｌｓ－ｍａｐｐｅｒ．ａｉｂ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ；Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０６（２５）：１０１７１－１０１７６，２００９；Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４（１）：４７８－４８５，２００９参照），ＳｅｑＮＬＳ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１０）：ｅ７６８６４，２０１３参照）及びＮｕｃＰｒｅｄ（ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／～ｍａｃｃａｌｌｒ／ｎｕｃｐｒｅｄ／；Ｂｒａｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（９）：１１５９－６０，２００７参照）である。

上記で定義した本発明の変異型古細菌ＰｙｌＲＳは、変異体が由来する前記天然ＰｙｌＲＳに任意に存在するＮＬＳを除去することによって、および／または少なくとも１つのＮＥＳを導入することによって、さらに改変することができる。天然ＰｙｌＲＳ中のＮＬＳは、例えばｃＮＬＳマッパー等の既知のＮＬＳ検出ツールを用いて同定できる。

古細菌ＰｙｌＲＳまたはその変異体からのＮＬＳの除去及び／又は古細菌ＰｙｌＲＳまたはその変異体へのＮＥＳの導入は、真核細胞で発現したときにこのように改変されたポリペプチドの局在化を変化させること、特に真核細胞の核内のポリペプチドの蓄積を回避又は減少させることができる。したがって、真核細胞において発現する本発明のＰｙｌＲＳ変異体の局在化は、それが（依然として）ＮＬＳを含み、そしてＮＥＳを欠くという点で本発明のＰｙｌＲＳ変異体とは異なるＰｙｌＲＳまたはＰｙｌＲＳ変異体と比較して変化することができる。

本発明の古細菌ＰｙｌＲＳがＮＥＳを含むが（依然として）ＮＬＳを含む場合は、ＮＥＳの強度がＮＬＳを無効にし、真核細胞の核内のＰｙｌＲＳの蓄積を妨げるようにＮＥＳが選択されることが好ましい。

本発明のＰｙｌＲＳを得るための、野生型又は変異型ＰｙｌＲＳからのＮＬＳの除去及び／又は野生型又は変異型ＰｙｌＲＳへのＮＥＳの導入は、ＰｙｌＲＳ酵素活性を無効にはしない。好ましくは、ＰｙｌＲＳ酵素活性は基本的に同じレベルに維持される。すなわち、本発明のＰｙｌＲＳは、対応する野生型又は変異型ＰｙｌＲＳの酵素活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％を有する。

ＮＥＳは、ＮＥＳが動作するように本発明のＰｙｌＲＳまたは変異型ＰｙｌＲＳ内に適切に配置される。例えば、ＮＥＳは、野生型又は変異型古細菌ＰｙｌＲＳのＣ末端（例えば、最後のアミノ酸残基のＣ末端）又はＮ末端（例えば、アミノ酸残基１、Ｎ末端メチオニン、及びアミノ酸残基２の間）に結合することができる。

ＮＥＳの組み込みおよび／またはＮＬＳ配列の欠失によって改変された変異したＰｙｌＲＳを開示するＷＯ２０１８／０６９４８の開示は、本明細書中で明示的に参照され、参照により組み込まれる。

本発明のＰｙｌＲＳ変異体はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ（変異体）対で使用される。なお、ＰｙｌＲＳ変異体は、好ましくはＵＮＡＡ又はその塩で、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをアシル化することができる。

特に指示のない限り、本明細書で使用される「ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ」は、本発明のＰｙｌＲＳ変異体によって（本質的に選択的に、特に選択的に）アシル化できるｔＲＮＡを意味する。本発明の状況において、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、ピロリジンを用いてＰｙｌＲＳによってアシル化することができる野生型ｔＲＮＡ、又はそのｔＲＮＡの変異体、例えば古細菌由来の、例えばメタノサルキナ属（例えばＭ．ｍａｚｅｉ若しくはＭ．ｂａｒｋｅｒｉ）由来の、野生型もしくは変異型ｔＲＮＡであってもよい。ＵＮＡＡのＰＯＩへの部位特異的組み込みのために本発明のＰｙｌＲＳと共に使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンは、適切には、セレクターコドンの逆相補体である。特定の実施形態では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンはアンバー終止コドンの逆相補体である。例えば、プロテオーム標識化（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２（５）：４６５－４７２，２０１４）等の他の用途では、本発明のＰｙｌＲＳと共に使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンは、真核細胞の内因性ｔＲＮＡによって認識されるコドンであってもよい。

本明細書で使用される「セレクターコドン」という用語は、翻訳過程中にｔＲＮＡ^Ｐｙｌに認識される（すなわち結合する）コドンであって、真核細胞の内因性ｔＲＮＡには認識されないコドンを意味する。またこの用語は、例えばＤＮＡプラスミド等、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ではないポリヌクレオチドのポリペプチドをコードする配列中の対応するコドンにも使用される。好ましくは、セレクターコドンは、天然の真核細胞において少量のコドンである。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンは、ｍＲＮＡ中のセレクターコドンに結合し、そうしてＵＮＡＡを前記ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの成長鎖に部位特異的に組み込む。既知の６４個の遺伝的コドン（トリプレット）は、２０個のアミノ酸及び３個の終止コドンをコードする。翻訳の終結には終止コドン１個のみが必要なので、他の２個は原則として非タンパク質原性アミノ酸をコードするために使用できる。例えば、アンバーコドン、ＵＡＧは、非天然アミノ酸の取り込みを指示するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系において、セレクターコドンとしてうまく使用されいる。本発明の方法で利用されるセレクターコドンは、使用される翻訳系のタンパク質生合成機構の遺伝的コドンのフレームワークを拡張する。具体的には、セレクターコドンには、これらには限定されないが、終止コドン（例えばアンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）コドン）等のナンセンスコドン；３個を超える塩基から成るコドン（例えば、４塩基コドン）；並びに天然又は非天然の塩基対に由来するコドンが含まれる。所定の系について、セレクターコドンは天然の３塩基コドン（すなわち天然トリプレット）のうちの１つを含むこともできる。このとき内因性の翻訳系（例えば、該天然トリプレットを認識するｔＲＮＡを欠いている系又は該天然のトリプレットがレアコドンである系）は、前記天然トリプレットを使用しない（又は、ほとんど使用しない）。

所定の翻訳系（例えば、真核細胞）において、終止コドン、４塩基コドン又はレアコドン等を介して読めるように、ｍＲＮＡの読みを変更させる組換えｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡと呼ばれる。セレクターコドンとして働く終止コドン（例えばアンバーコドン）の抑制効率は、（アミノアシル化）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（サプレッサーｔＲＮＡとして作用する）と、終止コドンに結合してリボソームから成長するポリペプチド鎖の放出を開始する放出因子（例えばＲＦ１）との間の競合に依存する。したがって、終止コドンのそのような抑制効率は、放出因子－（例えば、ＲＦ１－）欠損株を用いて増加させることができる。

「目的のポリペプチド」又は「ＰＯＩ」をコードするポリヌクレオチド配列は、１つ以上、例えば２つ以上、３つ以上等のコドン（例えばセレクターコドン）を含むことができる。それらは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体である。ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列を生成するために、従来の部位特異的変異誘発を使用して、前記コドンをポリヌクレオチド配列の目的の部位に導入することができる。

本発明のＰｙｌＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌは直交性であることが好ましい。

本明細書で使用される「直交」という用語は、目的の翻訳系（例えば、本明細書に記載のＰＯＩの発現に使用される真核細胞）によって低い効率で使用される分子（例えば、直交ｔＲＮＡ及び／又は直交ＲＳ）を意味する。「直交」とは、不能又は効率の低下を意味する。例えば、目的の翻訳系の内因性ＲＳ又は内因性ｔＲＮＡとそれぞれ作用する直交ｔＲＮＡ又は直交ＲＳの効率が、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は例えば１％未満である。

したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の真核細胞の任意の内在性ＲＳは、内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアシル化と比較した場合、低い効率又はゼロの効率で（直交）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアシル化を触媒する。例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、又は１％未満の効率である。あるいは又はさらに、本発明の（直交）ＰｙｌＲＳは、細胞の内因性ＲＳによるｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアシル化と比較して、本発明の真核細胞の任意の内因性ｔＲＮＡを低い効率又はゼロの効率でアシル化する。例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、又は１％未満の効率である。

別段の指示がない限り、本明細書で使用される「内因性ｔＲＮＡ」及び「内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素」（「内因性ＲＳ」）という用語は、それぞれ本発明の状況で使用される本発明のＰｙｌＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌを導入する前に最終的に翻訳系として使用される細胞に存在するｔＲＮＡ及びＲＳをそれぞれ意味する。

用語「翻訳系」は、一般に、成長するポリペプチド鎖（タンパク質）中に天然アミノ酸を取り込むために必要な一組の構成要素を意味する。翻訳系の構成要素としては、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）、ｍＲＮＡ等を含むことができる。翻訳系は、前記構成要素、細胞抽出物及び生細胞（例えば、生きている真核細胞）の人工混合物を含む。

本発明に従ってＰＯＩを作製するために使用するＰｙｌＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌの対は、好ましくは、ＰＯＩを作製するために使用する真核細胞において、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが本発明のＰｙｌＲＳによってＵＮＡＡ又はその塩（ＵＮＡＡ）で選択的にアシル化されるという点で直交性である。適切には、前記真核細胞において、直交対は、前記細胞がＵＮＡＡアシル化ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを使用してＵＮＡＡ残基をＰＯＩの成長中のポリペプチド鎖に組み込むように機能する。組み込みは部位特異的方法で起こり、例えば、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、ＰＯＩをコードするｍＲＮＡ中のコドン（例えば、アンバー終止コドン等のセレクターコドン）を認識する。

本明細書で使用される場合、用語「選択的にアシル化される」は、真核細胞の内因性ｔＲＮＡ又はアミノ酸と比較して、ＰｙｌＲＳがｔＲＮＡ^ＰｙｌをＵＮＡＡでアシル化する効率が、例えば、約５０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、又は約９９％以上の効率を意味する。ＵＮＡＡはその後、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体である、特定のコドン（例えば、セレクターコドン）について、高い正確性（例えば約７５％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、又は約９９％以上の効率）で成長中のポリペプチド鎖に組み込まれまる。

本発明によるＰＯＩの作製に適したｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対は、変異型ｔＲＮＡ及びＰｙｌＲＳのライブラリから、例えばライブラリスクリーニングの結果に基づき選択することができる。そのような選択は、例えばＷＯ０２／０８５９２３及びＷＯ０２／０６０７５に記載のｔＲＮＡ／ＲＳ対を進化させる既知の方法と同様に実施できる。本発明のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対を生成するために、野生型又は（依然として）核局在化シグナルを含み、ＮＥＳを欠く変異型の古細菌ＰｙｌＲＳから開始し、適切なｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対を同定する前又は同定した後に、核局在化シグナルを除去し、及び／又は、ＮＥＳを導入することができる。

本明細書で使用される用語「非天然アミノ酸」（「ＵＮＡＡ」と略される）は、２０個の標準アミノ酸の１つ又はセレノシステイン又はピロリシンではないアミノ酸を意味する。またこの用語は、アミノ酸類似体を意味する。例えば、アミノ酸とは異なり、α－アミノ基がヒドロキシル基及び／又はカルボン酸官能基で置換され、エステルを形成する化合物である。ポリペプチドに翻訳的に組み込まれた場合、前記アミノ酸類似体は、２０個の標準アミノ酸又はセレノシステイン又はピロリジンに対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を生じる。翻訳系（真核細胞等）において、アミノ酸類似体であるＵＮＡＡ（カルボン酸官能基が式－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒのエステルを形成している）が、ポリペプチドの作製に使用される場合、Ｒは原位置で、例えば酵素的に、ＰＯＩに組み込まれる前の翻訳系において除去されると考えられる。したがって、Ｒは、ＵＮＡＡ又はその塩を本発明のＰｙｌＲＳによって認識及び処理される形態に変換する翻訳システムの能力と両立するように適切に選択される。

本発明の方法及びキットに有用なＵＮＡＡは、先行技術に記載されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１０；Ｌｅｍｋｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１６９１－１６９４，２０１４を参照のこと）。

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」または「形質転換細胞」という用語は、少なくとも１つの核酸分子、例えば、所望のタンパク質または核酸配列をコードする組換え遺伝子を保持するように改変された細胞（または生物）を指し、転写により、本明細書に記載のように使用するためのポリペプチドが得られる。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞などの原核細胞または真核細胞である。宿主細胞は、宿主細胞の核または細胞小器官ゲノムに組み込まれた組換え遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、宿主は染色体外に組換え遺伝子を含んでいてもよい。

特定の生物または細胞は、それが自然にＰＯＩを産生する場合、または自然には前記ＰＯＩを産生しないが、前記ＰＯＩを産生するように形質転換される場合、「ＰＯＩを産生することができる」ことを意味する。

本明細書で使用される「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物がその天然の状態で通常結合している他の異なる化合物を含まず、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象が、所定のサンプルの質量の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、もしくは２０重量％、または少なくとも５０重量％もしくは７５重量％を占める状態を指す。一実施形態において、これらの用語は、所定のサンプルを質量の少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または１００％含む本発明の化合物を指す。本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質に言及する場合の「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、例えば原核生物環境または真核生物環境、例えば細菌細胞もしくは真菌細胞または哺乳動物生物などの、特にヒトの体内で天然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態も指す。（１）他の関連する構造または化合物からの精製、または（２）前記原核生物環境または真核生物環境において通常関連しない構造または化合物との関連付けを含む、天然に生じる精製または濃縮の程度を超えるものは「単離された」の意味の範囲内である。本明細書に記載の核酸もしくはタンパク質、あるいは核酸もしくはタンパク質の種類は、当業者に公知の様々な方法およびプロセスに従って、単離することもできるし、あるいは自然界では通常結合しない構造もしくは化合物と結合させることもできる。

本明細書に提供される説明および添付の特許請求の範囲の文脈において、「または」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。

同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含有する（「ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ」）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は互いに置き換え可能であり、限定することを意図したものではない。

さらに、様々な実施形態の説明で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｉｎｇ）」という用語が使用される場合、当業者であれば、いくつかの具体例において、実施例は「本質的に～からなる」または「からなる」という用語を使用して代替的に実施形態を説明できることを理解するであろう。

用語「約」は、記載された値の±２５％、特に±１５％、±１０％、より具体的には±５％、±２％または±１％の潜在的変動を示す。

「実質的に」という用語は、約８０～１００％の値の範囲（例えば８５～９９．９％、特に９０～９９．９％、より特に９５～９９．９％、または９８～９９．９％、および特に９９～９９．９％など）を表す。

「主に」とは、５０％を超える範囲、例えば５１～１００％の範囲、特に７５～９９．９％の範囲、より特に８５～９８．５％、例えば９５～９９％の割合を指す。

本開示が、様々な程度の優先度の特徴、パラメータ、およびそれらの範囲（一般的な、明示的に好ましくない特徴、パラメータ、およびそれらの範囲を含む）に言及する場合、特に明記しない限り、そのような特徴、パラメータ、および範囲の２つ以上の任意の組み合わせは、それぞれの優先度に関係なく、本明細書の開示に包含される。

本明細書に記載される特定の酵素または酵素変異体について観察される「基質の利用のための改善された活性」という用語は、基準酵素、特に変異していない親酵素と比較して観察される利用の改善、または前記利用の改善を示す変異体に含まれる変異の数および／または種類に関して異なる酵素変異体と比較して観察される利用の改善を指す。利用率の変化を表すための好適な非限定的パラメータは、例えばモル％のように％で表される基質濃度の減少、または例えばモル％のように％で表される生成物濃度の増加である。この文脈において好ましい「基質」は、本明細書で言及されるＵＮＡＡである

Ｃ．本発明の特定の態様および実施形態
本発明は、以下の態様およびその特定の実施形態に関する：
本発明の第１態様は、改変された古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）に関し、この改変された古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）は、配列モチーフＭ１およびＭ３の組み合わせまたはセットを含み；特に、Ｍ１は前記改変された古細菌ＰｙｌＲのアミノ酸配列のＮ末端に近く、Ｍ３はＣ末端に近く；任意に、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６から選択される少なくとも１つのさらなる配列モチーフが組み合わされ、かつＰｙｌＲＳ活性を保持する；
ここで、
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６は、改変されたＰｙｌＲＳのアミノ酸配列内において前記順序で配置され、Ｍ１が、前記改変された古細菌ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列のＮ末端に最も近く、Ｍ６がＣ末端に最も近く、かつ以下の配列を含む（それぞれ、Ｎ末端→Ｃ末端の順序の順に示す）。

Ｍ１：ＬＲＰＭＸ_１ＡＸ_２Ｘ_３Ｌ（Ｙ／Ｍ）Ｘ_５Ｘ_６（Ｍ／Ｖ／Ｃ）Ｒ（配列番号１）
配列番号５６（すなわち、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ野生型）のアミノ酸残基２９７～３１０に類似する。

Ｍ２：ＨＬＸ_７ＥＦＴＭＸ_８ＮＸ_９（Ｇ／Ａ）Ｘ_１１Ｘ_１２Ｇ（配列番号２）
配列番号５６（すなわち、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ野生型）のアミノ酸残基３３８～３５１に類似する。

Ｍ３：ＶＹＸ_１３Ｘ_１４ＴＸ_１５Ｄ（配列番号３）
配列番号５６（すなわち、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ野生型）のアミノ酸残基３８３～３８９に類似する。

Ｍ４：ＳＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＧＰ（Ｒ／Ｉ／Ｎ）Ｘ_２０Ｘ_２１Ｄ（配列番号４）
配列番号５６（すなわち、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ野生型）のアミノ酸残基３９９～４０８に類似する。

Ｍ５：Ｘ_２２Ｘ_２３（Ｉ／Ｖ）Ｘ_２５Ｘ_２６ＰＷ（配列番号５）
配列番号５６（すなわち、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ野生型）のアミノ酸残基４１１～４１７に類似する。

Ｍ６：Ｇ（Ａ／Ｌ／Ｉ）ＧＦＧＬＥＲＬＬ（配列番号６）
配列番号５６（すなわち、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ野生型）のアミノ酸残基４１９～４２８に類似する（ここで、アミノ酸残基Ｘ_１～Ｘ_２６は、互いに独立して、天然アミノ酸残基から選択される）。

これらの保存モチーフＭ１～Ｍ６の各々は少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、酵素の基質ポケットの形成に関与すると想定される。

隣接する２つのモチーフを連結する各介在配列モチーフ、ならびにＮ末端配列およびＣ末端配列を形成する配列モチーフは、他の野生型または先行技術の古細菌ＰｙｌＲＳのそれぞれの配列部分に由来していてもよい。図４として添付した配列アラインメントによって示されるように、介在部分配列またはＮ末端部分配列もしくはＣ末端部分配列のそれぞれは、例えば配列番号５８、６０、６２、６４および６６などの他の古細菌ＰｙｌＲＳから容易に誘導することができるが、これらに限定されるものではない。このような配列アラインメント、または異なる古細菌起源の少なくとも１つのさらなるＰｙｌＲＳ配列による任意の類似のアラインメントの補足に基づき、このような保存性の低い部分は合成酵素活性に影響を及ぼさないか、または有意な影響を及ぼさないと考えられるので、それぞれのさらなる改変された配列モチーフを容易に導くことができる。

前記改変された古細菌ＰｙｌＲＳの特定の実施形態において、残基Ｘ_１～Ｘ_２６は、互いに独立して、以下の意味を有する：
Ｘ_１は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＬまたはＨを表し；
Ｘ_２は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＰまたはＭを表し；
Ｘ_３は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＮ、ＴまたはＶを表し；
Ｘ_５は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＮ、Ｓ、ＴまたはＹを表し；
Ｘ_６は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＬ、ＭまたはＷを表し；
Ｘ_７は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＥまたはＮを表し；
Ｘ_８は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＶまたはＬを表し；
Ｘ_９は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＦまたはＬを表し；
Ｘ_１１は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＱ、ＤまたはＥを表し；
Ｘ_１２は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＭまたはＬを表し；
Ｘ_１３は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＧ、ＫまたはＶを表し；
Ｘ_１４は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＤ、ＥまたはＮを表し；
Ｘ_１５は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＬ、ＩまたはＶを表し；
Ｘ_１６は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＡまたはＧを表し；
Ｘ_１７は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＡまたはＶを表し；
Ｘ_１８は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＶまたはＭを表し；
Ｘ_２０は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＰ、Ｓ、Ｙ、ＦまたはＶを表し；
Ｘ_２１は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＬまたはＭを表し；
Ｘ_２２は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＷまたはＨを表し；
Ｘ_２３は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＧ、ＤまたはＥを表し；
Ｘ_２５は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＤ、Ｈ、ＦまたはＮを表し；
Ｘ_２６は、天然アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基、特にＫ、ＥまたはＤを表す。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、配列モチーフＭ１、Ｍ３およびＭ２；またはＭ１、Ｍ３、Ｍ２およびＭ４；またはＭ１、Ｍ３、Ｍ２、Ｍ４およびＭ５；またはＭ１、Ｍ３、Ｍ２、Ｍ４およびＭ６；またはＭ１、Ｍ３、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６の組み合わせまたはセットを含む、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、このＰｙｌＲＳは、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ属、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ属、特にＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａの古細菌に由来する親ＰｙｌＲＳに由来する。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、このＰｙｌＲＳは、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ種（配列番号５６）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ種（配列番号５８）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ ａｒｃｈａｅｏｎ種（配列番号６０）、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓ種（配列番号６２）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ種（配列番号６４）およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ種（配列番号６６）、特にＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（配列番号５６）種の古細菌に由来する親ＰｙｌＲＳに由来する。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、このＰｙｌＲＳは、配列番号５６、５８、６０、６２、６４および６６から選択されるアミノ酸配列（特に配列番号５６）を有する親ＰｙｌＲＳ、またはその機能的変異体もしくはフラグメントに由来する。それは、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素活性を保持し、配列番号５６、５８、６０、６２、６４および６６から選択されるアミノ酸配列を有する天然ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素に対して、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの少なくとも６０％の配列同一性を有する。この改変された古細菌ＰｙｌＲＳは、改変された配列モチーフＭ１およびＭ３の組み合わせを含み；任意に、それぞれ上記で定義されたＭ２、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６から選択される少なくとも１つのさらなる配列モチーフと組み合わされる。

配列番号５６、５８、６０、６２、６４および６６から選択されるアミノ酸配列を有する親ＰｙｌＲＳの機能的変異体またはフラグメントは、例えば図４に示されているようなそれぞれの配列アラインメントから容易に誘導することができる。それは酵素機能にとって重要なＭ１からＭ６などの配列モチーフ、ならびに配列変化を比較的受けやすい中間または末端配列部分、およびその結果としての例えば保存的アミノ酸置換などの配列変異に関する情報を提供する。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、そこでは上記の各々のモチーフの組み合わせまたはセット内の他のモチーフから独立して、以下の通りとなる：
ａ）上記配列モチーフＭ１は、以下の配列から選択される：

ｂ）上記配列モチーフＭ２は、以下の配列から選択される：

ｃ）上記配列モチーフＭ３は、以下の配列から選択される：

ｄ）上記配列モチーフＭ４は、以下の配列から選択される：

ｅ）上記配列モチーフＭ５は、以下の配列から選択される：

ｆ）上記配列モチーフＭ６は、以下の配列から選択される：

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、そこでは以下の通りとなる：
ａ）上記配列モチーフＭ１は、以下の配列から選択される：

ｂ）上記配列モチーフＭ２は、以下の配列から選択される：

ｃ）上記配列モチーフＭ３は、以下の配列から選択される：

ｄ）上記配列モチーフＭ４は、以下の配列から選択される：

ｅ）上記配列モチーフＭ５は、以下の配列から選択される：

ｆ）上記配列モチーフＭ６は、以下の配列から選択される：

さらなる特定の実施形態によれば、以下の配列モチーフの組み合わせまたはセットが提供され、これらは以下の群（１）～（５）の１つから選択される：

（１）Ｍ１，Ｍ３およびＭ２：
Ｍ１ａ，Ｍ３ａおよびＭ２ａ；Ｍ１ｂ，Ｍ３ｂおよびＭ２ｂ；Ｍ１ｃ，Ｍ３ｃおよびＭ２ｃ；Ｍ１ｄ，Ｍ３ｄおよびＭ２ｄ；Ｍ１ｅ，Ｍ３ｅおよびＭ２ｅ；Ｍ１ｆ，Ｍ３ｆおよびＭ２ｆ；
Ｍ１ａ^＊，Ｍ３ａ^＊およびＭ２ａ^＊；Ｍ１ｂ^＊，Ｍ３ｂ^＊およびＭ２ｂ^＊；Ｍ１ｃ^＊，Ｍ３ｃ^＊およびＭ２ｃ^＊；Ｍ１ｄ^＊，Ｍ３ｄ^＊およびＭ２ｄ^＊；Ｍ１ｅ^＊，Ｍ３ｅ^＊およびＭ２ｅ^＊；Ｍ１^＊ｆ，Ｍ３ｆ^＊およびＭ２ｆ^＊；

（２）Ｍ１，Ｍ３，Ｍ２およびＭ４：
Ｍ１ａ，Ｍ３ａ，Ｍ２ａおよびＭ４ａ；Ｍ１ｂ，Ｍ３ｂ，Ｍ２ｂおよびＭ４ｂ；Ｍ１ｃ，Ｍ３ｃ，Ｍ２ｃおよびＭ４ｃ；Ｍ１ｄ，Ｍ３ｄ，Ｍ２ｄおよびＭ４ｄ；Ｍ１ｅ，Ｍ３ｅ，Ｍ２ｅおよびＭ４ｅ；Ｍ１ｆ，Ｍ３ｆ，Ｍ２ｆおよびＭ４ｆ；
Ｍ１ａ^＊，Ｍ３ａ^＊，Ｍ２ａ^＊およびＭ４ａ^＊；Ｍ１ｂ^＊，Ｍ３ｂ^＊，Ｍ２ｂ^＊およびＭ４ｂ^＊；Ｍ１ｃ^＊，Ｍ３ｃ^＊，Ｍ２ｃ^＊およびＭ４ｃ^＊；Ｍ１ｄ^＊，Ｍ３ｄ^＊，Ｍ２ｄ^＊およびＭ４ｄ^＊；Ｍ１ｅ^＊，Ｍ３ｅ^＊，Ｍ２ｅ^＊およびＭ４ｅ^＊；Ｍ１ｆ^＊，Ｍ３ｆ^＊，Ｍ２ｆ^＊およびＭ４ｆ^＊；

（３）Ｍ１，Ｍ３，Ｍ２，Ｍ４およびＭ５：
Ｍ１ａ，Ｍ３ａ，Ｍ２ａ，Ｍ４ａおよびＭ５ａ；Ｍ１ｂ，Ｍ３ｂ，Ｍ２ｂ，Ｍ４ｂおよびＭ５ｂ；Ｍ１ｃ，Ｍ３ｃ，Ｍ２ｃ，Ｍ４ｃおよびＭ５ｃ；Ｍ１ｄ，Ｍ３ｄ，Ｍ２ｄ，Ｍ４ｄおよびＭ５ｄ；Ｍ１ｅ，Ｍ３ｅ，Ｍ２ｅ，Ｍ４ｅおよびＭ５ｅ；Ｍ１ｆ，Ｍ３ｆ，Ｍ２ｆ，Ｍ４ｆおよびＭ５ｆ；
Ｍ１ａ^＊，Ｍ３ａ^＊，Ｍ２ａ^＊，Ｍ４ａ^＊およびＭ５ａ^＊；Ｍ１ｂ^＊，Ｍ３ｂ^＊，Ｍ２ｂ^＊，Ｍ４ｂ^＊およびＭ５ｂ^＊；Ｍ１ｃ^＊，Ｍ３ｃ^＊，Ｍ２ｃ^＊Ｍ４ｃ^＊およびＭ５ｃ^＊；Ｍ１ｄ^＊，Ｍ３ｄ^＊，Ｍ２ｄ^＊，Ｍ４ｄ^＊およびＭ５ｄ^＊；Ｍ１ｅ^＊，Ｍ３ｅ^＊，Ｍ２ｅ^＊，Ｍ４ｅ^＊およびＭ５ｅ^＊；Ｍ１ｆ^＊，Ｍ３ｆ^＊，Ｍ２ｆ^＊，Ｍ４ｆ^＊およびＭ５ｆ^＊；

（４）Ｍ１，Ｍ３，Ｍ２，Ｍ４およびＭ６：
Ｍ１ａ，Ｍ３ａ，Ｍ２ａ，Ｍ４ａおよびＭ６ａ；Ｍ１ｂ，Ｍ３ｂ，Ｍ２ｂ，Ｍ４ｂおよびＭ６ｂ；Ｍ１ｃ，Ｍ３ｃ，Ｍ２ｃ，Ｍ４ｃおよびＭ６ｃ；Ｍ１ｄ，Ｍ３ｄ，Ｍ２ｄ，Ｍ４ｄおよびＭ６ｄ；Ｍ１ｅ，Ｍ３ｅ，Ｍ２ｅ，Ｍ４ｅおよびＭ６ｅ；Ｍ１ｆ，Ｍ３ｆ，Ｍ２ｆ，Ｍ４ｆおよびＭ６ｆ；
Ｍ１ａ^＊，Ｍ３ａ^＊，Ｍ２ａ^＊，Ｍ４ａ^＊およびＭ６ａ^＊；Ｍ１ｂ^＊，Ｍ３ｂ^＊，Ｍ２ｂ^＊，Ｍ４ｂ^＊およびＭ６ｂ^＊；Ｍ１ｃ^＊，Ｍ３ｃ^＊，Ｍ２ｃ^＊，Ｍ４ｃ^＊およびＭ６ｃ^＊；Ｍ１ｄ^＊，Ｍ３ｄ^＊，Ｍ２ｄ^＊，Ｍ４ｄ^＊およびＭ６ｄ^＊；Ｍ１ｅ^＊，Ｍ３ｅ^＊，Ｍ２ｅ^＊，Ｍ４ｅ^＊およびＭ６ｅ^＊；Ｍ１ｆ^＊，Ｍ３ｆ^＊，Ｍ２ｆ^＊，Ｍ４ｆ^＊およびＭ６ｆ^＊；

（５）Ｍ１，Ｍ３，Ｍ２，Ｍ４，Ｍ５およびＭ６：
Ｍ１ａ，Ｍ３ａ，Ｍ２ａ，Ｍ４ａ，Ｍ５ａおよびＭ６ａ；Ｍ１ｂ，Ｍ３ｂ，Ｍ２ｂ，Ｍ４ｂ，Ｍ５ｂおよびＭ６ｂ；Ｍ１ｃ，Ｍ３ｃ，Ｍ２ｃ，Ｍ４ｃ，Ｍ５ｃおよびＭ６ｃ；Ｍ１ｄ，Ｍ３ｄ，Ｍ２ｄ，Ｍ４ｄ，Ｍ５ｄおよびＭ６ｄ；Ｍ１ｅ，Ｍ３ｅ，Ｍ２ｅ，Ｍ４ｅ，Ｍ５ｅおよびＭ６ｅ；Ｍ１ｆ，Ｍ３ｆ，Ｍ２ｆ，Ｍ４ｆ，Ｍ５ｆおよびＭ６ｆ；
Ｍ１ａ^＊，Ｍ３ａ^＊，Ｍ２ａ^＊，Ｍ４ａ^＊，Ｍ５ａ^＊およびＭ６ａ^＊；Ｍ１ｂ^＊，Ｍ３ｂ^＊，Ｍ２ｂ^＊，Ｍ４ｂ^＊，Ｍ５ｂ^＊およびＭ６ｂ^＊；Ｍ１ｃ^＊，Ｍ３ｃ^＊，Ｍ２ｃ^＊，Ｍ４ｃ^＊，Ｍ５ｃ^＊およびＭ６ｃ^＊；Ｍ１ｄ^＊，Ｍ３ｄ^＊，Ｍ２ｄ^＊，Ｍ４ｄ^＊，Ｍ５ｄ^＊およびＭ６ｄ^＊；Ｍ１ｅ^＊，Ｍ３ｅ^＊，Ｍ２ｅ^＊，Ｍ４ｅ^＊，Ｍ５ｅ^＊およびＭ６ｅ^＊；Ｍ１ｆ^＊，Ｍ３ｆ^＊，Ｍ２ｆ^＊，Ｍ４ｆ^＊，Ｍ５ｆ^＊およびＭ６ｆ^＊；

前記第１態様のさらなる特定の実施形態では、配列モチーフＭ１ａ、Ｍ２ａ、Ｍ３ａ、Ｍ４ａ、Ｍ５ａおよびＭ６ａの組み合わせを含む改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される。前記タイプのＰｙｌＲＳ変異体の非限定的な例は、ＰｙｌＲＳ Ａ１（配列番号７０）である。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態では、配列モチーフＭ１ａ^＊、Ｍ２ａ^＊、Ｍ３ａ、Ｍ４ａ^＊、Ｍ５ａおよびＭ６ａの組み合わせを含む改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される。前記タイプのＰｙｌＲＳ変異体の非限定的な例は、ＰｙｌＲＳ ＭＭＡ（配列番号７２）である。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、これは以下の通りである：

ａ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ａ１；または配列番号７０に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；あるいは、
ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ ＭＭＡ；または配列番号７２に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；あるいは、
ｃ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｂ１１；または配列番号８２に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；
ｄ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｃ１１；または配列番号８４に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；
ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｇ３；または配列番号８６に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；
ｆ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｈ１２；または配列番号８８に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する。

前記第１態様のさらなる特定の実施態様において、ＰｙｌＲＳ活性を保持する機能的融合タンパク質であって、ＰｙｌＲＳ活性を有する少なくとも１つの第１タンパク質部分と、第１タンパク質に共有結合した同一または異なる機能性を有する第２タンパク質部分を含む、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態では、以下の機能的特徴の少なくとも１つを示す改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される：
ａ）非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）またはその塩に対する改変された基質プロファイル。
ｂ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ（配列番号６８）とそれぞれ比較して、特にＴＣＯ－Ｅ、ＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃまたはその塩から選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用。
ｃ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１（配列番号１０８）とそれぞれ比較して、特にＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃまたはその塩から選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用。

前記第１態様のさらに特定の実施形態では、以下の機能的特徴の少なくとも１つを示す改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される。
ａ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ（配列番号６８）とそれぞれ比較して、ＴＣＯ－Ｅ、ＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃまたはその塩から選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用。
ｂ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１（配列番号１０８）とそれぞれ比較して、ＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃまたはその塩から選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用。

このような要件を満たすＰｙｌＲＳ変異体の非限定的な例として、ＰｙｌＲＳ Ａ１（配列番号７０）を挙げることができる。

前記第１態様のさらに特定の実施形態では、少なくとも以下の機能的特徴を示す改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される：
変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ（配列番号１０８）と比較して、嵩高いｎｃＡＡのＴＣＯ－Ｅまたはその塩の改善された利用。

このような要件を満たすＰｙｌＲＳ変異体の非限定的な例として、ＰｙｌＲＳ ＭＭＡ（配列番号７２）を挙げることができる。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態では、核外搬出シグナル（ＮＥＳ）をさらに含む改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供される。ＮＥＳシグナル配列は、本明細書で上記したようによく知られている。このような既知の配列の各々は、前記配列を本発明のＰｙｌＲＳ変異体配列と組み合わせるための候補として考えられる。ＮＥＳは、ＰｙｌＲＳ活性に悪影響を及ぼさない限り、ＰｙｌＲＳ配列のＮ末端またはＣ末端の任意の配列位置に挿入または付加することができる。「Ｎ末端またはＣ末端に付加する」とは、ＮＥＳがＰｙｌＲＳ変異体配列の最初のアミノ酸または最後のアミノ酸に付加されてもよいし、酵素Ｎ末端またはＣ末端のそれぞれの末端アミノ酸残基３０、２０、１０または５に対応する配列部分の任意の配列位置に挿入されてもよいことを意味する。

特に、前記ＮＥＳは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、これは、特に酵素のＮ末端に付加される。

本発明のＮＥＳ修飾ＰｙｌＲＳ変異体の非限定的な例は、配列番号７８、８０、９０、９２、９４および９６から選択されるアミノ酸配列；または配列番号７８、８０、９０、９２、９４および９６に対してそれぞれ少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記ＮＥＳモチーフを保持する。

前記第１態様のさらなる特定の実施形態において、改変された古細菌ＰｙｌＲＳが提供され、これは以下のものである：
ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＮＥＳ ＰｙｌＲＳ Ａ１；または配列番号７０に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；あるいは、
ｂ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＮＥＳ ＰｙｌＲＳ ＭＭＡ；または配列番号７２に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；あるいは、
ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＮＥＳ ＰｙｌＲＳ Ｂ１１；または配列番号８２に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；
ｄ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＥＳ ＰｙｌＲＳ Ｃ１１；または配列番号８４に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；
ｅ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＮＥＳ ＰｙｌＲＳ Ｇ３；または配列番号８６に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する；
ｆ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＮＥＳ ＰｙｌＲＳ Ｈ１２；または配列番号８８に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；好ましくは、上記表２に示されるアミノ酸残基のそれぞれのパターンを保持する。

本発明の第２態様は、前記第１態様に従って上記で定義した改変された古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素または機能的フラグメントの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列；ならびに対応する相補的ポリヌクレオチド；ならびに上記ポリヌクレオチドのいずれかと本明細書で定義したストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそれらのフラグメントを含む、改変された、特に組換えポリヌクレオチドまたは核酸に関する。

コードポリヌクレオチドの特に非限定的な例は、配列番号６９、７１、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３および９５から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号６９、７１、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３および９５から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、依然として本発明の機能的ＰｙｌＲＳ変異体をコードする。

さらなる例として、配列番号７～５３による上記のモチーフのいずれかをコードする核酸配列、またはそのモチーフの少なくとも１つを含むＰｙｌＲＳ変異体をコードする核酸配列、またはより具体的には、上記に開示したそのモチーフの組み合わせを挙げることができる。

特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（配列番号１１３、場合により末端ＣＣＡトリプレットを含まない）をさらにコードし、当該ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、上記で定義したように、コードされる本発明の前記ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素変異体によってアシル化されうるｔＲＮＡである。

前記第２態様のさらなる特定の実施形態では、本発明の前記ＰｙｌＲＳ変異体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの組み合わせが提供される。

さらなる特定の実施形態では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンは、終止コドン、４塩基コドンおよびレアコドンから選択されるコドンの逆相補体である。

本発明のポリヌクレオチド、ならびに本発明の文脈において使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌおよび／またはＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、発現カセットなどの発現系である。

本発明はまた、真核細胞をトランスフェクトし、コードされたＰｙｌＲＳ変異体、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌおよび／またはＰＯＩをそれぞれ前記細胞中で発現させるのに適したベクターも提供する。

特にそのようなベクターは、上記で定義した組換え発現系を含む発現ベクター；または上記核酸の１つまたはその逆相補体である；あるいは、

本発明の発現ベクターは、原核生物ベクター、ウイルスベクター、真核生物ベクター、またはプラスミドである。

本発明の第３態様は、以下を含む真核細胞に関する：
（ａ）上記第１態様のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素変異体の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド配列、および
（ｂ）（ａ）の配列によってコードされるピロリジルｔＲＮＡ合成酵素変異体によってアシル化されうるｔＲＮＡ、またはそのようなｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列。

特に、前記真核細胞は哺乳動物細胞である。

本発明は特に、本発明のＰｙｌＲＳ変異体を発現することができる哺乳動物細胞を提供する。特に、本発明は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを含む哺乳動物細胞であって、前記ポリヌクレオチドが本発明のＰｙｌＲＳ変異体およびｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードし、ｔＲＮＡ^ＰｙｌがＰｙｌＲＳによってアシル化（好ましくは選択的に）されうるｔＲＮＡである、哺乳動物細胞を提供する。好都合には、本発明の哺乳動物細胞はｔＲＮＡ^Ｐｙｌと本発明のＰｙｌＲＳ変異体の両方を発現することができ、ここでＰｙｌＲＳ変異体はｔＲＮＡ^Ｐｙｌをアミノ酸、例えばＵＮＡＡで（好ましくは選択的に）アシル化することができる。

本発明の第４態様は、１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むＰＯＩを調製するための方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）以下を含む真核細胞を提供する工程
（ｉ）上記第１態様のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素変異体；
（ｉｉ）ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）；
（ｉｉｉ）非天然アミノ酸またはその塩；および
（ｉｖ）ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドであって、非天然アミノ酸残基によって占有されるＰＯＩの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体であるコドンによってコードされる、ポリヌクレオチド；
ここで、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素変異体（ｉ）は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ｉｉ）を非天然アミノ酸または塩（ｉｉｉ）でアシル化することができる；ならびに、
（ｂ）真核細胞によるポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能にし、それによってＰＯＩを産生する工程。

本発明の第５態様は、以下を含むポリペプチド結合体の調製方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）第４態様による方法を使用して、１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むＰＯＩを調製する工程；および
（ｂ）結合相手分子がＰＯＩの非天然アミノ酸残基に共有結合するように、ＰＯＩを１つ以上の結合相手分子と反応させる工程。

特定の実施形態において、そのアミノ酸配列に少なくとも１つのｎｃＡＡが組み込まれた本発明のＰＯＩは、「標的化剤」を形成するために利用される。

この標的化剤の第一の目的は、特定の「標的」との共有結合または非共有結合の形成である。標的化剤の第二の目的は、「ペイロード分子（ｐａｙｌｏａｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」の前記標的への標的化された輸送である。前記第二の目的を達成するために、ＰＯＩは少なくとも一つのペイロード分子と（可逆的または不可逆的に）結合しなければならない。この目的のために、前記ＰＯＩは、前記少なくとも１つのｎｃＡＡを導入することによって官能化されなければならない。前記少なくとも１つのｎｃＡＡを有する官能化ＰＯＩは、その後、前記ｎｃＡＡ残基を介したバイオ結合により、前記少なくとも１つのペイロード分子に連結されうる。前記ｎｃＡＡはペイロード分子と反応性を有し、そしてペイロード分子はＰＯＩの前記ｎｃＡＡ残基と反応性を有する対応する部位を保有する。こうして得られたバイオ結合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、すなわち標的化剤は、ペイロード分子を意図する標的に移動させる。

これに限定されるものではないが、ＰＯＩに組み込むｎｃＡＡの特定の例は、本明細書で言及する嵩高いｎｃＡＡである。より詳細には、そのような残基は、ＴＣＯ^＊Ａ、ＴＣＯ－Ｅ、Ｂｏｃ、およびＳＣＯ^＊またはそれらの塩である。このようなｎｃＡＡとのバイオ結合に適したＰＯＩの適切な種類、潜在的標的、潜在的ペイロードおよび潜在的反応基の特定の非限定的な例を以下に記載する。

特に、ＰＯＩは免疫グロブリン、特に抗体分子、より具体的にはモノクローナル抗体またはその機能的抗原結合誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）もしくはフラグメントであり、そのアミノ酸配列中に少なくとも１つのｎｃＡＡを有する。

別の特定の実施形態では、前記標的は腫瘍関連標的であり、ペイロード分子は抗腫瘍剤である。

本発明の第６態様は、本明細書に記載されるＵＮＡＡ残基含有ＰＯＩまたはその結合体を調製する方法に使用できるキットに関する。

このようなキットは、少なくとも１つの非天然アミノ酸、またはその塩；および／または本発明の第２態様に従って上記で定義されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ、または本発明の第３態様に従った真核細胞を含むことができる。ここでコードされた古細菌ＰｙｌＲＳは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを非天然アミノ酸またはその塩でアシル化することができる。

例えば、そのキットは、本発明のＰｙｌＲＳ変異体をコードするポリヌクレオチドまたはそのＰｙｌＲＳを発現することができる真核細胞を含み、さらに、前記ＰｙｌＲＳによって触媒される反応においてｔＲＮＡをアシル化するために使用できる少なくとも１つの非天然アミノ酸またはその塩を含む。

本明細書で言及する本発明のＰｙｌＲＳの特定のアミノ酸配列を以下に示す。

本発明のＰｙｌＲＳ変異体の配列の特定の例：
ＮＥＳ配列は二重下線で示す。
変異は太字と下線で示す；野生型配列（配列番号５６）に対する変異位置の番号付与。

本発明の特定のＰｙｌＲＳ変異体は、Ｍ．ｍａｚｅｉ野生型ＰｙｌＲＳ、またはその酵素学的に活性なフラグメントから誘導可能である。

野生型Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列は配列番号５６に記載されている。

以下のＰｙｌＲＳ変異体の配列では、ＮＥＳ配列は二重の下線で示す。変異アミノ酸残基は太字と下線で示す。

Ｄ．追加の実施形態
１．本発明のポリペプチド
この文脈において、以下の定義が適用される：
本明細書に記載されるポリペプチドの「機能的変異体」には、以下に定義される当該ポリペプチドの「機能的等価体」が含まれる。

本明細書に記載される「酵素」「タンパク質」または「ポリペプチド」は、天然または組み換えによって産生された酵素、タンパク質またはポリペプチドであってもよく、それは野生型の酵素、タンパク質もしくはポリペプチドであってもよいし、適切な変異によって、またはＨｉｓ－タグを含む配列のようなＣ末端および／またはＮ末端のアミノ酸配列の延長によって、遺伝的に修飾されていてもよい。酵素、タンパク質またはポリペプチドは、基本的に細胞性、例えばタンパク質の不純物と混合することができるが、特に純粋な形である。適切な検出方法は、例えば以下の実験セクションに記載されているか、または文献から知られている。

「純粋な形の」または「純粋な」もしくは「実質的に純粋な」酵素、タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質を検出する通常の方法（例えばビウレット法またはＬｏｗｒｙらによるタンパク質検出）によって測定され、本発明に従って、全タンパク質含量に対して８０を超える、特に９０を超える、特に９５を超える、および極めて特別に９９ｗｔ％を超える純度を有する酵素、タンパク質またはポリペプチドとして理解される（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）の記載を参照）。

「タンパク質原性」アミノ酸は、特に以下を含む（１文字コード）：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ。

「ポリペプチド」または「ペプチド」という一般的な用語は、互換的に使用されることがあり、約１０から最大１，０００残基を含む連続したペプチド結合したアミノ酸残基の天然または合成の直鎖または配列を指す。３０残基までの短い鎖のポリペプチドは「オリゴペプチド」とも呼ばれる。

「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチドからなる高分子構造を指す。ポリペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質の「一次構造」を表す。アミノ酸配列はまた、ポリペプチド鎖内に形成されるαヘリックス構造やβシート構造などの特殊な構造要素の形成によって、タンパク質の「二次構造」をあらかじめ決定する。このような複数の二次構造要素の配置が、タンパク質の「三次構造」または空間配置を定義する。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、前記鎖は空間的に配置され、タンパク質の「四次構造」を形成する。タンパク質の正しい空間的配置または「折り畳み」は、タンパク質の機能の前提条件である。変性またはアンフォールディングはタンパク質の機能を破壊する。このような破壊が可逆的であれば、タンパク質の機能は再折り畳みによって回復する可能性がある。

本明細書で言及される典型的なタンパク質機能は「酵素機能」である。すなわち、タンパク質は基質、例えば化合物に対して生体触媒として作用し、前記基質の生成物への変換を触媒する。酵素は、基質特異性および／または生成物特異性が高くても低くてもよい。

したがって、特定の「活性」を有するとして本明細書で言及される「ポリペプチド」は、例えば特定の酵素活性などの示された活性を示す正しく折り畳まれたタンパク質を暗黙的に指す。

したがって、特に断りのない限り、「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」および「酵素」という用語も含む。

同様に、「ポリペプチドフラグメント」という用語は、「タンパク質フラグメント」および「酵素フラグメント」という用語を含む。

「単離されたポリペプチド」という用語は、当技術分野で公知の任意の方法または方法の組み合わせによって自然環境から除去されたアミノ酸配列を指し、組換え法、生化学的方法、合成法が含まれる。

本発明はまた、本明細書に具体的に記載されるポリペプチドの「機能的等価体」（「類似体（アナログ）」または「機能的変異体」とも称される）に関する。

例えば、「機能的等価体」とは、酵素的ＮＨａｓｅ活性を決定するために使用される試験において、本明細書に具体的に記載されるポリペプチドの活性と比べて、少なくとも１～１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％高いまたは低い活性を示すポリペプチドを指す。

本発明によれば「機能的等価体」は、本明細書に記載されたアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において具体的に記載されたものとは異なるアミノ酸を有するが、それにもかかわらず、例えば酵素活性などの前述の生物学的活性の１つを有する特定の変異体も包含する。したがって「機能的等価体」は、１個以上、例えば１～２０個、特に１～１５個または５～１０個のアミノ酸の付加、置換、特に保存的置換、欠失および／または逆位によって得られる変異体を含み、この記載された変化は、本発明による特性プロファイルを有する変異体をもたらすことを条件に、任意の配列位置で起こりうる。機能的等価性は、特に、活性パターンが変異体と未変化のポリペプチドとの間で定性的に一致する場合、すなわち、例えば、同じアゴニストまたはアンタゴニストまたは基質との相互作用が、しかしながら異なる速度で観察される場合（すなわち、ＥＣ_５０値またはＩＣ_５０値または現在の技術分野で好適な任意の他のパラメータによって表される場合）にも提供される。適切な（保存的な）アミノ酸置換の例を以下の表３に示す：

上記の意味での「機能的等価体」はまた、本明細書に記載のポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」である。

その場合、「前駆体」は、所望の生物学的活性を有するかまたは有さないポリペプチドの天然または合成前駆体である。

「塩」という表現は、カルボキシル基の塩および本発明によるタンパク質分子のアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は、公知の方法で製造することができ、無機塩、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩および亜鉛塩、ならびに有機塩基、例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンとの塩を含む。酸付加塩、例えば塩酸または硫酸等の無機酸との塩、酢酸またはシュウ酸等の有機酸との塩も本発明の対象である。

本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、公知の技術を使用して、機能性アミノ酸側基またはそのＮ末端もしくはＣ末端で製造することができる。このような誘導体は、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応により得られるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応により生成される遊離アミノ基のＮ－アシル誘導体；またはアシル基との反応により生成される遊離ヒドロキシル基のＯ－アシル誘導体を含む。

「機能的等価体」には、天然変異体と同様に、他の生物から得ることができるポリペプチドも当然に含まれる。例えば、相同配列領域の領域は配列比較によって確立することができ、等価ポリペプチドは本発明の具体的なパラメータに基づいて決定することができる。

「機能的等価体」はまた、本発明によるポリペプチドの個々のドメインまたは配列モチーフ等の「フラグメント」、または所望の生物学的機能を示しても示さなくてもよいＮ末端およびＣ末端切断型を含む。特に、このような「フラグメント」は、所望の生物学的機能を少なくとも定性的に保持する。

さらに「機能的等価体」は、本明細書中に記載されるポリペプチド配列の１つ、またはそれに由来する機能的等価体と、機能的Ｎ末端またはＣ末端結合における（すなわち、融合タンパク質部分の相互機能を実質的に損なうことなく）少なくとも１つのさらなる、機能的に異なる、異種配列を有する融合タンパク質である。これらの異種配列の非限定的な例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。

本発明に従って含まれる「機能的等価体」は、具体的に開示されたポリペプチドに対するホモログである。これらは具体的に開示されたアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも５０、５５％、または６０％、特に少なくとも７５％、より特に少なくとも８０または８５％、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の相同性（または同一性）を有し、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（８），１９８８，２４４４－２４４８）のアルゴリズムにより算出される。本発明による相同ポリペプチドの、百分率で表される相同性または同一性は、特に、本明細書に具体的に記載されるアミノ酸配列の１つの全長に基づくアミノ酸残基の百分率で表される同一性を意味する。

百分率で表される同一性データは、ＢＬＡＳＴアライメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）を利用して、または本明細書で以下に規定されるＣｌｕｓｔａｌ設定を適用することによっても決定することができる。

タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、本発明による「機能的等価体」は、脱グリコシル化形態またはグリコシル化形態の本明細書に記載のポリペプチド、ならびにグリコシル化パターンを変化させることによって得ることができる改変された形態を含む。

本発明によるポリペプチドの機能的等価体またはホモログは、変異誘発、例えば点変異、タンパク質の長鎖化もしくは短鎖化によって、または以下にさらに詳細に記載するように、産生することができる。

本発明によるポリペプチドの機能的等価体またはホモログは、変異体の組み合わせのデータベース、例えば短縮変異体をスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、タンパク質の変異体の多様なデータベースは、核酸レベルでの組み合わせの変異誘発、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素ライゲーションによって作成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ホモログのデータベースを作成するために使用できる方法は非常に多い。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、合成遺伝子はその後、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。縮重ゲノムを使用することにより、所望の潜在的タンパク質配列のセットをコードする混合物中のすべての配列を供給することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に周知である。

先行技術において、点変異または短縮によって作られた組み合わせのデータベースの遺伝子産物のスクリーニングのための、および選択された特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための、いくつかの技術が知られている。これらの技術は、本発明によるホモログの組み合わせの変異誘発によって産生された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適応することができる。ハイスループット解析に基づく大規模な遺伝子バンクのスクリーニングに最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクターにおける遺伝子バンクのクローニング、得られたベクターデータベースを用いた適切な細胞の形質転換、および所望の活性が検出されるとその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下での組み合わせ遺伝子の発現を含む。再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）は、データベース内の機能的変異体の頻度を高める技術であり、ホモログを同定するためにスクリーニング試験と組み合わせて使用できる。

本発明のポリペプチドは、本発明の酵素の活性部分配列、例えば、触媒ドメインまたは活性部位を含む全ての活性形態を含む。１つの態様において、本発明は、以下に規定される触媒ドメインまたは活性部位を提供する。１つの態様において、本発明は、例えばＰｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｈｍｍｓｅａｒｃｈ．ｓｈｔｍｌ）または同等のデータベースの使用により予測される活性部位ドメインを含むか、またはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドを提供する。Ｐｆａｍは、多くの一般的なタンパク質ファミリーをカバーする多重配列アラインメントと隠れマルコフモデルの大規模なコレクションである。［Ｐｆａｍタンパク質ファミリーのデータベース（Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，Ｅ．Ｂｉｒｎｅｙ，Ｌ．Ｃｅｒｒｕｔｉ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｌ．Ｅｔｗｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｌ．Ｈｏｗｅ，Ｍ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ａｎｄ Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１）：２７６－２８０，２００２）］同等のデータベースは、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏおよびＳＭＡＲＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ，ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）である。

本発明はまた、所望の活性を有する「ポリペプチド変異体」を包含する。この変異型のポリペプチドは、特定の配列番号によって参照される特定の、特に天然のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、前記配列番号に対して少なくとも１つの置換修飾を含むアミノ酸配列から選択される。

２．核酸と構築物
２．１ 核酸
この文脈において、以下の定義が適用される：
「核酸配列」、「核酸」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの配列という意味で互換的に使用される。核酸配列は、任意の長さの一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであってよく、遺伝子のコード配列および非コード配列、エクソン、イントロン、センスおよびアンチセンスの相補配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、組換え核酸配列、単離され精製された天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、フラグメント、プライマーおよび核酸プローブを含む。当業者は、ＲＮＡの核酸配列はＤＮＡ配列と同一であるが、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置き換えられているという違いがあることを認識している。「ヌクレオチド配列」という用語はまた、別個のフラグメントの形態で、またはより大きな核酸の成分として、ポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含むものとして理解されるべきである。

「単離された核酸」または「単離された核酸配列」は、核酸または核酸配列が天然に存在する環境とは異なる環境にある核酸または核酸配列に関し、汚染する内因性物質を実質的に含まないものを包含することができる。

核酸に適用される本明細書で使用する「天然」という用語は、自然界の生物の細胞内に見出され、実験室でヒトによって意図的に改変されていない核酸を指す。

ポリヌクレオチドまたは核酸配列の「フラグメント」は、本明細書における実施形態のポリヌクレオチドの、特に少なくとも１５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐおよび／または少なくとも６０ｂｐの長さの連続ヌクレオチドを指す。特に、ポリヌクレオチドのフラグメントは、本明細書における実施形態のポリヌクレオチドの少なくとも２５個、より特に少なくとも５０個、より特に少なくとも７５個、より特に少なくとも１００個、より特に少なくとも１５０個、より特に少なくとも２００個、より特に少なくとも３００個、より特に少なくとも４００個、より特に少なくとも５００個、より特に少なくとも６００個、より特に少なくとも７００個、より特に少なくとも８００個、より特に少なくとも９００個、より特に少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドを含む。限定されるものではないが、本明細書のポリヌクレオチドのフラグメントは、ＰＣＲプライマーとして、および／またはプローブとして、あるいはアンチセンス遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉのために使用することができる。

本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」または特定の条件下でハイブリダイズするという用語は、互いに有意に同一または相同なヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。その条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％同一である配列が、互いに結合したままとすることができる。低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義を以下に示す。適切なハイブリダイゼーション条件も、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２，４，ａｎｄ ６）に例示されているように、当業者であれば最小限の実験で選択することができる。さらに、ストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ｃｈａｐｔｅｒｓ ７，９，ａｎｄ １１）に記載されている。

「組換え核酸配列」とは、実験室的手法（例えば、分子クローニング）を用いて、複数の供給源から遺伝物質を集め、天然には存在せず、生物学的生物には存在しない核酸配列を作成または改変することによって生じる核酸配列のことである。

「組換えＤＮＡ技術」とは、例えば「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｓ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｉｇｅｌ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，２００２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ」および「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ」に記載されている組換え核酸配列を調製する分子生物学的手順をいう。

「遺伝子」という用語は、細胞内でＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡに転写され、適切な調節領域、例えばプロモーターに作動可能に連結された領域を含むＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのコード領域、イントロン、エクソン、および／または例えば転写終結部位を含む３’非翻訳配列など、いくつかの作動可能に連結された配列を含むことができる。

「ポリシストロン性」は、同じ核酸分子内で複数のポリペプチドを別々にコードすることができる核酸分子、特にｍＲＮＡをいう。

「キメラ遺伝子」とは、ある種において自然界では通常見られない任意の遺伝子、特に、自然界では互いに関連しない核酸配列の１つ以上の部分が存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは転写領域の一部または全部、あるいは別の調節領域と自然界では関連していない。「キメラ遺伝子」という用語は、プロモーターまたは転写調節配列が、１つ以上のコード配列、またはアンチセンス、すなわちセンス鎖の逆相補体、または逆反復配列（センスおよびアンチセンス、これによりＲＮＡ転写物は転写時に二本鎖ＲＮＡを形成する）に作動可能に連結された発現構築物を含むと理解される。「キメラ遺伝子」という用語には、新規遺伝子を産生するために１つ以上のコード配列の一部を組み合わせて得られた遺伝子も含まれる。

「３’ＵＴＲ」または「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」または「３’末端」とも呼ばれる）は、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を指し、例えば、転写終結部位と（すべてではないがほとんどの真核生物のｍＲＮＡで）ＡＡＵＡＡＡまたはその変異体などのポリアデニル化シグナルを含む。転写終結後、ｍＲＮＡ転写物はポリアデニル化シグナルの下流で切断され、細胞質などの翻訳部位へのｍＲＮＡの輸送に関与するポリ（Ａ）テールが付加されることがある。

「プライマー」という用語は、鋳型核酸配列にハイブリダイズし、鋳型に相補的な核酸配列の重合に使用される短い核酸配列を指す。

「選択可能マーカー」という用語は、発現時に選択可能マーカーを含む細胞を選択するために使用されうる任意の遺伝子を指す。選択可能マーカーの例を以下に示す。当業者は、様々な抗生物質、殺菌剤、栄養補助剤または除草剤選択可能マーカーが様々な標的種に適用可能であることを知るであろう。

本発明はまた、本明細書において定義されるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。

特に、本発明はまた、例えば人工ヌクレオチドアナログを用いて得ることができる、上記のポリペプチドの１つおよびそれらの機能的等価体をコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ）に関する。

本発明は、本発明によるポリペプチドまたはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離された核酸分子、および本発明によるコード核酸を同定または増幅するための例えばハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸フラグメントの両方に関する。

本発明はまた、本明細書中に具体的に開示される配列に対してある程度の「同一性」を有する核酸に関する。２つの核酸間の「同一性」とは、いずれの場合も核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味する。

２つのヌクレオチド配列（ペプチド配列またはアミノ酸配列も同様）間の「同一性」はヌクレオチド残基の数、またはこれらの２つの配列のアラインメントを作成したときに２つの配列で同一であるヌクレオチド残基（またはアミノ酸残基）の数の関数である。同一残基は、アラインメントの所定の位置において２つの配列で同一である残基として定義される。本明細書で使用する配列同一性の百分率は、２つの配列間で同一の残基の数を取得し、それを最短配列の残基の総数で割って１００を乗じることにより、最適アラインメントから計算される。最適アラインメントは、同一性の百分率が可能な限り高いアラインメントである。最適なアラインメントを得るために、アラインメントの１つ以上の位置で、一方または両方の配列にギャップが導入されることがある。これらのギャップは、配列同一性の百分率を計算する際に、非同一残基として考慮される。アミノ酸配列または核酸配列の同一性の百分率を決定する目的のためのアラインメントは、コンピュータプログラム、例えばワールドワイドウェブで利用可能な一般に利用可能なコンピュータプログラムなどを用いて様々な方法で達成することができる。

特に、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ）から入手可能な、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴプログラム（Ｔａｔｉａｎａ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１９９９，１７４：２４７－２５０，１９９９）を使用して、タンパク質または核酸配列の最適なアラインメントを取得し、配列同一性の百分率を計算することができる。

別の例では、同一性は、Ｉｎｆｏｒｍａｘ社（米国）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１プログラムにより、以下の設定でＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｓｈａｒｐ ＰＭ．（１９８９））を用いて計算することができる：

あるいは、Ｃｈｅｎｎａら（２００３）のウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃と下記設定に従って、同一性を判断することができる。

本明細書中に記載のすべての核酸配列（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）は、ヌクレオチド構築ブロックからの化学合成によって、例えば二重らせんの個別のオーバーラップする相補的核酸構築ブロックのフラグメント縮合によって公知の方法で製造することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，第２版，Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第８９６－８９７頁）によって公知の方法で実施することができる。ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント及びライゲーション反応並びに一般的クローニング技術を用いる合成オリゴヌクレオチドの蓄積及びギャップの穴埋めは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（下記参照）に記載されている。

本発明による核酸分子は、さらにコード遺伝子領域の３’及び／又は５’末端由来の非翻訳配列を含むことができる。

本発明はさらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列又はそのセグメントに相補的な核酸分子に関する。

本発明によるヌクレオチド配列は、他の細胞型及び生物中の相同配列の同定及び／又はクローニングに使用できるプローブ及びプライマーの製造を可能にする。そのようなプローブ又はプライマーは、通常、本発明による核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２、特に少なくとも約２５、例えば約４０、５０又は７５個の連続するヌクレオチドに対して、「ストリンジェントな」条件下（本明細書では別の場所で定義する）でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。

「相同な」配列には、オルソログ又はパラロガス配列が含まれる。系統学的方法、配列類似性及びハイブリダイゼーション方法を含むオルソログ又はパラログを同定する方法は、当技術分野で知られており、本明細書に記載される。

「パラログ」は、類似の配列と類似の機能を持つ２つ以上の遺伝子を生じさせる遺伝子重複から生じる。パラログは通常、近縁の植物種内の遺伝子の重複によって形成され、集団で存在する。パラログは、ペアワイズＢｌａｓｔ解析を使用して、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを用いた遺伝子ファミリーの系統解析により、類似した遺伝子群から検出される。パラログでは、関連遺伝子内の配列に特徴的で、遺伝子の機能が類似しているコンセンサス配列が同定されることがある。

「オルソログ」又はオルソロガス配列は、共通の祖先に由来する種に見られるため、互いに類似した配列である。例えば、共通の祖先を持つ植物種には、類似した配列と機能を持つ多くの酵素が含まれていることが知られている。当業者は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ又はＢＬＡＳＴプログラムを使用して、１つの種の遺伝子ファミリーについて多遺伝子樹を構築することにより、オルソログ配列を同定し、その機能を予測することができる。相同配列間で類似した機能を特定又は確認する方法は、植物又は微生物などの宿主細胞又は生物で、関連ポリペプチドを過剰発現又は欠損（ノックアウト／ノックダウン）した場合の転写プロファイルを比較することによる。当業者は、５０％を超える共通の制御された転写産物、又は７０％を超える共通の制御された転写産物、又は９０％を超える共通の制御された転写産物を有する同様の転写プロファイルを有する遺伝子が同様の機能を有することを理解するであろう。本明細書の配列のホモログ（相同体）、パラログ、オルソログ及び他の任意の変異体は、宿主細胞、植物などの生物又は微生物に本発明の酵素を産生させることにより、同様に機能することが期待される。

用語「選択マーカー」とは、発現時に、選択マーカーを含む細胞を選択することができる任意の遺伝子を指す。選択マーカーの例を以下に記載する。当業者は、異なる抗生物質、殺真菌薬、栄養要求性又は除草剤の選択マーカーが異なる標的種に適用可能であることを知るであろう。

本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的技術及び本発明に従って提供される配列情報を用いて回収することができる。例えば、ｃＤＮＡは、具体的に開示される完全配列の１つ又はそのセグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用し、かつ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）に記載される）標準的ハイブリダイゼーション技術を使用して、好適なｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。

さらに、開示された配列の１つ又はそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。このようにして増幅された核酸は、好適なベクター中にクローニングすることができ、ＤＮＡ配列決定によって特徴づけることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて生成することができる。

本発明による核酸配列又はその誘導体、ホモログ（相同体）又はこれらの配列の一部は、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを介して他の細菌から通常のハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲ技術によって単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で、本発明による配列とハイブリダイズする。

「ハイブリダイズ」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標準的な条件下でほぼ相補的な配列に結合する能力を意味し、一方、これらの条件において非相補的パートナー間の非特異的結合は生じない。これに関して、配列は９０～１００％相補的でありうる。互いに特異的に結合できる相補的配列の特性は、例えばノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティングにおいて、又はＰＣＲもしくはＲＴ－ＰＣＲでのプライマー結合において利用される。

保存領域の短いオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションに好都合に使用される。しかし、本発明による核酸のより長いフラグメント又は完全配列をハイブリダイゼーションに使用することも可能である。これらの「標準条件」は、使用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長いフラグメント又は完全配列）に応じて、又はハイブリダイゼーションに使用される核酸のタイプ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に応じて変わる。例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０℃低い。

例えば、具体的な核酸に応じて、標準条件とは、０．１～５ｘＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の範囲の濃度を有する水性緩衝液中で、又はさらに５０％ホルムアミドの存在下での、４２～５８℃の温度を意味し、例えば５ｘＳＳＣ中４２℃、５０％ホルムアミドである。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は０．１ｘＳＳＣ及び約２０℃～４５℃、好ましくは約３０℃～４５℃の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーション条件は、有利には、０．１ｘＳＳＣ及び約３０℃～５５℃の温度、特に約４５℃～５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの記載された温度は、ホルムアミドの非存在下で長さが約１００ヌクレオチドでかつＧ＋Ｃ含量が５０％である核酸の融解温度計算値の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されており、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの種類又はＧ＋Ｃ含量に応じて当業者に公知の式を使用して算出することができる。当業者は以下の教科書からハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を得ることができる：Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９８５）；Ｂｒｏｗｎ（編）（１９９１）。

「ハイブリダイゼーション」は、特に、ストリンジェントな条件下で実施することができる。このようなハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ－ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６に記載されている。

本明細書で使用する場合、特定の条件下でのハイブリダイゼーション又は特定の条件下でハイブリダイズするという用語は、互いに有意に同一又は相同なヌクレオチド配列が互いに結合したままとなるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を説明することを意図している。条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、及び例えば少なくとも約８５％、９０％、又は９５％同一である配列が、互いに結合したままであるものであってもよい。低ストリンジェンシー、中程度、及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義は本明細書に記載されている。

適切なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎｓ２，４，及び６）に例示されているように、最小限の実験で当業者が選択することができる。さらに、ストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ｃｈａｐｔｅｒｓ７，９，及び１１）に記載されている。

本明細書で使用する、低ストリンジェンシーの定義された条件は以下の通りである。３５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中４０℃で６時間、ＤＮＡ含有フィルターを前処理する。同じ溶液中でハイブリダイゼーションを行うが、以下のように変更する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン及び５～２０Ｘ１０^６の３２Ｐ標識プローブを使用する。ハイブリダイゼーション混合物中４０℃で１８～２０時間フィルターをインキュベートし、次いで、２ＸＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液中５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄液を新しい溶液と置換した後、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターをブロット乾燥し、オートラジオグラフィにかける。

本明細書で使用する、中程度のストリンジェンシーの定義された条件は以下の通りである。ＤＮＡ含有フィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、５０℃で７時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液中で以下の変更を加えて実施する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン及び５～２０×１０^６の３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で、３０時間５０℃でインキュベートし、次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを含有する溶液中で、５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液と取り替え、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターをブロット乾燥し、オートラジオグラフィにかける。

本明細書で使用する、高ストリンジェンシーの定義された条件は以下の通りである。ＤＮＡ含有フィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．０２％のＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で、６５℃で８時間からオーバーナイトで実施する。フィルターを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５～２０×１０^６ｃｐｍの３２Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で、６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のフィコール及び０．０１％のＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間実施する。これに引き続き０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄する。

上記の条件が不適切な場合（例えば、種間ハイブリダイゼーションに使用される場合）、当技術分野で周知の（例えば、種間ハイブリダイゼーションに使用される）低、中、高ストリンジェンシーの他の条件を用いてもよい。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の検出キットは、ポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマー及び／又はプローブ、並びにプライマー及び／又はプローブを使用して試料中のポリペプチドをコードする核酸配列を検出するための関連プロトコルを含んでいてもよい。このような検出キットは、植物、生物、微生物又は細胞が改変されているかどうか、すなわち、ポリペプチドをコードする配列で形質転換されているかどうかを判定するために使用することができる。

本明細書の実施形態による変異型ＤＮＡ配列の機能を試験するために、目的の配列を、選択可能又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子に作動可能に連結し、前記レポーター遺伝子の発現を一過性発現アッセイで、例えば、微生物又はプロトプラストを用いて又は安定に形質転換した植物において試験する。

また本発明は、具体的に開示された又は誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。

したがって、本発明によるさらなる核酸配列は、本明細書に具体的に開示された配列に由来することができる。また１つ又は数個（例えば１～１０個）のヌクレオチドの１つ以上の、例えば１～２０個、特に１～１５又は５～１０個の付加、置換、挿入又は欠失によってそれとは異なることができ、さらに所望の特性プロファイルを有するポリペプチドをコードすることができる。

また本発明は、いわゆるサイレント変異を含む核酸配列、又は具体的な配列と比較して、特定の元の生物もしくは宿主生物のコドン使用に従って改変された核酸配列も包含する。

本発明の特定の実施形態によれば、そのヌクレオチド配列を特定の発現系に適合させるために、変異核酸核酸を調製することができる。例えば、細菌発現系は、アミノ酸が特定のコドンによってコードされる場合、より効率的にポリペプチドを発現することが知られている。遺伝暗号の縮重により、複数のコドンが同じアミノ酸配列をコードする場合があり、複数の核酸配列が同じタンパク質又はポリペプチドをコードする場合がある。これら全てのＤＮＡ配列は、本明細書の実施形態に包含される。必要に応じて、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞における発現を増加させるために最適化され得る。例えば、本明細書の実施形態の核酸は、発現を改善するために宿主に特有のコドンを用いて合成することができる。

また本発明は、本明細書に記載された配列の天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。

対立遺伝子変異体は、配列範囲全体にわたって、アミノ酸誘導体のレベルで少なくとも６０％の相同性、具体的には少なくとも８０％の相同性、かなり具体的には少なくとも９０％の相同性を有することができる（アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドに関しての上記の詳細を参照のこと）。有利には、相同性は配列の部分的な領域でより高くなり得る。

また本発明は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、その結果、問題のアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性及び／又は溶解度のアミノ酸で置き換えられる）により得ることができる配列にも関する。

本発明はまた、配列多型によって具体的に開示された核酸に由来する分子にも関する。このような遺伝子多型は、異なる集団からの細胞内、又は自然の対立遺伝子変異により集団内に存在し得る。また、対立遺伝子変異には、機能的等価体が含まれる場合がある。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列に１～５％の差異を生じさせる。前記多型は、本明細書に開示されるポリペプタイドのアミノ酸配列に変化をもたらすことがある。また、対立遺伝子変異体は、機能的等価体を含むことができる。

さらに誘導体はまた、本発明による核酸配列のホモログ（相同体）、例えば動物、植物、真菌又は細菌のホモログ（相同体）、短縮配列、コード及び非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであると理解されるであろう。例えば、ホモログ（相同体）は、ＤＮＡレベルにおいて、本明細書に具体的に開示される配列で与えられるＤＮＡ領域全体にわたって少なくとも４０％、具体的には６０％、特に具体的には７０％、かなり具体的には８０％の相同性を有する。

さらに誘導体は、例えば、プロモーターとの融合体であると理解される。記載されたヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、プロモーターの機能性又は有効性を損なうことなく、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、逆位及び／又は欠失によって改変することが可能である。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列を変更することによって増大させることができ、又は異なる属の生物であっても、より効果的なプロモーターと完全に交換することができる。

２．２．本発明のポリペプチドを発現させるための構築物
この文脈では以下の定義が適用される：
「遺伝子の発現」には、「異種発現」及び「過剰発現」が含まれ、遺伝子の転写及びｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が含まれる。過剰発現とは、トランスジェニック細胞又は生物におけるｍＲＮＡ、ポリペプチド及び／又は酵素活性のレベルによって測定される遺伝子産物の産生が、同様の遺伝的背景を有する非形質転換細胞又は生物における産生のレベルを超えることをいう。

本明細書で使用する「発現ベクター」とは、外来又は外因性ＤＮＡを宿主細胞に送達するために、分子生物学的方法及び組換えＤＮＡ技術を用いて設計された核酸分子を意味する。発現ベクターは、通常、ヌクレオチド配列の適切な転写に必要な配列を含む。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどをコードすることもできる。

本明細書で使用する「発現ベクター」は、ウイルスベクター、バクテリオファージ及びプラスミドを含むがこれらに限定されない、任意の直鎖状又は環状の組換えベクターを含む。当業者は、発現系に応じて適切なベクターを選択することが可能である。一実施形態では、発現ベクターは、転写プロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、又はｍＲＮＡリボソーム結合部位などの転写、翻訳、開始及び終結を制御する少なくとも１つの「調節配列」に作動可能に連結した本明細書の実施形態の核酸を含み、任意に、少なくとも１つの選択マーカーを含む。ヌクレオチド配列は、調節配列が本明細書の実施形態の核酸に機能的に関連する場合、「作動可能に連結」している。

本明細書で使用する「発現系」は、所定の発現宿主のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、１つの発現又は２つ以上のポリペプチドの同時発現に必要な核酸分子の任意の組み合わせを包含する。それぞれのコード配列は、単一の核酸分子、又は例えば複数のクローニング部位を含むベクター等のベクター、又はポリシストロン性核酸のいずれかに位置していてもよいし、２つ以上の物理的に異なるベクターに分布していてもよい。特定の例として、プロモーター配列、１つ以上のオペレーター配列、及び本明細書に記載される酵素をそれぞれコードする１つ以上の構造遺伝子を含むオペロンを挙げることができる。

本明細書で使用される場合、用語「増幅する」及び「増幅」は、以下に詳細に説明するように、自然に発現した核酸の組換えを生成又は検出するための任意の適切な増幅方法の使用を意味する。例えば、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明の自然に発現した核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）又は組換え核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を増幅するための（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲによる）方法及び試薬（例えば、特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマー対、オリゴｄＴプライマー）を提供する。

「調節配列」とは、本明細書の実施形態に係る核酸配列の発現レベルを決定する核酸配列であって、調節配列に作動可能に連結された核酸配列の転写速度を調節することが可能な核酸配列をいう。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、転写因子、プロモーター要素などを含む。

「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」又は「プロモーター配列」は、本発明に従って、転写されるべき核酸に機能的に連結されたとき、前記核酸の転写を調節する核酸を意味すると理解される。「プロモーター」は特に、ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位及び適切な転写に必要な他の因子を提供することによって、コード配列の発現を制御する核酸配列をいう。他の因子には、これらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位が含まれる。プロモーターという用語の意味には、「プロモーター調節配列」という用語も含まれる。プロモーター調節配列は、関連するコード核酸配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性に影響を与える可能性がある上流及び下流の要素を含むことができる。プロモーターには、天然由来の配列と合成配列が含まれる。コード核酸配列は、通常、転写開始部位を起点とする転写の方向に関して、プロモーターの下流に位置する。

この文脈では、「機能的」又は「作動的」連結は、例えば、核酸の１つと調節配列との連続的な配置を意味すると理解される。例えば、プロモーター活性を有する配列、及び転写される核酸配列の配列、及び任意にさらなる調節要素、例えば核酸の転写を確実にする核酸配列、例えばターミネーターは、調節要素の各々が核酸配列の転写時にその機能を果たすことができるように連結される。これは必ずしも化学的な意味での直接的な結合を必要としない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列は、より離れた位置から、又は他のＤＮＡ分子からでさえ、標的配列に対してその機能を発揮することができる。好ましい配置は、転写される核酸配列がプロモーター配列の後ろ（すなわち、３’末端）に配置され、２つの配列が共有結合されるものである。プロモーター配列と組換え発現させる核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満、又は１００塩基対未満、又は５０塩基対未満とすることができる。

プロモーターとターミネーターに加え、他の調節要素の例として、標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などを挙げることができる。好適な調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。

用語「構成的プロモーター」とは、作動可能に連結された核酸配列の継続的な転写を可能にする非制御的プロモーターのことである。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結をいう。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター、又はむしろ転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が通常連続していることを意味する。プロモーター配列に関連するヌクレオチド配列は、形質転換される植物に関して相同性又は非相同性の起源のものであってよい。また、配列は、全体的に又は部分的に合成されているものでもよい。起源に関わらず、プロモーター配列に関連する核酸配列は、本明細書の実施形態のポリペプチドに結合した後、それが連結されるプロモーター特性に従って発現されるか又は発現抑制される。関連する核酸は、生物全体において常に発現又は抑制されることが望まれるタンパク質をコードしてもよく、あるいは、特定の時間に又は特定の組織、細胞、又は細胞区画において発現又は抑制されることが望まれるタンパク質をコードしてもよい。このようなヌクレオチド配列は、特に、それによって改変又は形質転換された宿主細胞又は宿主生物に対して所望の表現型形質を付与するタンパク質をコードする。より具体的には、関連するヌクレオチド配列は、細胞又は生物において本明細書で定義される目的の生成物の生成をもたらす。特に、ヌクレオチド配列は、本明細書で定義される酵素活性を有するポリペプチドをコードする。

本明細書で上述したヌクレオチド配列は、「発現カセット」の一部であってもよい。用語「発現カセット」と「発現構築物」は、同義的に使用される。（特に組換え）発現構築物は、本発明によるポリペプチドをコードし、調節核酸配列の遺伝的制御下にあるヌクレオチド配列を含む。

本発明に従って適用される方法において、発現カセットは「発現ベクター」、特に組換え発現ベクターの一部であってもよい。

「発現ユニット」とは、本発明によれば、本明細書で定義されるプロモーターを含み、発現される核酸又は遺伝子と機能的に結合した後、前記核酸又は前記遺伝子の発現、すなわち転写及び翻訳を調節する発現活性を有する核酸を意味すると理解される。したがって、これに関連して「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、他の調節要素、例えばエンハンサーもまた存在し得る。

「発現カセット」又は「発現構築物」は、本発明に従って、発現させる核酸又は発現させる遺伝子に機能的に連結された発現ユニットを意味すると理解される。したがって、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写及び翻訳を制御する核酸配列だけでなく、転写及び翻訳の結果としてタンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。

「発現」又は「過剰発現」という用語は、本発明の文脈では、対応するＤＮＡによってコードされる微生物における１つ以上のポリペプチドの細胞内活性の生成又は増加を説明する。この目的のために、例えば、生物に遺伝子を導入すること、既存の遺伝子を他の遺伝子で置換すること、遺伝子のコピー数を増やすこと、強力なプロモーターを用いること、又は高い活性を有する対応するポリペプチドをコードする遺伝子を用いることが可能であり、任意に、これらの手段を組み合わせることも可能である。

特に、本発明によるその構築物は、それぞれのコード配列の５’－上流のプロモーター及び３’－下流のターミネーター配列、及び任意に他の通常の調節要素を含み、それぞれの場合にコード配列と作動的に連結している。

本発明による核酸構築物は、特に、例えば本明細書に記載されているアミノ酸関連の配列番号に由来するポリペプチドをコードする配列、又はその逆相補体、又はその誘導体及び相同体を含み、有利には遺伝子発現を制御、例えば増加させるために、１つ以上の調節シグナルと作動的又は機能的に連結されている。

これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が実際の構造遺伝子の前にまだ存在してもよく、任意に自然調節がスイッチオフされ、遺伝子の発現が増強されるように遺伝的に変更されていてもよい。しかし核酸構築物は、より単純な構造であってもよく、すなわち、コード配列の前に追加の調節シグナルが挿入されておらず、その調節を伴う自然のプロモーターが除去されていない場合である。代わりに、自然の調節配列を変異させて、調節がもはや行われず、遺伝子発現量が増加するようにする。

好ましい核酸構築物は、有利には、プロモーターと機能的に連結している１つ以上の既述の「エンハンサー」配列も含み、これらの配列は、核酸配列の強化された発現を可能にする。ＤＮＡ配列の３’末端には、さらなる調節要素又はターミネーターなどの有利な配列が挿入されていてもよい。本発明による核酸の１つ以上のコピーが、構築物中に存在してもよい。構築物には、栄養要求性又は抗生物質耐性を補完する遺伝子などの他のマーカーが、構築物を選択するために任意に存在してもよい。

好適な調節配列の例は、プロモーター、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ－ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ－ｌａｃ、ｌａｃＩ^ｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰ_ＢＡＤ）ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ－Ｐ_Ｒ、又はｌａｍｂｄａ－Ｐ_Ｌプロモーターに存在し、これらは有利にはグラム陰性菌で採用される。さらに有利な調節配列は、例えば、グラム陽性菌のプロモーターであるａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母又は真菌のプロモーターであるＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ－６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨに存在する。人工プロモーターを用いて調節することもできる。

宿主生物での発現のために、核酸構築物は、有利には、例えば、プラスミド又はファージなどのベクターに挿入され、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする。ベクターとは、プラスミド及びファージに加えて、当業者に知られている他のすべてのベクター、すなわち、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミド及び線状もしくは環状のＤＮＡ又は人工染色体を意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物において自律的に複製することができ、それ以外に染色体上で複製することもできる。これらのベクターは、本発明をさらに発展させたものである。バイナリベクター又はｃｐｏ組み込み型ベクターも適用可能である。

好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ^１１３－Ｂ１、λｇｔ１１もしくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス属のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２もしくはｐＩＪ３６１、バシラス属のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７、真菌のｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２もしくはｐＢＢ１１６、酵母の２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ－１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、又は植物のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ^＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４もしくはｐＤＨ５１にある。上述したプラスミドは、可能なプラスミドのごく一部である。さらなるプラスミドは、当業者に周知であり、例えば、書籍「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ－Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）に記載されている。

ベクターのさらなる発展として、本発明による核酸構築物又は本発明による核酸を含むベクターは、有利には、線状ＤＮＡの形態で微生物に導入され、異種又は相同組換えを介して宿主生物のゲノムに組み込まれることもできる。この線状ＤＮＡは、プラスミドなどの線状化ベクターからなることも、又は本発明による核酸構築物又は核酸のみからなることもできる。

生物における異種遺伝子の最適な発現のために、生物で使用される特定の「コドン使用頻度」に合うように核酸配列を変更することが有利である。この「コドン使用頻度」は、問題になっている生物の他の既知の遺伝子をコンピュータで評価することによって、容易に決定することができる。

本発明による発現カセットは、適切なプロモーターを、適切なコードヌクレオチド配列及びターミネーター又はポリアデニル化シグナルに融合させることによって作製される。この目的のために、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、及び、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている慣習的な組換え技術及びクローニング技術が使用される。

適切な宿主生物で発現させるために、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、有利には、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば、「ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ－Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に見出すことができる。

本明細書の実施形態の代替的な実施形態は、宿主細胞において「遺伝子発現を変化させる」方法を提供する。例えば、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドは、宿主細胞又は宿主生物において、特定の状況で（例えば、特定の温度又は培養条件への曝露時に）増強又は過剰発現又は誘導され得る。

本明細書で提供されるポリヌクレオチドの発現が変化すると、変化した生物と対照又は野生型の生物とで異なる発現パターンである異所性発現が生じることもある。発現の変化は、本明細書の実施形態のポリペプチドと外因性もしくは内因性のモジュレーターとの相互作用から、又はポリペプチドの化学的修飾の結果として生じる。この用語はまた、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの変化した発現パターンが、検出レベル未満に変化しているか、又は活性が完全に抑制されていることを指す。

一実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド又は変異型ポリペプチドをコードする単離、組換え又は合成ポリヌクレオチドもまた、本明細書で提供される。

一実施形態では、いくつかのポリペプチドをコードする核酸配列は、特に異なるプロモーターの制御下で、単一の宿主において共発現する。別の実施形態では、いくつかのポリペプチドをコードする核酸配列は、単一の形質転換ベクター上に存在するか、又は別個のベクターを使用して同時に共形質転換され、両方のキメラ遺伝子を含む形質転換体を選択することができる。同様に、１つのポリペプチドをコードする遺伝子は、他のキメラ遺伝子と共に、単一の植物、細胞、微生物又は生物で発現することができる。

３．本発明に適用される宿主
文脈に応じて、用語「宿主」は、野生型の宿主又は遺伝子改変された組換え宿主、又はその両方を意味することができる。

原則として、すべての原核生物又は真核生物は、本発明による核酸又は核酸構築物の宿主又は組換え宿主生物として考慮することができる。

本発明によるベクターを用いて、例えば本発明による少なくとも１つのベクターで形質転換され、本発明によるポリペプチドの生産に使用することができる原核生物または真核生物の組換え宿主を産生することができる。有利には、上記の本発明による組換え構築物は、適切な宿主系に導入されて発現する。当業者に知られている特に一般的なクローニング法及びトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、電気穿孔、レトロウイルストランスフェクションなどを用いて、記載される核酸をそれぞれの発現系で発現させる。適切な系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７、又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。

例えば、細菌などの微生物が宿主生物として使用される。例えば、グラム陽性又はグラム陰性の細菌が使用され、好ましくは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）又はノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）の細菌、特に好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）又はロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌が使用される。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）属及び種が非常に好ましい。有利には、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はピキア科（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母も好適な宿主である。

あるいは、真核細胞を宿主として用いてもよい。本発明の真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞および植物細胞から選択できるが、これらに限定されない。本発明の真核細胞は、個々の細胞として存在してもよいし、組織の一部（例えば、（培養）組織、器官または生物全体の細胞）であってもよい。

植物全体又は植物細胞を天然又は組換え宿主として利用することもできる。非限定的な例として、以下の植物又はそれに由来する細胞を挙げることができる：タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、特にベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）並びにシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、特にアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）。

昆虫細胞の特に非限定的な例は、Ｓｆ２１、Ｓｆ９およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞である。哺乳動物細胞の特に非限定的な例は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞である。

宿主生物に応じて、本発明による方法で使用される生物は、当業者に知られている方法で増殖又は培養される。培養は、バッチ式、半バッチ式又は連続的に行うことができる。栄養素は、発酵の開始時に存在させてもよいし、後から半連続的又は連続的に供給してもよい。これについても以下で詳しく説明する。

４．１つ以上のＵＮＡＡを含むＰＯＩとその調製
４．１ ＰＯＩ
本発明のＰＯＩは、一般に、少なくとも１つのｎｃＡＡと本発明のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素と上記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌの存在下で、上記の任意の適切な宿主細胞系または無細胞発現系において組み換えによって生産できる任意の形態のポリペプチドまたはタンパク質分子に関する。

特定の実施形態において、ＰＯＩは「標的化剤」として形成するために利用される。

この標的化剤の第一の目的は、特定の「標的」との共有結合または非共有結合の形成である。標的化剤の第二の目的は、「ペイロード分子（ｐａｙｌｏａｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」の前記標的への標的化された輸送である。前記第二の目的を達成するために、ＰＯＩは少なくとも一つのペイロード分子と（可逆的または不可逆的に）結合しなければならない。この目的のために、前記ＰＯＩは、前記少なくとも１つのｎｃＡＡを導入することによって官能化されなければならない。前記少なくとも１つのｎｃＡＡを有する官能化ＰＯＩは、その後、前記ｎｃＡＡ残基を介したバイオ結合により、前記少なくとも１つのペイロード分子に連結されうる。前記ｎｃＡＡはペイロード分子と反応性を有し、そしてペイロード分子はＰＯＩの前記少なくとも１つのｎｃＡＡ残基と反応性を有する対応する部位を保有する。こうして得られたバイオ結合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、すなわち標的化剤は、ペイロード分子を意図する標的に移動させる。

例えば、「標的」は、生物、組織または細胞の中および／または上に存在する任意の分子であってもよい。このような標的は、特定の生物、組織または細胞に対して非特異的であっても特異的であってもよい。標的には、細胞表面標的、例えばレセプター（受容体）、糖タンパク質、糖鎖、炭水化物；構造タンパク質、例えばアミロイド斑；間質中などにある豊富な細胞外標的、成長因子、プロテアーゼなどの細胞外マトリックス標的；細胞内標的、例えばゴルジ体の表面、ミトコンドリアの表面、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路の構成成分；および／または異物、例えばウイルス、細菌、真菌、酵母などの病原体またはその一部が含まれる。

標的の例には、その存在または発現レベルが特定の組織または細胞型と相関する、またはその発現レベルが特定の疾患において上方制御または下方制御されるタンパク質などの化合物が含まれる。

特に、そのような標的は（内在化または非内在化）受容体などのタンパク質である。

標的は、ヒトまたは動物の体内、あるいは病原体または寄生虫上の任意の適切な標的から選択することができる。

好適な標的の非限定的な例としては、以下を含む群が挙げられるが、これらには限定されない：細胞膜および細胞壁などの細胞成分、細胞膜レセプターなどのレセプター、ゴルジ体またはミトコンドリアなどの細胞内構造、酵素、レセプター、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスまたはウイルス粒子、マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖、多糖、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチン受容体、モノアミン酸化酵素、ムスカリン受容体、心筋交感神経系、ロイコトリエン受容体、例えば、白血球上のロイコトリエン受容体、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、葉酸受容体、アポトーシスマーカー、（抗）血管新生マーカー、ガストリン受容体、ドーパミン作動性系、セロトニン作動性系、ＧＡＢＡ作動性系、アドレナリン作動性系、コリン作動性系、オピオイド受容体、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体およびその他の血栓関連受容体、フィブリン、カルシトニン受容体、タフチン受容体、Ｐ糖タンパク質、ニューロテンシン受容体、神経ペプチド受容体、サブスタンスＰ受容体、ＮＫ受容体、ＣＣＫ受容体、シグマ受容体、インターロイキン受容体、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼ、インテグリン受容体、フィブロネクチンターゲット、ＡＯＣ３、ＡＬＫ、ＡＸＬ、Ｃ２４２、ＣＡ－１２５、ＣＣＬ１１、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＡ１５－３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＡ１９－９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９－Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１０５、ＣＤ１２５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１７４、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＶＥＧＦ／ＥＧＦおよびＶＥＧＦ／ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＴＡＧ７２、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、クリプト、テナシンＣ、メラノコルチン－１受容体、Ｇ２５０、ＨＬＡ ＤＲ、ＥＤ－Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、メソセリン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、クランピング因子、ＣＴＬＡ－４、ＣＸＣＲ２、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＮＯＴＣＨｌ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ３、ＨＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＭＩ２４、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＧＦ－１受容体、ＴＲＰＶ１、ＣＦＴＲ、ｇｄＮＭＢ、ＣＡ９、ｃ－ＫＩＴ、ｃ－ＭＥＴ、ＡＣＥ、ＡＰＰ、アドレナリン受容体β２、クローディン３、ＲＯＮ、ＲＯＲｌ、ＰＤ－Ｌｌ、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－１３受容体、インテグリン、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、インターフェロン受容体、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ）、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ムチン、ミオスタチン、ＮＣＡ－９０、ＮＧＦ、ＰＤＧＦＲα、前立腺がん細胞、緑膿菌、狂犬病、ＲＡＮＫＬ、呼吸器合胞体ウイルス、アカゲザル因子、ＳＬＡＭＦ７、スフィンゴシン－１－リン酸、ＴＧＦ－１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＣＴＡＡ１６．８８、ビメンチン、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＬＤＬレセプター、エンドグリン、ポリシアル酸およびそれに対応するレクチン。フィブロネクチンの標的の例としては、フィブロネクチンの交互スプライシングされたエクストラドメインＡ（ＥＤ－Ａ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）が挙げられる。間質における標的の非限定的な例は、Ｖ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｄ．Ｓｃｈｒａｍａ，Ｊ．Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．；Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８，５７，１に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

より詳細には、上記の標的の（特異的な）標的化を可能にするために、標的化剤は、ｎｃＡＡ官能化ペプチド配列を含む化合物を含むことができる。このような化合物としては、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、抗体（フラグメント）融合体（例えば、二特異性および三特異性ｍＡｂフラグメントまたは誘導体）、タンパク質、ペプチド、例えば、オクトレオチドおよび誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、ＬＨＲＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド模倣体、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の態様によれば、標的は受容体であり、標的への特異的結合が可能な標的化剤が採用される。適切な標的化剤としては、これらに限定されないが、そのような受容体のリガンドまたは受容体に依然として結合するその一部、例えば、受容体結合タンパク質リガンドの場合には、受容体結合ペプチドが挙げられる。

タンパク質性の標的化剤の他の例としては、インスリン、トランスフェリン、フィブリノーゲン－γフラグメント、トロンボスポンジン、クローディン、アポリポタンパク質Ｅ、例えばＡＢＹ－０２５などのアフィボディ分子、アンキリンリピートタンパク質、アンキリン様リピートタンパク質、インターフェロン、例えばα、β、γインターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、コロニー刺激因子、タンパク質増殖因子、例えば腫瘍増殖因子、例えばα、β腫瘍増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ｕＰＡＲ標的化タンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン、およびアンジオスタチンが挙げられる。

標的化剤に使用される抗体などのペプチド分子の例としては、ＬＨＲＨ受容体標的化ペプチド、ＥＣ－１ペプチド、ＲＧＤペプチド、ＨＥＲ２標的化ペプチド、ＰＳＭＡ標的化ペプチド、ソマトスタチン標的化ペプチド、ボンベシンが挙げられる。標的化剤の他の例としては、アンチカリンなどのリポカリンが挙げられる。

ある特定の実施形態では、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）とマルチマーおよび誘導体を用いる。

ある特定の実施形態では、抗体は標的化剤を形成するために使用される。ＩｇＧ抗体に由来する抗体または免疫グロブリンは、本発明における使用に特に適しているが、任意のクラスまたはサブクラスからの免疫グロブリンも選択することができ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが挙げられる。好適には、免疫グロブリンは、これらには限定されないが、以下を挙げることができる：ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）を含むクラスＩｇＧ、または抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができるクラスＩｇＭの免疫グロブリン。抗体は、天然由来または組換え由来の無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ラクダ化シングルドメイン抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、多特異性抗体、抗体フラグメント、例えばＦｖ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）、タンデム／ビスｓｃＦｖ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）、ＢｉＴＥ抗体などの二特異性抗体（ｂｃ－ｓｃＦｖ）、三特異性抗体誘導体、例えばトリボディ、ラクダ抗体、ミニボディ、ナノボディ、表面化抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）としても知られる）、キメラ抗体、少なくとも１つのヒト定常領域を含むキメラ抗体、二重アフィニティーリターゲティングタンパク質（ＤＡＲＴ（商標））などの二重アフィニティー抗体、および二価または多価の一本鎖可変フラグメントなどの多量体およびその誘導体（例えば、ジ－ｓｃＦｖ、トリ－ｓｃＦｖ）、（ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、トリボディ、テトラボディなどを含むがこれらには限定されない）、ならびに多価抗体などの様々な形態で存在することができる。［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，３３，２，６５］、［Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，３０，５７５－５８２］、および［Ｃａｎｅ．Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔ．２０１３ １０，１－１８］、および［ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１４，２８，３３１－３４３］を参照し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

「抗体フラグメント」とは、免疫グロブリンの可変領域のうち、標的に結合する少なくとも一部、すなわち抗原結合領域を指す。

他の実施形態では、限定はされないが、アフィマー、アンチカリン、アビマー、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ならびにマルチマーおよびそれらの誘導体などの抗体模倣物を標的化剤として使用する。［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，３３，２，６５］を参照し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

疑義を避けるために、本発明の文脈において、用語「抗体」は、別段の指定がない限り、この段落に概説される抗体の変異体、フラグメント、誘導体、融合体、類似体及び模倣体の全てを含むことを意味する。

好ましい実施形態において、標的化剤は、抗体および抗体フラグメント、フラグメント融合体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体などの抗体誘導体から誘導される薬剤から選択される。

別の好ましい実施形態では、標的化剤は、抗体フラグメント、フラグメント融合体、およびＦｃドメインを含まない他の抗体誘導体から誘導される薬剤から選択される。

本発明のｎｃＡＡ修飾ＰＯＩを形成するためにさらに修飾される抗体分子の典型的な非限定的例は、生物学的に、特に薬理学的に活性な抗体分子から選択される。非限定的な例は、以下の群から選択される：トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、イブリツモマブ（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ＩＧＮ１０１、ＩＮＡ０１ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ｈｕａ３３、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＣ４９）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ－１８、ファルレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＯＲＡｂ－００３）、３Ｆ８、ｃｈ１４，１８、ＫＷ－２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ｌｇＮ３１ １、ＩＭ－２Ｃ６、ＣＤＰ－７９１、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ボロシキマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＭＭ－１２１、ＡＭＧ １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩ Ａ４、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、ＨＧＳ－ＥＴＲ２、ＣＳ－１００８、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、Ｆ１９、８１ Ｃ６、ピナツズマブ（ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、リファツズマブ（ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ）、グレンバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、コルツキシマブ（ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ）、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＰＳＭＡ、ＭＬＮ－０２６４、ＡＢＴ－４１４、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アビツズマブ（ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アルツモマブ・ペンテテート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アネツマブ（ａｎｅｔｕｍａｂ）、アポリズマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アークツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アスクリンバクマブ（ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブロンチクツズマブ（ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、カントツズマブ（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、カプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｂ）、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コドリツズマブ（ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デムシズマブ（ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、デパツキシズマブ（ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、デルロツキシマブ（ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ジヌツキシマブ（ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、デュシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エルゲムツマブ（ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エマクツズマブ（ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エナバツズマブ（ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エミベツズマブ（ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エンフォルツマブ（ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ）、エノブリツズマブ（ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファーレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、イクルクマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イマルマブ（ｉｍａｌｕｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インドゥサツマブ（ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ）、イネビリズマブ（ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、レキサツズマブ（ｌｅｘａｔｕｚｕｍａｂ）、リロトマブ（ｌｉｌｏｔｏｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルムレツズマブ（ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ミルベツキシマブ（ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ（ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モクセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナコロマブ（ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、ナプツモマブ（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバキュマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オトレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パソツキズマブ（ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、ポラツズマブ（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、キリズマブ（ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サシツズマブ（ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ソフィツズマブ（ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、タレックスツマブ（ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、テツロマブ（ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トベツマブ（ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウロクプルマブ（ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウトミルマブ（ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、バダスツキシマブ（ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ）、バンドルツズマブ（ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、バンティクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バヌシズマブ（ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）、バリルマブ（ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベセンクマブ（ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボルセツズマブ（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザツキシマ（ｚａｔｕｘｉｍａ）、それらの組み合わせおよび誘導体、ならびにＣＡＩ ２５、ＣＡＩ ５－３、ＣＡＩ ９－９、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、αフェトプロテイン、ＣＡ ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異抗原、前立腺特異膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣＩ、ＣＥＡ、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴＩ、ＩＬ－２受容体、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、およびＮｅｕ癌遺伝子産物を標的とする他のモノクローナル抗体。

本発明のさらなる特定の実施形態によれば、標的および標的化剤は、癌、炎症、感染、心血管疾患、例えば血栓、アテローム性動脈硬化病変、低酸素部位、例えば脳卒中、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管新生、臓器、レポーター遺伝子／酵素などの組織または疾患の特異的または増大した標的化をもたらすように選択される。これは、組織特異的、細胞特異的、疾患特異的発現をもつ標的を選択することによって達成できる。

一例として、標的化剤は、ある細胞集団に対して、細胞表面受容体または抗原などの細胞表面分子と特異的に結合または複合化する。標的化剤が受容体と特異的に結合または複合化した後、薬剤は細胞内に侵入する。

本明細書で使用されるように、細胞表面分子、細胞外マトリックス標的、または別の標的について「特異的に結合または複合体化」または「標的化」する標的化剤は、分子間力を介して標的と優先的に会合する。例えば、リガンドは、約５０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約５００ｐＭ未満の解離定数（ＫｄまたはＫＤ）を有する標的と優先的に会合できる。

４．２ ＰＯＩの作製
１以上のＵＮＡＡ残基を含むＰＯＩは、真核細胞を用いて本発明に従って作製することができる。該真核細胞は、作製されるＰＯＩのＵＮＡＡ残基に対応する少なくとも１つの非天然アミノ酸又はその塩を含む（例えば、供給される）。該真核細胞はさらに以下を含む：
（ｉ）本発明のＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＰｙｌＲＳは、好ましくは選択的に、ｔＲＮＡ^ＰｙｌをＵＮＡＡ又はその塩でアシル化することができる）；及び、
（ｉｉ）ＰＯＡをコードするポリヌクレオチド（ＵＮＡＡ残基に占められるＰＯＩの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの逆相補体であるコドン、例えばセレクターコドンにコードされている）。
該真核細胞は、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（ｉｉ）の翻訳をできるように培養され、それによりＰＯＩを産生する。

本発明の方法に従ってＰＯＩを作製するために、工程（ｂ）の翻訳は、真核細胞を好適な条件下で、好ましくはＵＮＡＡ又はその塩の存在下で（例えば、ＵＮＡＡ又はその塩を含有する培地中で）、細胞のリボソームにおける翻訳を可能とするのに適した時間の間、培養することにより達成できる。ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（また場合により、ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）に応じて、例えばアラビノース、イソプロピル β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）又はテトラサイクリン等の転写を誘導する化合物を添加することによって発現を誘導することが必要となりうる。ＰＯＩをコードする（そして、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体である１つ以上のコドンを含む）ｍＲＮＡは、リボソームと結合する。次いで、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡが認識（結合）するコドンがコードする位置に、アミノ酸及びＵＮＡＡが段階的に結合することによりポリペプチドが形成される。この結果、ＵＮＡＡは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体であるコドンがコードする位置で、ＰＯＩに組み込まれる。

真核細胞は、細胞によるＰｙｌＲＳの発現を可能にする本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。同様に、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、細胞に含まれるｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列に基づいて、真核細胞によって産生することができる。ＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列は、同じポリヌクレオチド又は別々のポリヌクレオチドのいずれかに位置することができる。

したがって、一実施形態において、本発明は、１つ以上のＵＮＡＡ残基を含むＰＯＩの作製方法を提供し、該方法は下記工程を含む：
（ａ）以下をコードするポリヌクレオチド配列を含む真核細胞を提供する工程：
－本発明の少なくとも１つのＰｙｌＲＳ；
－ＰｙｌＲＳによりアシル化できる少なくとも１つのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）；及び、
－少なくとも１つのＰＯＩ（ＵＮＡＡ残基に占められるＰＯＩの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの逆相補体であるコドンによりコードされている）；並びに、
（ｂ）ＵＮＡＡ又はその塩の存在下で、真核細胞によるポリヌクレオチド配列の翻訳を可能にし、それによりＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ及びＰＯＩを産生する工程。

本明細書に記載の１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むＰＯＩを作製するために使用される真核細胞は、ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ及びＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列を真核（宿主）細胞に導入することによって産生できる。前記ポリヌクレオチド配列は、同じポリヌクレオチド上又は別々のポリヌクレオチド上に位置することができ、（例えば、ウイルス媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等を使用するなど）当技術分野において公知の方法によって細胞に導入することができる。

翻訳後、本発明に従って作製されたＰＯＩは、当技術分野において一般的に知られている手順に従って、部分的に又は実質的に均一になるまで、任意に回収及び精製することができる。ＰＯＩが培地に分泌されない限り、回収は通常、細胞破壊を必要とする。細胞破壊の方法は当技術分野において周知であり、例えば超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）処理による物理的破壊、（例えば、フレンチプレスを用いた）液体剪断破壊、機械的方法（例えばブレンダーもしくは粉砕機を利用するもの）又は、凍結融解サイクル、並びに、脂質－脂質、タンパク質－タンパク質及び／又はタンパク質－脂質の相互作用を破壊する薬剤（洗剤等）を用いた化学的溶解、並びに、物理的破壊技術と化学的溶解の組み合わせを挙げることができる。細胞溶解物又は培地からポリペプチドを精製するための標準的な手順もまた当技術分野で周知である。例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を挙げることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、正しく折り畳まれた成熟タンパク質を作製する際に用いることができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適切な方法は、高純度が望まれる最終精製工程において使用することができる。本発明のポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬として、すなわちポリペプチドの親和性に基づく精製に使用することができる。様々な精製／タンパク質折り畳み法が当技術分野において周知である。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；及び本明細書中に引用する参考文献に記載のものが挙げられる。

すでに述べたように、当業者は、合成、発現及び／又は精製の後、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有する場合があることを認識するであろう。例えば、原核細胞系により産生されるポリペプチドは、しばしばカオトロピック剤への曝露により最適化され、適切な折り畳みを達成する。例えばＥ．ｃｏｌｉ由来の溶解物からの精製中に、発現したポリペプチドは、必要に応じて変性され、次いで復元される。これは、例えばグアニジンＨＣｌ等のカオトロピック剤の中にタンパク質を可溶化することにより達成される。一般に、発現したポリペプチドを変性及び破壊し、次いでポリペプチドを好ましい立体構造にリフォールディングすることが時には望ましい。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを目的の翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び復元する方法は当業者に周知である。ポリペプチドは、例えば酸化型グルタチオン及びＬ－アルギニンを含有するレドックス緩衝液中でリフォールディングすることができる。

５．ペイロード分子
一般的に使用されるペイロード分子は、生理活性化合物、標識剤、およびキレート剤から選択することができる。以下にその非限定的な例を示す。

５．１ 生物活性化合物
生物活性化合物は、これに限定されるものではないが、以下を含む：
本発明に従って適用可能な生物活性化合物としては、有機低分子薬物、ステロイド、脂質、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ならびにペプチド、ペプトイド、アミノ酸、ヌクレオチド、オリゴまたはポリヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、毒素、糖鎖および免疫グロブリンが挙げられるが、これに限定されない。

本発明の実施に使用することができる生物活性化合物の例示的な分類には、これに限定はされないが、以下が含まれる：ホルモン、細胞毒素、抗増殖／抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質、サイトカイン、抗炎症剤、降圧剤、化学感作剤、光感作剤および放射線感作剤、抗エイズ物質、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、酵素阻害剤、抗パーキンソン病剤、神経毒、チャネル遮断剤、細胞成長阻害剤および抗接着分子を含む細胞外マトリックス相互作用調節剤、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成阻害剤、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管新生因子、抗アルツハイマー病剤。

いくつかの実施形態において、生物活性化合物は、低～中分子量化合物（例えば、約２００～５０００Ｄａ、約２００～約１５００Ｄａ、好ましくは約３００～約１０００Ｄａ）である。

例示的な細胞毒性薬剤は、特に癌治療に使用されるものである。このような薬剤には、一般に、ＤＮＡ損傷剤、抗代謝物、天然物およびその類似体、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤およびチミジル酸合成酵素阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡ結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、放射線増感剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ切断剤、微小管安定化および不安定化剤、トポイソメラーゼ阻害剤が含まれる。例えば、白金系薬剤、アントラサイクリン系薬剤、ビンカ系薬剤、マイトマイシン系、ブレオマイシン系、細胞毒性ヌクレオシド系、タキサン系薬、レキシトロプシン系、プテリジン系薬剤、ジイネン系、ポドフィロトキシン系、ドラスタチン系、メイタンシノイド系、分化誘導剤、タキソール系などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの分類の特に有用なものとしては、例えば、オーリスタチン、メイタンシン、メイタンシノイド、カリキアミシン、ダクチノマイシン、デュオカルマイシン、ＣＣ１０６５およびその類似体、カンプトテシンおよびその類似体、ＳＮ－３８およびその類似体；ＤＸｄ、ツブリシンＭ、クリプトフィシン、ピロロベンゾジアゼピンおよびピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）、ピリジノベンゾジアゼピン（ＰＤＤ）およびインドリノベンゾジアゼピン（ＩＢＤ）（参照：ＵＳ２０２１０２０６７６３Ａ１）、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、ＤＮＡ小溝結合剤、６－メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、アントラサイクリン（ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ＰＮＵ－１５９６８２（参照：ＵＳ１０２８８７４５Ｂ２）およびその類似体、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよび；ポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシドまたはリン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテール、レチノイン酸、酪酸、Ｎ８－アセチルスペルミジン、スタウロスポリン、コルヒチン、カンプトテシン、エスペラマイシン、エネジインおよびそれらの類似体、ヘミアスタリンおよびその類似体が挙げられる。

他の例示的な薬物分類は、血管新生阻害剤、細胞周期進行阻害剤、Ｐ１３Ｋ／ｍ－ＴＯＲ／ＡＣＴ経路阻害剤、ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質シャペロン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｗｎｔ／ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、およびタンパク質分解剤である（参照：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．０ｃ００２８５）。

オーリスタチンの例としては、ドラスタチン１０、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オーリスタチンＦ、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、オーリスタチンＦヒドロキシプロピルアミド（ＡＦ ＨＰＡ）、オーリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、オーリスタチンＰＥ、オーリスタチンＥＢ、オーリスタチンＥＦＰ、オーリスタチンＴＰおよびオーリスタチンＡＱが挙げられる。また適切なオーリスタチンは、米国特許公開第２００３／００８３２６３号、同第２０１１／００２０３４３号、および同第２０１１／００７０２４８号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ０９／１１７５３１号、同ＷＯ２００５／０８１７１１号、同ＷＯ０４／０１０９５７号；同ＷＯ０２／０８８１７２号、および同ＷＯ０１／２４７６３号、ならびに米国特許第７，４９８，２９８号；同第６，８８４，８６９号；同第６，３２３，３１５号；同第６，２３９，１０４号；同第６，１２４，４３１号；同第６，０３４，０６５号；同第５，７８０，５８８号；同第５，７６７，２３７号；同第５，６６５，８６０号；同第５，６６３，１４９号；同第５，６３５，４８３号；同第５，５９９，９０２号；同第５，５５４，７２５号；同第５，５３０，０９７号；同第５，５２１，２８４号；同第５，５０４，１９１号；同第５，４１０，０２４号；同第５，１３８，０３６号；同第５，０７６，９７３号；同第４，９８６，９８８号；同第４，９７８，７４４号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８１６，４４４号；および、同第４，４８６，４１４号に記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

例示的な薬物には、ドラスタチンとその類似体が含まれ、以下が挙げられる：ドラスタチンＡ（米国特許第４，４８６，４１４号）、ドラスタチンＢ（米国特許第４，４８６，４１４号）、ドラスタチン１０（米国特許第４，４８６，４４４号、同第５，４１０，０２４号、同第５，５０４，１９１号、同第５，５２１，２８４号、同第５，５３０，０９７号、同第５，５９９，９０２号、同第５，６３５，４８３号、同第５，６６３，１４９号、同第５，６６５，８６０号、同第５，７８０，５８８号、同第６，０３４，０６５号、同第６，３２３，３１５号）、ドラスタチン１３（米国特許第４，９８６，９８８号）、ドラスタチン１４（米国特許第５，１３８，０３６号）、ドラスタチン１５（米国特許第４，８７９，２７８号）、ドラスタチン１６（米国特許第６，２３９，１０４号）、ドラスタチン１７（米国特許第６，２３９，１０４号）、およびドラスタチン１８（米国特許第６，２３９，１０４号）。各特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

例示的なメイタンシン、ＤＭ－１およびＤＭ－４などのメイタンシノイド、またはメイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を含むメイタンシノイド類似体は、米国特許第４，４２４，２１９号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６２，６６３号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３７１，５３３号；同第５，２０８，０２０号；同第５，４１６，０６４号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，３３３，４１０号；同第６，４４１，１６３号；同第６，７１６，８２１号および同第７，２７６，４９７号に記載されている。

他の例には、メルタンシンおよびアンサミトシンが含まれる。ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）には、明示的に二量体および類似体が含まれ、［Ｄｅｎｎｙ，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，１０（４）：４５９－４７４（２０００）］，［Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２０１１，２０（６）：７３３－４４］，［Ａｎｔｏｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２０１１，１１１（４），２８１５－６４］に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。

カリケアミシンには、例えば、エネジイン、エスペラマイシン、および米国特許第５，７１４，５８６号および第５，７３９，１１６号に記載されているものが含まれる。

デュオカルマイシンおよび類似体の例としては、ＣＣ１０６５、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢｌ、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣＩ、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、ＤＵ－８６、ＫＷ－２１８９、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼレシン、セコアドゼレシンが挙げられる。他の例としては、例えば、米国特許第５，０７０，０９２号；同第５，１０１，０９２号；同第５，１８７，１８６号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５９５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，５３４，６６０号；同第６，５４８，５３０号；同第６，５８６，６１８号；同第６，６６０，７４２号；同第６，７５６，３９７号；同第７，０４９，３１６号；同第７，５５３，８１６号；同第８，８１５，２２６号；ＵＳ２０１５０１０４４０７；２０１４年５月２日出願の６１／９８８，０１１および２０１４年６月１１日出願の６２／０１０，９７２に記載のものが挙げられる。これらの各開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。

例示的なビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびナベルビン、ならびに米国特許公開第２００２／０１０３１３６号および同第２０１０／０３０５１４９号、ならびに米国特許第７，３０３，７４９号に開示されているものが挙げられる。これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

例示的なエポチロン化合物としては、エポチロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。適切なエポチロン化合物およびその誘導体は、例えば、米国特許第６，９５６，０３６号；同第６，９８９，４５０号；同第６，１２１，０２９号；同第６，１１７，６５９号；同第６，０９６，７５７号；同第６，０４３，３７２号；同第５，９６９，１４５号；および同第５，８８６，０２６号；ならびにＷＯ９７／１９０８６；ＷＯ９８／０８８４９；ＷＯ９８／２２４６１；ＷＯ９８／２５９２９；ＷＯ９８／３８１９２；ＷＯ９９／０１１２４；ＷＯ９９／０２５１４；ＷＯ９９／０３８４８；ＷＯ９９／０７６９２；ＷＯ９９／２７８９０；およびＷＯ９９／２８３２４に記載されている。これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

例示的なクリプトフィシン化合物は、米国特許第６，６８０，３１１号および同第６，７４７，０２１号に記載されている。これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

例示的な白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イプロプラチン、オルマプラチン、テトラプラチンが挙げられる。

例示的なＤＮＡ結合剤またはアルキル化剤としては、ＣＣ－１０６５およびその類似体、アントラサイクリン、カリキアミシン、ダクチノマイシン、ミトロマイシン、ピロロベンゾジアゼピンなどが挙げられる。

例示的な微小管安定化剤および不安定化剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル、テセタキセルおよびカルバジタキセルなどのタキサン化合物；メイタンシノイド、オーリスタチンおよびその類似体、ビンカアルカロイド誘導体、エポチロンおよびクリプトフィシンなどが挙げられる。

例示的なトポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、ＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８、トポテカン、９－アミノカンプトテシン、ルビテカン、ギマテカン、カレニテシン、シラテカン、ルルトテカン、エキサテカン、ＤＸｄ、ジフロメトテカン、ベロテカン、ルルトテカンおよびＳ３９６２５などの、カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体、カンプトテシン類似体および非天然カンプトテシンが挙げられる。本発明において使用できる他のカンプトテシン化合物としては、例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２３５８－２３６３（１９８６）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３：５５４（１９８０）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１７７４（１９８７）に記載されているものが挙げられる。

血管新生阻害剤には、これらに限定されないが、ＭｅｔＡＰ２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＩＧＦ阻害剤、ＶＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＭｅｔＡＰ２阻害剤が含まれる。例示的なＶＧＦＲ阻害剤およびＰＤＧＦＲ阻害剤としては、ソラフェニブ、スニチニブおよびバタラニブが挙げられる。例示的なＭｅｔＡＰ２阻害剤としては、フマギロール類似体、すなわちフマギリンコア構造を含む化合物が挙げられる。

例示的な細胞周期進行阻害剤としては、例えばＢＭＳ－３８７０３２およびＰＤ０３３２９９１などのＣＤＫ阻害剤；例えばＡＺＤ７７６２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤；例えばＡＺＤ１１５２、ＭＬＮ８０５４およびＭＬＮ８２３７などのオーロラキナーゼ阻害剤；例えばＢＩ２５３６、ＢＩ６７２７、ＧＳＫ４６１３６４、ＯＮ－０１９１０などのＰＬＫ阻害剤；および例えばＳＢ７４３９２１、ＳＢ７１５９９２、ＭＫ－０７３１、ＡＺＤ８４７７、ＡＺ３１４６、ＡＲＲＹ－５２０などのＫＳＰ阻害剤が挙げられる。

例示的なＰ１３Ｋ／ｍ－ＴＯＲ／ＡＣＴシグナル伝達経路阻害剤としては、ホスホイノシチド３－キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）阻害剤、ＧＳＫ－３阻害剤、ＡＴＭ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤およびＰＤＫ－１阻害剤が挙げられる。

例示的なＰ１３キナーゼは、米国特許第６，６０８，０５３号に開示されており、ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＢＫＭ１２０、ＣＡＬ２６３、デメトキシビリジン、ＧＤＣ－０９４１、ＧＳＫ６１５、ＩＣ８７１１４、ＬＹ２９４００２、パロミド５２９、ペリホシン、ＰＦ－０４６９１５０２、ＰＸ－８６６、ＳＡＲ２４５４０８、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＦ１１２６、ワートマニン、ＸＬ１４７およびＸＬ７６５が挙げられる。

例示的なＡＫＴ阻害剤としては、ＡＴ７８６７が挙げられるが、これには限定されない。

例示的なＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤としては、ＭＥＫ、Ｒａｓ、ＪＮＫ、Ｂ－Ｒａｆおよびｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤が挙げられる。

例示的なＭＥＫ阻害剤は、米国特許第７，５１７，９４４号に開示されており、ＧＤＣ－；０９７３、ＧＳＫｌ １２０２１２、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ、ＡＳ７０３０２６、Ｒ０５１２６７６６およびＲ０４９８７６５５、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ８３３０およびＧＤＣ－０９７３が挙げられる。

例示的なＢ－ｒａｆ阻害剤としては、ＣＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４０３２、およびＳＢ５９０８８５が挙げられる。

例示的なＢ ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤としては、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０およびＳＢ２０２１９０が挙げられる。例示的な受容体チロシンキナーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ－ＡＥＥ ７８８）、ＢＩＢＷ２９９２（アファチニブ）、ラパチニブ、エルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ＡＰ２４５３４（ポナチニブ）、ＡＢＴ－８６９（リニファニブ）、ＡＺＤ２１７１、ＣＨＲ－２５８（ドビチニブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、およびバタリニブが挙げられる。

例示的なタンパク質シャペロン阻害剤には、ＨＳＰ９０阻害剤が含まれる。例示的な阻害剤としては、１７ＡＡＧ誘導体、ＢＩＩＢ０２１、ＢＩＩＢ０２８、ＳＮＸ－５４２２、ＮＶＰ－ＡＵＹ－９２２およびＫＷ－２４７８が挙げられる。

例示的なＨＤＡＣ阻害剤としては、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＣＵＤＣ－１０１、ドロキシノスタット、ＩＴＦ２３５７（ジビノスタット、ガビノスタット）、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＬＡＱ８２４（ＮＶＰ－ＬＡＱ８２４、ダシノスタット）、ＬＢＨ－５８９（パノビノスタット）、ＭＣ１５６８、ＭＧＣＤ０１０３（モセチノスタット）、ＭＳ－２７５（エンチノスタット）、ＰＣＩ－２４７８１、ピロキサミド（ＮＳＣ ６９６０８５）、ＳＢ９３９、トリコスタチンＡおよびボリノスタット（ＳＡＨＡ）が挙げられる。例示的なＰＡＲＰ阻害剤としては、イニパリブ（ＢＳＩ ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ－２２８１）、ＡＢＴ－８８８（ベリパリブ）、ＡＧ０１４６９９、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ ４８２７、ＫＵ－００５９４３６（ＡＺＤ２２８１）、ＬＴ－６７３、３－アミノベンズアミド、Ａ－９６６４９２、およびＡＺＤ２４６１が挙げられる。

例示的なＷｎｔ／ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤としては、ビスモデギブ、シクロパミン、およびＸＡＶ－９３９が挙げられる。

例示的なＲＮＡポリメラーゼ阻害剤としては、アマトキシン類が挙げられる。例示的なアマトキシンには、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ｅｔａ－アマニチン、アマヌリン、アマヌリン酸、アマニサミド、アマノン、およびプロアマヌリンが挙げられる。

例示的なサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦが挙げられる。特定の薬剤の非限定的な例として、オーリスタチン、メイタンシノイド、ＰＢＤ、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンを挙げることができる。

別の実施形態では、上記の２つ以上の異なる薬剤の組み合わせが使用される。

別の実施形態によれば、生物活性化合物は、１つ以上の天然および／または非天然の、タンパク質原性および／または非タンパク質原性アミノ酸残基を含む任意の合成または天然化合物、例えば特にオリゴまたはポリペプチドまたはタンパク質から選択できる。

この化合物の特定のグループは、例えば抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、抗体（フラグメント）融合体（例えば二特異性および三特異性ｍＡｂフラグメントまたは誘導体）、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体またはキメラ抗体などの免疫グロブリン分子を含む。

本発明で使用する抗体の典型的な非限定的な例は、生物学的に、特に薬理学的に活性な抗体分子から選択される。非限定的な例は、以下の群から選択される：トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、イブリツモマブ（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ＩＧＮ１０１、ＩＮＡ０１ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ｈｕａ３３、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＣ４９）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ－１８、ファルレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＯＲＡｂ－００３）、３Ｆ８、ｃｈ１４，１８、ＫＷ－２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ｌｇＮ３１ １、ＩＭ－２Ｃ６、ＣＤＰ－７９１、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ボロシキマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＭＭ－１２１、ＡＭＧ １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩ Ａ４、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、ＨＧＳ－ＥＴＲ２、ＣＳ－１００８、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、Ｆ１９、８１ Ｃ６、ピナツズマブ（ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、リファツズマブ（ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ）、グレンバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、コルツキシマブ（ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ）、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＰＳＭＡ、ＭＬＮ－０２６４、ＡＢＴ－４１４、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アビツズマブ（ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アルツモマブ・ペンテテート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アネツマブ（ａｎｅｔｕｍａｂ）、アポリズマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アークツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アスクリンバクマブ（ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブロンチクツズマブ（ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、カントツズマブ（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、カプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｂ）、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コドリツズマブ（ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（ｄａｌｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デムシズマブ（ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、デパツキシズマブ（ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、デルロツキシマブ（ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ジヌツキシマブ（ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、デュシギツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エルゲムツマブ（ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エマクツズマブ（ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エナバツズマブ（ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エミベツズマブ（ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エンフォルツマブ（ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ）、エノブリツズマブ（ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファーレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、イクルクマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イマルマブ（ｉｍａｌｕｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インドゥサツマブ（ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ）、イネビリズマブ（ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、レキサツズマブ（ｌｅｘａｔｕｚｕｍａｂ）、リロトマブ（ｌｉｌｏｔｏｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルムレツズマブ（ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ミルベツキシマブ（ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ（ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モクセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナコロマブ（ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、ナプツモマブ（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバキュマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オトレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パソツキズマブ（ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、ポラツズマブ（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、キリズマブ（ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サシツズマブ（ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ソフィツズマブ（ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、タレックスツマブ（ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、テツロマブ（ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トベツマブ（ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウロクプルマブ（ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウトミルマブ（ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、バダスツキシマブ（ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ）、バンドルツズマブ（ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、バンティクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バヌシズマブ（ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）、バリルマブ（ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベセンクマブ（ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボルセツズマブ（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザツキシマ（ｚａｔｕｘｉｍａ）、それらの組み合わせおよび誘導体、ならびにＣＡＩ ２５、ＣＡＩ ５－３、ＣＡＩ ９－９、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、αフェトプロテイン、ＣＡ ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異抗原、前立腺特異膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣＩ、ＣＥＡ、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴＩ、ＩＬ－２受容体、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、およびＮｅｕ癌遺伝子産物を標的とする他のモノクローナル抗体。

５．２ 標識剤
本発明に従って使用することができる標識剤は、テトラジン部分の反応性を阻害しない、当技術分野で公知の任意のタイプの標識を含むことができる。

本発明の標識としては、これらに限定されないが、以下を挙げることができる：色素（例えば蛍光、ルミネセンス、又はリン光色素、例えばダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、またはシアニン色素）、発色団（例えばフィトクロム、フィコビリン、ビリルビンなど）、放射性標識（例えば、水素、フッ素、炭素、リン、硫黄、ヨウ素の放射性形態、例えば、トリチウム、フッ素－１８、炭素－１１、炭素－１４、リン－３２、リン－３３、硫黄－３３、硫黄－３５、ヨウ素－１２３、またはヨウ素－１２５）、ＭＲＩ感受性スピン標識、アフィニティタグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、糖、脂質、ステロール、ＰＥＧ－リンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン、または補因子）、ポリエチレングリコール基（例えば、分枝状ＰＥＧ、直鎖状ＰＥＧ、分子量の異なるＰＥＧなど）、光架橋剤（ｐ－アジドヨードアセトアニリドなど）、ＮＭＲプローブ、Ｘ線プローブ、ｐＨプローブ、ＩＲプローブ、樹脂、固体支持体。

いくつかの実施形態において、例示的な色素は、スペクトルの近赤外領域で蛍光を発するＮＩＲ造影剤を含むことができる。例示的な近赤外蛍光色素分子は、約６３０～１０００ｎｍの間、例えば、約６３０～８００ｎｍの間、約８００～９００ｎｍの間、約９００～１０００ｎｍの間、約６８０～７５０ｎｍの間、約７５０～８００ｎｍの間、約８００～８５０ｎｍの間、約８５０～９００ｎｍの間、約９００～９５０ｎｍの間、または約９５０～１０００ｎｍの間の発光波長（例えば、ピーク発光波長）を有する色素および他の蛍光色素分子を含むことができる。１０００ｎｍを超える発光波長（例えば、ピーク発光波長）を有する蛍光色素分子もまた、本明細書に記載される方法において使用することができる。

いくつかの実施形態において、例示的な蛍光色素分子には、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；ユージーン、オレゴン州）、５（６）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、リサミンローダミンＢ、５（６）－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボン酸、テトラメチルローダミン－５（６）－イソチオシアネート、５（６）－カルボキシテトラメチルローダミン、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸、６－［フルオレセイン－５（６）－カルボキサミド］ヘキサン酸、Ｎ－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－３－インダセンプロピオン酸、エオシン－５－イソチオシアネート、エリスロシン－５－イソチオシアネート、およびＣＡＳＣＡＤＥ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ユージーン、オレゴン州）およびＡＴＴＯ色素が含まれる。

さらに、１７７－ルテチウム、８９－ジルコニウム、１３１－ヨード、６８－ガリウム、９９ｍ テクネチウム、２２５－アクチニウム、２１３－ビスムト、９０－イトリウム、２１２－鉛などの標識剤がある。

５．３ キレート剤
一般的に適用可能なキレート剤とその略称の一覧を以下に示す。その対応する塩も適用可能である。

アセチルアセトン（ＡＣＡＣ）、エチレンジアミン（ＥＮ）、２－（２－アミノエチルアミノ）エタノール（ＡＥＥＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＩＥＮ）、イミノジアセテート（ＩＤＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＲＩＥＮ）、トリアミノトリエチルアミン、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）およびＮａ_３ＮＴＡまたはＦｅＮＴＡなどのその塩、エチレンジアミノトリアセテート（ＴＥＤ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびＮａ_２ＥＤＴＡおよびＣａＮａ_２ＥＤＴＡなどのその塩、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、シュウ酸塩（ＯＸ）、酒石酸塩（ＴＡＲＴ）、クエン酸塩（ＣＩＴ）、ジメチルグリオキシム（ＤＭＧ）、８－ヒドロキシキノリン、２，２’－ビピリジン（ＢＰＹ）、１，１０－フェナントロリン（ＰＨＥＮ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、１，２－ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、サリチル酸ナトリウム、メトキシサリチル酸塩、英国抗ルイサイトまたは２，３－ジメルカプロール（ＢＡＬ）、メソ－２，３－ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）；微生物によって分泌されるシデロフォア、例えば、ストレプトミセス属によって産生されるデスフェリオキサミンまたはデフェロキサミンＢ、別名Ｄｅｆｅｒｒａｌ（ノバルティス）；デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ストレプトミセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）が分泌するトリヒドロキサム酸；クルクミノイドならびに３－ヒドロキシムギネ酸および２’－デオキシムギネ酸等のムギネ酸誘導体などの植物化学物質；イブプロフェンなどの合成キレート剤；ヒドロキサメートデスフェラルおよびヒドロキシピリジノンデフェリプロンなどのカテコール、ヒドロキサメート、およびヒドロキシピリジノンの誘導体；デフェリプロン（Ｌ１または１，２－ジメチル－３－ヒドロキシピリド－４－オン）；β－β－ジメチルシステインまたは３－メルカプト－Ｄ－バリンであるＤ－ペニシラミン（ＤＰＡまたはＤ－ＰＥＮ）；テトラエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ）またはトリエンチンおよびその２つの主要代謝物Ｎ_１－アセチルトリエチレンテトラミン（ＭＡＴ）およびＮ_１，Ｎ_１０－ジアセチルトリエチレンテトラミン（ＤＡＴ）；ヒドロキシキノリン；８－ヒドロキシキノリンのハロゲン化誘導体であるクリオキノール；ならびに、５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］キノリン－８－オール（ＰＢＴ２）

６ ＵＮＡＡ
本発明の方法及びキットに有用なＵＮＡＡは、先行技術に記載されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１０；Ｌｅｍｋｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１６９１－１６９４，２０１４を参照のこと）。

ＵＮＡＡは、他の分子（本明細書では「結合相手分子」という）の適切な基（本明細書では「ドッキング基」という）との反応を促進する基（本明細書では「標識基」という）を有することができ、それにより結合相手分子はＵＮＡＡに共有結合する。標識基を有するＵＮＡＡがＰＯＩに翻訳的に組み込まれた場合、標識基はＰＯＩの一部となる。したがって、本発明の方法に従って作製されたＰＯＩは、１つ以上の結合相手分子と反応させることができ、それにより、結合相手分子はＰＯＩの非天然アミノ酸残基（の標識基）に共有結合する。この結合反応は、ＰＯＩを発現する細胞又は組織内のＰＯＩのｉｎ ｓｉｔｕカップリング、又は単離されたもしくは部分的に単離されたＰＯＩの部位特異的結合に使用することができる。

標識基と（結合相手分子の）ドッキング基の組み合わせについて、特に有用な選択肢は、金属フリークリック反応により反応できるものである。このようなクリック反応としては、歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ；例えば、Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：７０１３参照）、並びに、歪のあるシクロアルキニル基、又は、アミノ基で置換された三重結合が結合していない環原子を１つ以上有する歪のあるシクロアルキニル類似体基と、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン及びジアゾカルボニル試薬との環状付加反応（例えば、Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１０，１３３：９４９；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００４，１２６：１５０４６参照）、例えば、歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）を挙げることができる。このようなクリック反応は、ＰＯＩのＵＮＡＡ標識基とカップリング相手分子の適切な基との超高速二重直交型共有結合部位特異的カップリングを可能にする。

上記のクリック反応を介して反応できるドッキング基及び標識基の対は当技術分野において公知である。ドッキング基を含む適切なＵＮＡＡの例としては、これらには限定されないが、例えばＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のＵＮＡＡが挙げられる。

（結合相手分子に含まれる）ドッキング基と（ＰＯＩのＵＮＡＡ残基に含まれる）標識基の特定の適切な対の例としては、これらには限定されないが、以下を挙げることができる：
（ａ）アジド基、ニトリルオキシド官能基（すなわち、式で表される基、ニトロン官能基又はジアゾカルボニル基）から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｂ）任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、アジド基、ニトリルオキシド官能基から選択される基を含む（又は本質的になる）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｃ）任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換されたテトラアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｄ）任意に置換されたテトラジニル基を含む（または本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）において共有結合的に反応することができる）。

任意に置換された歪のあるアルキニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたｔｒａｎｓ－シクロオクテニル基（例えば、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のもの）が挙げられる。任意に置換された歪のあるアルケニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたシクロオクチニル基（例えば、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のもの）が挙げられる。任意に置換されたテトラジニル基としては、これらには限定されないが、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のものが挙げられる。

アジド基は式－Ｎ_３の基である。

ニトロン官能基は、式－Ｃ（Ｒ^ｘ）＝Ｎ^＋（Ｒ^ｙ）－Ｏ^－の基である。式中、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは有機残基、例えば本明細書に記載のＣ_１－Ｃ_６－アルキルから独立して選択される残基である。

ジアゾカルボニル基は、式－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ＝Ｎ_２の基である。

ニトリルオキシド官能基は、式－Ｃ≡Ｎ^＋－Ｏ^－又は好ましくは、式－Ｃ＝Ｎ^＋（Ｒ^ｘ）－Ｏ^－の基である。式中、Ｒ^ｘは有機残基、例えば本明細書に記載のＣ_１－Ｃ_６－アルキルから独立して選択される残基である。

シクロオクチニルは、環構造中に８個の炭素原子及び１個の三重結合を有する不飽和脂環式基である。

「ｔｒａｎｓ－シクロオクテニル」は、環構造中に８個の炭素原子及びトランス配置の１個の二重結合を有する不飽和脂環式基である。

「テトラジニル」は、４個の窒素環原子及び２個の炭素環原子を有する６員単環式芳香族基である。

特に指示のない限り、用語「置換された」は、基が１、２又は３個、特に１又は２個の置換基で置換されていることを意味する。特定の実施形態において、これらの置換基は、水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル，（Ｒ^ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル，（Ｒ^ｂＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル，ＣＦ_３，ＣＮ，ヒドロキシル，Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ，－Ｏ－ＣＦ_３，Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシ，Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシ，Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシ又はＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ，Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノ，ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノ，Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノ，Ｎ－Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｎ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル－アミノ及びジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノ（式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは独立して水素もしくはＣ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルである）から独立して選択することができる。

ハロゲンという用語は、いずれの場合も、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素基、特にフッ素基を意味する。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルは、１～４個、特に１～３個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。例としては、メチル並びにエチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、２－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチル等のＣ_２－Ｃ_４－アルキルが挙げられる。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルは、２、３、４又は５個の炭素原子を有する単一不飽和炭化水素基である。例としては、ビニル，アリル（２－プロペン－１－イル），１－プロペン－１－イル，２－プロペン－２－イル，メタリル（２－メチルプロパ－２－エン－１－イル），１－メチルプロパ－２－エン－１－イル，２－ブテン－１－イル，３－ブテン－１－イル，２－ペンテン－１－イル，３－ペンテン－１－イル，４－ペンテン－１－イル，１－メチルブタ－２－エン－１－イル及び２－エチルプロパ－２－エン－１－イルが挙げられる。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシは、式Ｒ－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキル基である。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシは、式Ｒ－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルである。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシは、式Ｒ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシは、式Ｒ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルチオは、式Ｒ－Ｓ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノは、式Ｒ－ＮＨ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノは、式Ｒ^ｘ－Ｎ（Ｒ^ｙ）－の基である。式中、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノは、式Ｒ－ＮＨ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルである。

Ｎ－Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｎ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノは、式Ｒ^ｘ－Ｎ（Ｒ^ｙ）－の基である。式中、Ｒ^ｘは本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルであり、Ｒ^ｙはＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

ジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノは、式Ｒ^ｘ－Ｎ（Ｒ^ｙ）－の基である。式中、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルである。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルは、式Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－の基である。式中、Ｒ^ｘは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

本発明の状況で使用されるＵＮＡＡは、それらの塩の形で使用することができる。本明細書に記載のＵＮＡＡの塩は、酸又は塩基付加塩、特に生理学的に許容される酸又は塩基との付加塩を意味する。生理学的に許容される酸付加塩は、塩基型のＵＮＡＡを適切な有機酸又は無機酸で処理することによって形成できる。酸性プロトンを含有するＵＮＡＡは、適切な有機及び無機塩基で処理することによってそれらの無毒性の金属又はアミン付加塩の形態に変換できる。また本発明の文脈で記載されているＵＮＡＡ及びその塩は、それらの水和物及び溶媒付加形態、例えば、水和物、アルコラート等をも含む。

生理学的に許容される酸又は塩基は、特に、ＵＮＡＡ残基を有するＰＯＩの作製に使用される翻訳系により許容されるものである。例えば、生きた真核細胞に対して実質的に非毒性である。

本発明の状況において有用なＵＮＡＡ及びその塩は、当技術分野において周知であり、例えば本明細書に引用した様々な刊行物に記載の方法と同様に作製することができる。

カップリング相手分子の性質は使用目的に依存する。例えば、ＰＯＩは、イメージング法に適した分子と結合していてもよく、又は生物活性分子と結合して官能化されていてもよい。例えば、ドッキング基に加えて、カップリング相手分子は、これらには限定されないが、下記から選択される基を有することができる：色素（例えば、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、ＢＯＤＩＰＹ又はシアニン色素等の蛍光色素、発光色素又は燐光色素）；試薬と接触して蛍光を発することができる分子；発色団（例えば、フィトクロム、フィコビリン、ビリルビン等）；放射性標識（例えば、水素、フッ素、炭素、リン、硫黄又はヨウ素の放射性形態、例えば、トリチウム、^１８Ｆ，^１１Ｃ，^１４Ｃ，^３２Ｐ，^３３Ｐ，^３３Ｓ，^３５Ｓ，^１１Ｉｎ，^１２５Ｉ，^１２３Ｉ，^１３１Ｉ，^２１２Ｂ，^９０Ｙ又は^１８６Ｒｈ等）；ＭＲＩ感受性スピン標識；親和性タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、糖、脂質、ステロール、ＰＥＧリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン又は補助因子）；ポリエチレングリコール基（例えば、分岐状ＰＥＧ、線状ＰＥＧ、様々な分子量のＰＥＧ等）；光架橋剤（ｐ－アジドヨードアセトアニリド等）；ＮＭＲプローブ；Ｘ線プローブ；ｐＨプローブ；ＩＲプローブ；樹脂；固体支持体及び生物活性化合物（例えば、合成薬）。適切な生物活性化合物としては、これらには限定されないが、細胞傷害性化合物（例えば、癌化学療法化合物）、抗ウイルス化合物、生物学的応答調節剤（例えば、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン等）、微小管作用薬、ホルモン調節剤及びステロイド化合物等が挙げられる。有用なカップリング相手分子の具体例としては、これらには限定されないが、受容体／リガンド対の構成要素、抗体／抗原対の構成要素、レクチン／炭水化物対の構成要素、酵素／基質対の構成要素、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、及び、ジゴキシン／抗ジゴキシンが挙げられる。

特に、本明細書に記載のクリック反応により、結合相手分子（のドッキング基）にｉｎ ｓｉｔｕで共有結合する特定のＵＮＡＡ残基（の標識基）の能力は、ＰＯＩを発現する真核細胞内又は組織内でそのＵＮＡＡ残基を有するＰＯＩを検出するために、そしてＰＯＩの分布と結末を研究するために使用できる。具体的には、真核細胞における発現によってＰＯＩを作製するための本発明の方法は、細胞又はその細胞の組織内のＰＯＩを検出するために超解像顕微鏡法（ＳＲＭ）と組み合わせることができる。いくつかのＳＲＭ法が当技術分野において公知であり、本発明の真核細胞によって発現されるＰＯＩを検出するためにクリックケミストリーを利用するように適合させることができる。そのＳＲＭ法の具体例としては、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ（ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのためのＤＮＡ点集積（ＤＮＡ ｐｏｉｎｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）；例えば、Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３１３－３１８，２０１４に記載）、ｄＳＴＯＲＭ（直接確率的光学再構築顕微鏡法）及びＳＴＥＤ（誘導放出抑制）顕微鏡法が挙げられる。

以下の実施例は、単なる例示であり、本明細書に記載された実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書で提供される開示を検討した後、当業者に直ちに明らかになる多数の可能な変形も、本発明の範囲に含まれる。

実験部分
別段の記載がない限り、本発明の文脈で実施されるクローニング工程、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの精製、ニトロセルロース及びナイロンメンブレンへの核酸の転写、ＤＮＡフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖、および組み換えＤＮＡの配列分析は、特に断りのない限り、例えば前掲のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載のように周知の技術を適用して実施される。

Ａ．材料と方法
化学製品
ＴＣＯ－Ｅ、ＴＣＯ^＊ＡおよびＳＣＯはＳｉＣｈｅｍ（ＳＩＲＩＵＳ ＦＩＮＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，ＳＩＣＨＥＭ ＧＭＢＨ，ドイツ）から購入した。
Ｎ^ε－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（Ｂｏｃ）はＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ（ドイツ）から購入した。

細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆ７５２４）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ０７８１）、１％Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｇ７５１３）、および１％ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１３６０）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ ４１９６５－０３９）で培養した。細胞は、３７℃、５％ ＣＯ_２で培養し、２０継代まで２～３日ごとに分割した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）に細胞密度２２０．０００個／ｍｌ、５００μｌ／ウェルで播種した。細胞はトランスフェクションの１６時間前に播種した。トランスフェクションには、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ １１８８０－０２８）を用い、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ ４０８７２７）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。

大腸菌：ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ Ｆ^－ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ） Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ^－ｒｐｓＬ ｎｕｐＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号：１８２９００１５）

培地
２ｘＹＴ培地は自社で調製した。
ＳＯＣ培地は自社で調製した。

構築物のクローニング
哺乳動物細胞における発現のために、先に公表されたように、図１Ａの上図に示したレポータープラスミドｐＣＩ－ｉＲＦＰ－ＥＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}－６Ｈｉｓ（配列番号９７）を使用した（Ｎｉｋｉｃ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｂｕｇｇｉｎｇ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ Ｓｕｐｅｒ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５５，１６１７２－１６１７６（２０１６））。

プラスミドｐＣＭＶ－ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ－Ｕ６ｔＲＮＡｒｖ（配列番号９８）は、それぞれＹ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆ変異とＮ末端ＮＥＳシグナルを含むＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来のＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡ－合成酵素（Ｍｍ ＰｙｌＲＳ^ＡＦ）、ならびにＵ６プロモーターシグナルおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ遺伝子からなる逆方向のｔＲＮＡ発現カセットを担持している（図１Ａの下図）。

合成酵素の進化のために、ＰｙｌＲＳ遺伝子は、Ｒｙａｎ Ｍｅｈｌからの寄贈品であるｐＢＫプラスミドにクローニングされた（Ｃｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｃｏｎｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ３－Ｎｉｔｒｏ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３，１９１６－１９２４（２０１４））。最初に、制限部位ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩを使用して、ＰｙｌＲＳ遺伝子のｂｐｓ８７０～８７５にＢｇｌＩＩ部位を導入した後、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ^ＷＴをｐＢＫプラスミドにクローニングし、カナマイシン耐性カセット（Ｋａｎ）を含むｐＢＫ－ＰｙｌＲＳ^ＷＴプラスミド（配列番号９９）を得た（図１Ｂの上図）。さらに、ＢｇｌＩＩ部位をＰｓｔＩとともに使用して、ＰｙｌＲＳ^ＷＴ合成酵素のこの部分を置換することにより、ＰｙｌＲＳ遺伝子ライブラリーをこのプラスミドに配置した。

合成酵素の進化に使用したプラスミドｐＲＥＰ－ＰｙｌＴ（配列番号１００）（図１Ｂの下図）、ｐＹＯＢＢ２－ＰｙｌＴ（配列番号１０１）およびｐＡＬＳ－ｓｆＧＦＰ^{Ｎ１５０ＴＡＧ}－ＭｂＰｙｌ－ｔＲＮＡ（配列番号１０２）（それぞれ図１Ｃの上図および下図）は、Ｒｙａｎ Ｍｅｈｌ ｌａｂからの寄贈品であった（Ｃｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｃｏｎｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ３－Ｎｉｔｒｏ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３，１９１６－１９２４（２０１４）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｎｉｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４，１３２８－１３３６（２０１９））。

合成酵素の選択手順により抽出したＰｙｌＲＳ合成酵素変異体ＡＦ Ａ１、ＡＦ Ｂ１１、ＡＦ Ｃ１１、ＡＦ Ｇ３、およびＡＦ Ｈ１２をｐＢＫプラスミドからクローニングし、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで消化した後、ｐＣＭＶ－ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ－Ｕ６ｔＲＮＡｒｖに挿入した。ＰｙｌＲＳ^ＡＦの対応するヌクレオチドを置換した。

部位特異的変異誘発
Ｙ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆ変異を欠く合成酵素変異体を得るために、これらのアミノ酸を部位特異的変異誘発によって３０６Ｙおよび３８４Ｙに戻し、２段階のクローニングによってＰｙｌＲＳ変異体Ａ１を得た。プライマーＰｙｌＲＳ Ａ３０６Ｙ ｆｗ（５’ａａｔｃｔｔｔａｔａａｃｔａｔａｔｇｃｇｃａａａｃｔｇｇａｃｃｇｔｇｃ ３’）（配列番号１０３）およびＰｙｌＲＳ Ａ３０６Ｙ ｒｖ（５’ａｔａｇｔｔａｔａａａｇａｔｔｔｇｇｔｇｃｔａｇｃａｔａｇｇｇｃｇｃ ３’）（配列番号１０４）、ならびにプライマー対ＰｙｌＲＳ Ｆ３８４Ｙ ｆｗ（５’ａｔｇｇｔｇｔａｔｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇａｔｇｔｃａｔｇ ３’）（配列番号１０５）およびＰｙｌＲＳ Ｆ３８４Ｙ ｒｖ（５’ｔｇｔｃｇｃｃａｔａｃａｃｃａｔａｃａｇｃｔｇｔｃｇｃｃｃａｃ ３’）（ 配列番号１０６）を使用した。

Ｂ．実施例
実施例１：ＴＣＯ－Ｅを組み込むためのＰｙｌＲＳ合成酵素の進化
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ^ＡＦ変異体（Ｙ３０６Ａ、Ｙ３８４Ｆ）に基づくＮＮＫ合成ライブラリーをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．に発注した。このライブラリーでは、２０個のアミノ酸のいずれかを含むように５つの部位（Ｌ３０５、Ｌ３０９、Ｃ３４８、Ｉ４０５およびＷ４１７）が変異している。これらの位置から２つの終止コドンが除外されるため、５つの部位のそれぞれに３２のバリアントが考えられ、ライブラリーサイズは３．３×１０^７となる。このライブラリーを選択プラスミドｐＢＫ－ＰｙｌＲＳ^ＷＴにクローニングし、ＰｙｌＲＳの結合ポケットをライブラリー遺伝子で置換し、ｐＢＫ－ＰｙｌＲＳ^ｌｉｂを得た。選択用ｐＲＥＰ－ＰｙｌＴを大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、高コンピテントなエレクトロコンピテント細胞を新たに調製した。テトラサイクリン（Ｔｅｔ）を添加したＬＢ培地を用いてＯＤ_６００が０．５になるまで細胞を増殖させた。細胞を回収した後、１０％グリセロールで洗浄した。各回収工程の後に細胞を再懸濁させるために、回収ボトルを振って、ピペッティングの工程を避けて、細胞を静かに混合する必要がある。洗浄工程を２回繰り返し、最終的に細胞をできるだけ少量（１ｍｌの１０％グリセロールで１リットル発現させる場合）採取し、分注した。

１００ｎｇのｐＢＫ－ＰｙｌＲＳ^ｌｉｂを、１ｍｍキュベット中でエレクトロポレーションにより５０μｌのＤＨ１０Ｂ（ｐＲＥＰ－ＰｙｌＴ）細胞に形質転換し、８００μｌのＳＯＣ培地を直接加えた。この工程を１０回繰り返し、細胞を５０ｍｌの振盪フラスコに入れ、３７℃、２００ｒｐｍで１時間振盪し、インキュベートした。形質転換後のライブラリーのカバレッジを推定するため、ＴｅｔとＫａｎを含むＬＢ－寒天プレートを調製し、細胞懸濁液１０μｌを用いて連続希釈（１：１０^２～１：１０^７）を行った。各ＬＢ－寒天プレートに１００μｌの希釈液をプレーティングし、３７℃のインキュベーターで一晩培養した。残りの１０ｍｌの形質転換混合液を、抗生物質としてＴｅｔとＫａｎを含む５００ｍｌの２ｘＹＴ培地に加え、３７℃で一晩振盪培養した。ライブラリーのカバレッジを推定するために、１：１０^６プレート上のコロニー４５個をカウントした。この結果、ライブラリーサイズの１４０倍のカバレッジが得られた。

翌日、細胞を５００ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ培地（Ｔｅｔ、Ｋａｎ）で１：１００に希釈し、ＯＤ_６００が１になるまで増殖させた（通常２～４時間かかる）。最初のポジティブセレクション（正の選択）のために、１ｍＭのＴＣＯ－Ｅと６０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）、Ｔｅｔ、Ｋａｎを含むＬＢ－寒天プレート（１５０ｍｍシャーレ）を１０枚用意した。対照として、Ｃｍを含まないプレートを１枚、同様に調製した。プレートは無菌条件下で調製し、乾燥するまで冷却した。

セレクションを開始するため、培養液１００μｌを１５０ｍｍの各ＬＢ－寒天培地プレートにプレーティングし、ガラスビーズで広げ、炎の横で乾燥させた。プレートを３７℃で一晩、ただし１６時間を超えない範囲で培養した。得られたコロニーを、１プレートあたり５ｍｌの２ｘＹＴ培地を有するプレートから、セルスクレーパーを用いて掻き取った。全１０プレートの細胞懸濁液を５０ｍｌの三角フラスコにプールし、３７℃で１時間振盪した。ライブラリープラスミドを単離するために、まずＭｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＤＮＡを抽出し、続いてゲル抽出を行った。そこでＤＮＡを１％アガロースゲルにロードし、最も低いバンドを切断した。ＤＮＡはゲル抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単離した。ネガティブセレクション（負の選択）用のプラスミド、ｐＹＯＢＢ２－ＰｙｌＴ（２つのアンバー部位（Ｇｌｎ２とＡｓｐ４４）を有するバルナーゼ遺伝子を含む）を、ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、上記のようにエレクトロコンピテント細胞を調製した。１０ｎｇのゲル抽出ライブラリープラスミドを、５０μｌの新しく調製したＤＨ１０Ｂ（ｐＹＯＢＢ２－ＰｙｌＴ）細胞に形質転換し、エレクトロポレーション後に８００μｌのＳＯＣ培地を用いて、１４ｍｌの試験管中で３７℃、２００ｒｐｍで振とうしながら１時間かけて回収した。培養時間の間にネガティブセレクション用のプレートを準備した。１５０ｍｍシャーレ６枚にＬＢ－寒天培地（うち３枚はバルナーゼ発現を誘導するため０．２％アラビノースを含む）をキャストした。すべて、５０μｇ／ｍｌのＫａｎ（ｐＢＫ－ＰｙｌＲＳ^ｌｉｂプラスミド）と３３μｇ／ｍｌのＣｍ（ｐＹＯＢＢ２－ＰｙｌＴプラスミド）を含む。

１００μｌの純粋細胞、および１００μｌの１：１０希釈液と１：１００希釈液を、それぞれ２枚のプレート（１枚はアラビノース入り、もう１枚はアラビノースなし）にプレーティングした。プレートを炎の隣で乾燥させた後、３７℃のインキュベーターで一晩培養した。プレートからコロニーを掻き取り、上記の方法でＤＮＡを抽出した。ポジティブセレクションをもう一度繰り返し、１０ｎｇのゲル抽出したライブラリープラスミドを５０μｌのＤＨ１０Ｂ（ｐＲＥＰ－ＰｙｌＴ）に形質転換し、８００μｌのＳＯＣ培地で、３７℃で１時間振盪して回収した。今回は、３３μｇ／ｍｌ Ｃｍ（Ｋａｎ、Ｔｅｔ）と１ｍＭ ＴＣＯ－Ｅを含む１５ｍｍ ＬＢ－寒天プレート３枚と、ＴＣＯ－Ｅを含まない対照プレート１枚のみを選択に用いた。１００μｌの細胞懸濁液をプレーティングし、３７℃で一晩培養した。生き残ったコロニーをプレートから掻き取り、１％アガロースゲルからライブラリープラスミドを抽出した。

残りのＰｙｌＲＳ変異体のアンバー抑制効率を調べるため、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）に基づく発現試験を行った。そこで、ライブラリーＤＮＡを、Ｎ１５０位にアンバー部位を持つｓｆＧＦＰをコードするプラスミドｐＡＬＳ－ｓｆＧＦＰ^{Ｎ１５０ＴＡＧ}－ＭｂＰｙｌ－ｔＲＮＡと、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ由来のｔＲＮＡ^ＰｙｌともにＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。対照として、ＰｙｌＲＳ^ＷＴをコードするｐＢＫ－ＰｙｌＲＳプラスミドとＰｙｌＲＳ^ＡＦをコードするプラスミドも、ｐＡＬＳ－ｓｆＧＦＰＮ^{１５０ＴＡＧ}－ＭｂＰｙｌ－ｔＲＮＡ（配列番号１０２）プラスミドと共形質転換した。形質転換体をＳＯＣ培地で１時間回収し、様々な量（５０、１００および２００μｌ）を、１ｍＭのＴＣＯ－Ｅを含み、ｎｃＡＡを含まない自動誘導最小培地プレート（Ｋａｎ、Ｔｅｔ）にプレーティングした。コロニーを３７℃で２４時間増殖させ、必要に応じてさらに２４時間室温に置いた。

緑のコロニーを選択し、各ウェルに４８０μｌの非誘導最小培地を含む９６ウェルプレートで一晩培養した。対照（ＰｙｌＲＳ^ＷＴとＰｙｌＲＳ^ＡＦ）も選択し、この９６ウェルプレートで培養した。翌日、９６ウエルプレートを２枚用意し、各ウエルに４８０μｌの自動誘導最小培地を入れ、１枚は１ｍＭ ＴＣＯ－Ｅを入れたプレート、もう１枚は入れないプレートとした。それぞれの一晩培養液２０μｌを、新しい９６ウェルプレートの対応するウェルにピペッティングし、３７℃で２４時間、２５０ｒｐｍで振盪培養した。ｓｆＧＦＰ発現を蛍光測定（ＢＩＯＴＥＫ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）で解析した。そのため、１ウェルあたり１８０μｌの水を含む９６ウェルプレートを用意し、そこに２０μｌのｓｆＧＦＰ発現培養液を対応するウェルにピペッティングした。各発現のＯＤ_６００の違いを補正するために、６００ｎｍでの光学密度スキャンも行った（１５０μｌの水＋５０μｌの発現培養）。

非誘導最小培地を入れた９６ウェルプレートから、目的の各ウェルをさらに分析することができる。例えば、ＰｙｌＲＳ変異体のＤＮＡを配列決定のために抽出し、さらにサブクローニングすることができる。

このようにして、ＰｙｌＲＳ合成酵素変異体ＡＦ Ａ１、ＡＦ Ｂ１１、ＡＦ Ｃ１１、ＡＦ Ｇ３およびＡＦ Ｈ１２が同定された。

実施例２：様々な合成酵素変異体の組み込み効率の推定
実施例１で得られたこれらの新しい新規のＰｙｌＲＳ変異体を、蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）による蛍光レポーターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した。レポーターは、強化した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を融合した赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）を含み、Ｙ３９の位置にアンバー終止コドンを持ち、ｉＲＦＰ－ＥＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}と呼ばれる。それぞれの新しいＰｙｌＲＳ変異体の組み込み効率を解析するために、様々なｎｃＡＡと様々な量のｎｃＡＡを用いた一過性トランスフェクションを行った。

トランスフェクトした細胞はｉＲＦＰを発現することができ、ＦＦＣプロットの縦軸にシグナルを示す。ＰｙｌＲＳ変異体が対応するｎｃＡＡ（この場合はＴＣＯ^＊ＡまたはＴＣＯ－Ｅ）でｔＲＮＡをチャージできる場合、横軸にＥＧＦＰ発現に起因する緑色のシグナルも観察される。

ｉＲＦＰとＥＧＦＰのシグナルは、トランスフェクションの２４時間後に測定した。したがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はトランスフェクションの１６時間前に２４ウェルプレートに播種した。２プラスミドのトランスフェクションには、１ウェルあたり１μｇの全ＤＮＡを用いた。このＤＮＡを、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地５０μｌと混合し、３μｌのＰＥＩを加えた。１０秒間のボルテックスと短い遠心工程の後、ＤＮＡ混合物をフード内で１５分間インキュベートし、その後ウェルに滴下した。マスターミックスは、適切なときにすべてのウェルに調製した。４時間のインキュベーション後、培地を吸引し、様々な濃度のｎｃＡＡを添加した新鮮な培地を加えた。ｎｃＡＡの濃度は２５０μＭであった。２０時間の培養後、フローサイトメーター装置（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてｉＲＦＰおよびＥＧＦＰシグナルを解析した。全てのｎｃＡＡｓのストック溶液は、前述の通り調製した（Ｎｉｋｉｃ，Ｉ．，Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｇｉｒｏｎａ，Ｇ．Ｅ．，Ａｒａｍｂｕｒｕ，Ｉ．Ｖ．＆ Ｌｅｍｋｅ，Ｅ．Ａ．Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｌｉｖｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１０，７８０－７９１（２０１５））．

様々なｎｃＡＡを用いたこれらの発現試験の結果を図２に示す。すべての新しい変異体は、今回試験したＴＣＯ^＊Ａ（図２Ａ）およびＴＣＯ－Ｅ（図２Ｂ）を取り込むことができる。さらに、ＴＣＯ－Ｅを使用した場合、すべての新しい変異体はＰｙｌＲＳ^ＡＦと比較してより高いグリーンシグナルを示した。図２ＣはｎｃＡＡ非存在下での発現プロファイルを示す。

実施例３：嵩高いｎｃＡＡの組み込みに対する変異Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆの重要性の評価
変異Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆが嵩高いｎｃＡＡｓの取り込みに本当に重要かどうかを調べるために、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１変異体について、部位特異的変異誘発によってこれらのアミノ酸を元のアミノ酸残基に戻した。したがって、新しい変異体はＹ３０６ＡとＹ３８４Ｆ変異を含まず、ＰｙｌＲＳ Ａ１と呼ばれる。

ＦＦＣ試験は、ＰｙｌＲＳ Ａ１、ＰｙｌＲＳ ＡＦ、ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１、およびＰｙｌＲＳ ＭＭＡの変異体を用いて、ＴＣＯ^＊Ａ、ＴＣＯ－Ｅ、さらにＢｏｃを用いて行った。ＰｙｌＲＳ ＭＭＡは、変異３０６Ｍ ３０９Ｍ ３４８Ａを有する。図３は、ＦＦＣによって得られたデータを、使用した様々なｎｃＡＡについて棒グラフにしたものである。上段の棒グラフは、ＦＦＣで得られた平均ＧＦＰシグナルを平均ｉＲＦＰシグナルで割った比を示しており、これは組み込み効率を反映している。中段の棒グラフは同じデータを示しているが、１００μＭ ｎｃＡＡを用いたＰｙｌＲＳ ＡＦ変異体で観察された比率で正規化している。下段の棒グラフは、平均ＧＦＰ／平均ｉＲＦＰの比率を、ＰｙｌＲＳ ＡＦ変異体について所望のｎｃＡＡ濃度で得られた平均ＧＦＰ／平均ｉＲＦＰの比率に対して正規化したものである。これらの棒グラフは、ＰｙｌＲＳ ＡＦと比較して、各変異体の組み込み効率がどの程度高いかを示している。

すべての変異体（ＰｙｌＲＳ Ａ１も同様）は嵩高いｎｃＡＡを取り込むことができる。Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆは常に嵩高いｎｃＡＡを組み込むための重要な変異であることが知られていたため、この発見は予想外であり、当技術分野にとって新しいものである。図３Ａは、４つの異なるＰｙｌＲＳ変異体を用いたＴＣＯ－Ｅの組み込みを示す。ＰｙｌＲＳ Ａ１とＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１を用いた場合、最も高い組み込み効率が得られるが、ＰｙｌＲＳ ＡＦを用いた場合はそうではない。図３Ｂでは、ＴＣＯ^＊ＡをｎｃＡＡとして用いたＦＦＣデータにより、組み込み効率を示す。この場合、ＰｙｌＲＳ Ａ１が最良の組み込みを示している。図３ＣはＢｏｃの組み込みのデータを示す。ここでもＰｙｌＲＳ Ａ１が、最も高い組み込み効率を達成できる。

ＴＣＯ－Ｅの場合、使用濃度に依存してＰｙｌＲＳ Ａ１はＰｙｌＲＳ ＡＦよりも最大３０倍優れており、ＴＣＯ^＊Ａの組み込みの場合、ＰｙｌＲＳ Ａ１は使用するｎｃＡＡ濃度とは無関係に１．２倍高い効率を示す。また、Ｂｏｃの場合、ＰｙｌＲＳ Ａ１はＰｙｌＲＳ ＡＦと比較して４．５倍まで高い組み込み効率を示す。

要約すると、新規の変異型ＰｙｌＲＳ Ａ１は、すでに知られているＰｙｌＲＳ ＡＦ変異体と比較して、嵩高いｎｃＡＡｓに対してより優れた合成酵素となる変異を含んでおり、これは文献からは予想外であった。

まとめると、新規の変異型ＰｙｌＲＳ ＭＭＡは、ＰｙｌＲＳ ＡＦと比較して、ＴＣＯ－Ｅの組み込み効率が最大１０倍高い。

本明細書で相互参照されているあらゆる文書の内容は、参照により組み込まれる。

実施例４：新規変異型ＰｙｌＲＳ Ａ１によるシクロオクチン－リジン（ＳＣＯ）の組み込み効率の評価
新規変異型ＰｙｌＲＳ Ａ１による別のｎｃＡＡの組み込み効率を試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて組み込みアッセイを行った。この細胞を、レポータープラスミドｐＣＩ－ｉＲＦＰ－ＥＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}－６Ｈｉｓ（配列番号９７）と共に、対応するｔＲＮＡ^Ｐｙｌ遺伝子も含むＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ Ａ１を含むプラスミドで共トランスフェクトした。細胞のトランスフェクションの４時間後に、１５．６２５μＭから５００μＭの範囲で様々な濃度のＳＣＯを増殖培地に添加した。２０時間のインキュベーション後、ｉＲＦＰとＥＧＦＰのシグナルをフローサイトメーター装置（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて上記の通り解析した。対応するＦＦＣプロットを図５に示す。新しい変異体Ａ１は、ＳＣＯを効率的に組み込むことができる。

上記の本明細書で相互参照した文書の内容は、参照により組み込まれる。

配列一覧
このリストは、本発明の一般的な開示の一部とみなされる。

Claims (20)

1. 改変された古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）であって、
   改変された配列モチーフＭ１およびＭ３の組み合わせを含み；任意に、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６から選択される少なくとも１つのさらなる配列モチーフが組み合わされ、かつＰｙｌＲＳ活性を保持する、改変された古細菌ＰｙｌＲＳ；
   ここで、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６は、改変されたＰｙｌＲＳのアミノ酸配列内において前記順序で配置され、Ｍ１が配列のＮ末端に最も近く、Ｍ６が配列のＣ末端に最も近く、かつ以下の配列を含む：
   Ｍ１：ＬＲＰＭＸ_１ＡＸ_２Ｘ_３Ｌ（Ｙ／Ｍ）Ｘ_５Ｘ_６（Ｍ／Ｖ／Ｃ）Ｒ（配列番号１）
   Ｍ２：ＨＬＸ_７ＥＦＴＭＸ_８ＮＸ_９（Ｇ／Ａ）Ｘ_１１Ｘ_１２Ｇ（配列番号２）
   Ｍ３：ＶＹＸ_１３Ｘ_１４ＴＸ_１５Ｄ（配列番号３）
   Ｍ４：ＳＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＧＰ（Ｒ／Ｉ／Ｎ）Ｘ_２０Ｘ_２１Ｄ（配列番号４）
   Ｍ５：Ｘ_２２Ｘ_２３（Ｉ／Ｖ）Ｘ_２５Ｘ_２６ＰＷ（配列番号５）
   Ｍ６：Ｇ（Ａ／Ｌ／Ｉ）ＧＦＧＬＥＲＬＬ（配列番号６）
   ここで、アミノ酸残基Ｘ_１～Ｘ_２６は、互いに独立して、天然アミノ酸残基から選択される。
2. 配列モチーフＭ１、Ｍ３およびＭ２；またはＭ１、Ｍ３、Ｍ２およびＭ４；またはＭ１、Ｍ３、Ｍ２、Ｍ４およびＭ５および／またはＭ６の組み合わせを含む、請求項１に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
3. Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ属、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ属の古細菌に由来する親ＰｙｌＲＳに由来する、特に、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉｉ種（配列番号５６）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ種（配列番号５８）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ ａｒｃｈａｅｏｎ種（配列番号６０）、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓ種（配列番号６２）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ種（配列番号６４）およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ種（配列番号６６）の古細菌に由来する親ＰｙｌＲＳに由来する、請求項１または２に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
4. 配列番号５６、５８、６０、６２、６４および６６から選択されるアミノ酸配列を有する親ＰｙｌＲＳ、またはその機能的変異体もしくはフラグメントに由来し、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素活性を保持し、天然ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、改変された古細菌ＰｙｌＲＳであって、
   改変された配列モチーフＭ１およびＭ３の組み合わせを含み；任意に、それぞれ請求項１で定義されたＭ２、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６から選択される少なくとも１つのさらなる配列モチーフと組み合わされる、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳであって、
   ａ）配列モチーフＭ１が以下の配列から選択され：
   

   

   ｂ）配列モチーフＭ２が以下の配列から選択され：
   

   

   ｃ）配列モチーフＭ３が以下の配列から選択され：
   

   

   ｄ）配列モチーフＭ４が以下の配列から選択され：
   

   

   ｅ）配列モチーフＭ５が以下の配列から選択され：
   

   

   ｆ）配列モチーフＭ６が以下の配列から選択される：
   

   

   改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
6. 請求項１～４のいずれか一項に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳであって、
   ａ）配列モチーフＭ１が以下の配列から選択され：
   

   

   ｂ）配列モチーフＭ２が以下の配列から選択され：
   

   

   ｃ）配列モチーフＭ３が以下の配列から選択され：
   

   

   ｄ）配列モチーフＭ４が以下の配列から選択され：
   

   

   ｅ）配列モチーフＭ５が以下の配列から選択され：
   

   

   ｆ）配列モチーフＭ６が以下の配列から選択される：
   

   

   改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
7. 配列モチーフＭ１ａ、Ｍ２ａ、Ｍ３ａ、Ｍ４ａ、Ｍ５ａおよびＭ６ａの組み合わせを含む請求項５に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ、または配列モチーフＭ１ａ^＊、Ｍ２ａ^＊、Ｍ３ａ、Ｍ４ａ^＊、Ｍ５ａおよびＭ６ａの組み合わせを含む請求項６に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳであって、
   ａ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ａ１；または配列番号７０に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；あるいは、
   ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ ＭＭＡ；または配列番号７２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；あるいは、
   ｃ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｂ１１；または配列番号８２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；あるいは、
   ｄ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｃ１１；または配列番号８４に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；あるいは、
   ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｇ３；または配列番号８６に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；あるいは、
   ｆ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＰｙｌＲＳ Ｈ１２；または配列番号８８に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＰｙｌＲＳ活性を保持するその機能的フラグメント；
   である改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
9. 以下の機能的特徴の少なくとも１つを示す、請求項１～８のいずれか一項に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ：
   ａ）非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）に対する改変された基質プロファイル；
   ｂ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ（配列番号６８）とそれぞれ比較して、特にＴＣＯ－Ｅ、ＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃから選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用；
   ｃ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１（配列番号１０８）とそれぞれ比較して、特にＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃから選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用。
10. 以下の機能的特徴の少なくとも１つを示す、請求項８のａ）に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ：
    ａ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ（配列番号６８）とそれぞれ比較して、ＴＣＯ－Ｅ、ＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃから選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用；
    ｂ）変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ Ａ１（配列番号１０８）とそれぞれ比較して、ＴＣＯ^＊ＡおよびＢｏｃから選択される少なくとも１つの嵩高いｎｃＡＡの改善された利用。
11. 少なくとも以下の機能的特徴を示す、請求項８のｂ）に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ：
    変異型ＰｙｌＲＳ ＡＦ（配列番号６８）と比較して、嵩高いｎｃＡＡであるＴＣＯ－Ｅの改善された利用。
12. 核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改変された古細菌ＰｙｌＲＳ。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変された古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素をコードする改変されたポリヌクレオチド。
14. ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをさらにコードする請求項１３に記載のポリヌクレオチドであって、
    前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、請求項１３に記載のポリヌクレオチドにコードされるピロリジルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化されうるｔＲＮＡであるか、または請求項１～１２のいずれか一項に定義されるｔＲＮＡである、ポリヌクレオチド。
15. 請求項１３に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドと、請求項１４に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの組み合わせ。
16. ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンが、終止コドン、４塩基コドンおよびレアコドンから選択されるコドンの逆相補体である、請求項１４記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５記載のポリヌクレオチドの組合せ。
17. 以下を含む真核細胞、特に哺乳動物細胞：
    （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
    （ｂ）（ａ）の配列によってコードされるピロリジルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化されうるｔＲＮＡ、またはそのｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列。
18. １つ以上の非天然アミノ酸残基を含む目的のタンパク質（ＰＯＩ）を調製する方法であって、以下の工程を含む方法：
    （ａ）以下を含む真核細胞を提供する工程
    （ｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
    （ｉｉ）ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）；
    （ｉｉｉ）非天然アミノ酸またはその塩；および
    （ｉｖ）ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドであって、非天然アミノ酸残基によって占有されるＰＯＩの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体であるコドンによってコードされる、ポリヌクレオチド；
    ここで、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ｉｉ）を非天然アミノ酸または塩（ｉｉｉ）でアシル化することができる；ならびに、
    （ｂ）真核細胞によるポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能にし、それによってＰＯＩを産生する工程。
19. ポリペプチド結合体を調製する方法であって、以下の工程を含む方法：
    （ａ）請求項１８に記載の方法を使用して、１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むＰＯＩを調製する工程；および
    （ｂ）結合相手分子がＰＯＩの非天然アミノ酸残基に共有結合するように、ＰＯＩを１つ以上の結合相手分子と反応させる工程。
20. 少なくとも１つの非天然アミノ酸またはその塩と、以下を含むキット：
    （ａ）請求項１３、１４もしくは１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；または
    （ｂ）請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ；または
    （ｃ）請求項１７に記載の真核細胞；
    ここで、古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを非天然アミノ酸またはその塩でアシル化することができる。