CN113924103A - 用于用自驱动的嵌合抗原受体来治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

用于用自驱动的嵌合抗原受体来治疗癌症的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了包含抗原结合结构域的自驱动的受表面抗原调节的启动子‑治疗性载荷构建体。还公开了与受表面抗原调节的启动子‑治疗性载荷构建体相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、抗原结合片段和药物组合物。还公开了在对象中治疗或预防癌症的方法、以及在T细胞中制备自驱动的受表面抗原调节的启动子‑治疗性载荷构建体的方法。

Description

用于用自驱动的嵌合抗原受体来治疗癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本PCT专利申请要求于2019年12月27日提交的美国临时专利申请No.62/954,161以及于2019年3月6日提交的美国临时专利申请No.62/814,759的优先权，其各自的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及癌症领域，特别地涉及与治疗性载荷连接的诱导型启动子及其使用方法。
背景技术
癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年就影响近130万新患者，并且是继心血管疾病之后的第二大死因，占死亡的约四分之一。实体瘤是造成这些死亡中的大多数的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面有显著的进展，但是在过去20年里，所有癌症的总体5年存活率仅提高了约10％。癌症或恶性肿瘤以不受控制的方式转移和迅速生长，这使治疗极为困难。
多发性骨髓瘤(“multiple myeloma，MM”)是使人衰弱且通常不可治愈的疾病，在美国每年诊断出超过30,000例新病例(来源：MM研究基金会)。在美国，MM是继非霍奇金淋巴瘤(“Non-Hodgkin’s Lymphoma，NHL”)之后的第二大最普遍的血液癌(Smith L，McCourt O，Henrich M等，Multiple myeloma and physical activity：a scoping review.BMJOpen.2015；5：e009576)。MM影响骨髓中的浆细胞，并且可导致骨髓衰竭和患者死亡(国家癌症研究所.A snapshot of myeloma.2014年11月5日.参见万维网cancer.gov)。骨髓瘤的并发症包括骨痛、骨质丢失、贫血、免疫抑制、肾功能障碍、神经病(Mayo Clinicstaff.Diseases and conditions：multiple myeloma：treatments and drugs.2015年12月4日)。
MM的一线治疗包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、类固醇、组蛋白脱乙酰酶(“histone deacetylase，HDAC”)抑制剂和化学治疗。这些方法旨在杀伤MM细胞，然而，它们中的许多还与广泛的免疫抑制和全身性毒性相关。
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR T)技术为恶性血液病(像MM)的治疗带来巨大进步，并且对实体瘤的治疗提供广阔前景。然而，该技术目前尚未解决的两个缺点是：在一个方面，CAR T效力不足和响应欠佳，并且在另一个方面，由于过度CAR T活化引起有害副作用，例如细胞因子释放综合征。本发明的目的是通过产生可在治疗过程中的任何给定时间处以及在任何局部微环境中基于患者的肿瘤负荷和炎性环境自然地微调(fine-tuned)的CAR T部分和其他治疗性载荷来解决这两个问题。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是包含三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序，(2)连接/跨膜基序，以及(3)胞内T细胞信号传导基序(Long AH，Haso WM，Orentas RJ.Lessons learned from a highly-active CD22-specificchimeric antigen receptor.Oncoimmunology.2013；2(4)：e23621)。CAR的抗原结合基序通常在免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)分子的最小结合结构域单链可变片段(singlechain Fragment variable，ScFv)之后形成。还已经改造了替代的抗原结合基序，例如受体配体(例如，IL-13已被改造为结合肿瘤表达的IL-13受体)、完整的免疫受体、文库来源的肽和固有免疫系统效应分子(例如NKG2D)。用于CAR表达的替代细胞靶标(例如NK或γ-δT细胞)也在开发中(Brown CE等.Clin Cancer Res.2012；18(8)：2199-209；Lehner M等.PLoSOne.2012；7(2)：e31210)。关于限定最活跃的T细胞群以用CAR载体进行转导，确定最佳培养和扩增技术，以及限定CAR蛋白质结构本身的分子细节，仍然有重要的工作。
CAR的连接基序可以是相对稳定的结构结构域，例如IgG的恒定结构域，或设计成延伸的柔性接头。可使用结构基序(例如来源于IgG恒定结构域的那些)来使ScFv结合结构域延伸远离T细胞质膜表面。这对于其中结合结构域特别接近肿瘤细胞表面膜的一些肿瘤靶标(例如对于二唾液酸神经节苷脂GD2；Orentas等，未发表的观察结果)来说可以是重要的。迄今为止，CAR中使用的信号传导基序总是包含CD3-ζ链，因为该核心基序是T细胞活化的关键信号。首次报道的第二代CAR的特征在于CD28信号传导结构域和CD28跨膜序列。该基序也用于包含CD137(4-1BB)信号传导基序的第三代CAR中(Zhao Y等，J Immunol.2009；183(9)：5563-74)。随着利用与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠来活化T细胞的新技术的出现，来自CD28的经典“信号2”的存在不再需要由CAR本身编码。使用珠活化，发现第三代载体在体外测定中并不优于第二代载体，并且它们在白血病的小鼠模型中并不提供优于第二代载体的明显益处(Haso W，Lee DW，Shah NN，Stetler-Stevenson M，Yuan CM，Pastan IH，Dimitrov DS，Morgan RA，FitzGerald DJ，Barrett DM，Wayne AS，Mackall CL，OrentasRJ.Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acutelymphoblastic leukemia.Blood.2013；121(7)：1165-74；Kochenderfer JN等，Blood.2012；119(12)：2709-20)。第二代CD28/CD3-ζ中CD19特异性CAR的临床成功(Lee DW等，American Society of Hematology Annual Meeting.New Orleans，LA；十二月，7-10，2013)和CD137/CD3-ζ信号传导形式(Porter DL等，N Engl J Med.2011；365(8)：725-33)证实了这一点。除CD137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如OX40)也能够在CAR转导的T细胞中提供重要的持久信号(Yvon E等，Clin Cancer Res.2009；15(18)：5852-60)。培养CAR T细胞群的培养条件同样重要。
基于T细胞的免疫治疗已成为合成生物学中的新前沿；考虑了多种启动子和基因产物以将这些高度强效的细胞引导至肿瘤微环境，在那里T细胞既可逃避负调节信号，又可介导有效的肿瘤杀伤。通过诱导型胱天蛋白酶9(caspase 9)构建体与AP1903的药物诱导的二聚化消除不期望的T细胞示出了这样一种方式，其中可药理学地启动可控制T细胞群的强大开关(Di Stasi A等，N Engl J Med.2011；365(18)：1673-83)。通过显性负受体的表达来产生对转化生长因子-β的负调节作用免疫的效应T细胞群进一步示出效应T细胞可被改造以达到最佳抗肿瘤活性的程度(FosterAE等，J Immunother.2008；31(5)：500-5)。因此，尽管CAR似乎能够以类似于内源性T细胞受体的方式触发T细胞活化，但迄今为止这种技术的临床应用的主要障碍一直限于CAR+T细胞的体内扩增、输注之后细胞的迅速消失、以及令人失望的临床活性。
迄今为止，现有技术的CAR治疗方法采用在以下组成型启动子控制下的CAR T构建体：例如人延伸因子1α(elongation factor 1 alpha，EF1α)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)、鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)、鼠干细胞病毒(murine stem cell virus，MSCV)或本领域中已知的其他组成型启动子，这些组成型启动子通常以高水平表达或是人工诱导的(通过小分子或可溶性组分)。这些方法不适用于抗原表达的动力学，这可在细胞水平上导致效应细胞响应过度或不足，并且在生物体水平上导致对患者的治疗不足或治疗过度和毒性。
因此，在本领域中对于发现用于使用可表现出特异性的和有效的抗肿瘤作用而没有上述缺点(例如高毒性、效力不足)的方法来治疗MM和CLL的新组合物和方法存在迫切且长期的需求。
本发明通过提供可用于治疗癌症和其他疾病和/或病症的组合物和治疗方法解决了这些需求。特别地，如本文中公开和描述的，本发明提供了可用于治疗与例如但不限于以下的多种抗原的表达失调相关的疾病、障碍或病症的诱导型启动子-治疗性载荷构建体：间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38，或其组合，并且该诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含抗原特异性结合结构域，其在经转导T细胞上表现出高表面表达，并表现出高度的细胞裂解和经转导T细胞在体内的扩增和持续性。此外，如本文中公开和描述的，本发明通过利用受表面抗原调节的诱导型启动子提供了对这样的治疗性载荷的自驱动(self-driving)调节，所述启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平。
发明概述
如本文中公开和描述的，本发明基于出乎意料的发现：对治疗性载荷构建体的受表面抗原调节的启动子的表达的调整或调节可与治疗性载荷的活性直接相关，并因此与靶细胞环境中的表面抗原的表达水平直接相关。
本文中提供了新的自驱动的诱导型启动子-载荷治疗性构建体，其包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平。
不受任何特定作用机制的限制，本文中使用的“自驱动的”受表面抗原调节的诱导型启动子是指利用受表面抗原调节的诱导型启动子驱动治疗性载荷，以在不存在肿瘤靶抗原表达的情况下提供低基础水平的治疗性载荷表面表达。在靶细胞表面上存在靶抗原活化的情况下，治疗性载荷被活化，这触发了可适用的信号转导途径的激活，从而活化受表面抗原调节的诱导型启动子的信号调节子，由此导致治疗性载荷的表达提高至高于基础表达水平。
以这种方式，产生了一个正反馈环，由此给定靶抗原的较高表达导致治疗性载荷的较高表达并且反之亦然，从而导致对治疗性载荷表达的有效调节以实现针对在特定位点和时间下存在的靶标水平精确调整的T细胞响应。治疗性载荷表达的提高导致最佳的抗肿瘤活性和靶肿瘤细胞的快速消除。随着肿瘤细胞量的降低/去除，治疗性载荷表达水平恢复至其基础表达水平。
在一个方面中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与包含含有SEQ IDNO：137和138或其组合的核苷酸序列的受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在一个方面中，本文中提供了自驱动的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体、以及表达所述受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的宿主细胞(例如，T细胞)和编码所述受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体的核酸分子，所述自驱动的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的至少一种治疗性载荷，所述治疗性载荷包含嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA或蛋白酶，或其组合，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含STAT5响应元件、AP-1响应元件或NFκB响应元件、或其组合，该受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平。
在一个实施方案中，一种或更多种治疗性载荷(例如但不限于基于嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA或蛋白酶的)在受表面抗原调节的诱导型启动子的控制下表达，其中通过2A核糖体跳读序列或内部核糖体进入序列(internal ribosome entry sequence，IRES)或其组合分离一种或更多种治疗性载荷。
在一个方面中，本文中公开的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体可包含例如但不限于CAR，所述CAR可包含在效应细胞表面上表达的单一分子，或者可包含效应细胞表达的信号传导模块和可溶性靶向模块，使得当可溶性靶向模块与细胞表达的信号传导模块结合时，形成完整的功能性CAR。CAR在经转导T细胞上表现出高表面表达，具有高度的细胞裂解以及经转导T细胞在体内的扩增和持续性。还提供了使用所公开的CAR、宿主细胞和核酸分子例如来在对象中治疗癌症的方法。还提供了使用所公开的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体、宿主细胞和核酸分子例如来调节治疗性载荷的表达的方法。
在一个方面中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷的分离的多核苷酸，其中治疗性载荷与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接，并且其中所述治疗性载荷包含含有选自以下的片段的CAR：Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv(ScFv)。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷的分离的核酸分子，其中所编码的胞外抗原结合结构域包含与以下结合的抗体的至少一个单链可变片段：间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷的分离的核酸分子，其中所编码的胞外抗原结合结构域包含与以下结合的抗体的至少一个重链可变区：间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
在一个方面中，提供了编码受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的多核苷酸，其中治疗性载荷与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接，并且其中所述治疗性载荷包含这样的CAR：从N端至C端包含至少一个胞外结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个胞外结合结构域包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
因此，在一个实施方案中，提供了编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的基于CAR的治疗性载荷的分离的多核苷酸，其中所述基于CAR的治疗性载荷的至少一个间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO：7、9、11、15、17、19、21、23、25、87、89、91、93、95、97、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135的核酸序列。
在一个实施方案中，提供了编码与至少一种受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的基于CAR的治疗性载荷的分离的多核苷酸，其中所述基于CAR的治疗性载荷的至少一个间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的多核苷酸，其中治疗性载荷与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接，并且其中所述治疗性载荷包含这样的CAR：从N端至C端包含至少一个胞外结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个胞外结合结构域包含选自SEQ ID NO：7、9、11、15、17、19、21、23、25、87、89、91、93、95、97、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135或其组合的核酸序列。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的多核苷酸，其中所述治疗性载荷与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接，并且其中所述治疗性载荷包含这样的CAR：从N端至C端包含至少一个胞外结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个胞外结合结构域包含选自SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136或其组合的氨基酸序列。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子基于CAR的治疗性载荷构建体的靶向结构域以单克隆抗体、ScFv Fab、Fab’2的形式单独表达并且包含与另外的结合标签或表位偶联的至少一个间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原靶向结构域，所述抗原靶向结构域包含选自SEQ ID NO：7、9、11、15、17、19、21、23、25、87、89、91、93、95、97、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135的核酸序列，其中CAR的效应细胞表达的组分包含结合结构域，所述结合结构域被特异性针对以结合可溶性CAR模块上表达的标签或表位，例如CAR的可溶性组分与CAR的细胞结合组分的特异性结合形成完整的功能性CAR结构。
在另一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的靶向结构域以单克隆抗体、ScFv Fab、Fab’2的形式单独表达并且包含至少一个间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原靶向结构域和另外的ScFv，所述抗原靶向结构域包含选自SEQ ID NO：7、9、11、15、17、19、21、23、25、87、89、91、93、95、97、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135的核酸序列，而CAR的效应细胞表达的组分包含与可溶性CAR模块上表达的另外的ScFv特异性反应的标签或表位，例如CAR的可溶性组分与CAR的细胞结合组分的特异性结合形成完整的功能性CAR结构。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的CAR胞外抗原结合结构域还包含至少一种与间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域或其组合结合的基于脂质运载蛋白(lipocalin)的抗原结合抗原(anticalin)。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123、或CD38抗原结合结构域通过接头结构域与跨膜结构域连接。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123、或CD38抗原结合结构域之前是编码前导或信号肽的序列。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，所述构建体包含由包含选自以下的核酸序列的核苷酸序列编码的至少一个抗原结合结构域：SEQ ID NO：7、9、11、15、17、19、21、23、25、87、89、91、93、95、97、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和135，并且其中所述CAR另外编码靶向包括但不限于以下的抗原的胞外抗原结合结构域：CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、CD5、CD7、CD138、BCMA(CD269)、ROR1、TSLPR、TEM-1、TEM-7、TEM-8、TEM-9、CD371、CD276、CD99、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、PRAME TCR、KRAS TCR，或其任意组合。
在某些实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中另外编码的胞外抗原结合结构域包含抗CD19 ScFv抗原结合结构域、抗CD20 ScFv抗原结合结构域、抗CD22 ScFv抗原结合结构域、抗ROR1ScFv抗原结合结构域、抗间皮素ScFv抗原结合结构域、抗CD33 ScFv抗原结合结构域、抗CD38 ScFv抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)ScFv抗原结合结构域、抗CD138 ScFv抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)ScFv抗原结合结构域、抗GPC2 ScFv抗原结合结构域、抗GPC3 ScFv抗原结合结构域、抗FGFR4 ScFv抗原结合结构域、抗c-Met ScFv抗原结合结构域、抗PMSAScFv抗原结合结构域、抗糖脂F77 ScFv抗原结合结构域、抗EGFRvIII ScFv抗原结合结构域、抗GD-2 ScFv抗原结合结构域、抗NY-ESo-1 TCR ScFv抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCRScFv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在一个方面中，本文中提供的基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含接头或间隔区结构域。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38或其组合的胞外抗原结合结构域、胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与跨膜结构域连接。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来源于CD8、TNFRSF19或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的CAR还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，TNFRSF19和CD154，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域布置在相对于CD3ζ胞内结构域的C端侧。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其组合。
在另一些实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其组合。
在一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其还包含前导序列或信号肽，其中前导或信号肽核苷酸序列包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：43的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，提供了编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的分离的核酸分子，其中所编码的前导序列包含SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44的氨基酸序列。
在一个方面中，本文中提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其从N端至C端包含至少一个抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。
在一个实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中所述胞外抗原结合结构域包含与抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段，或与抗原结合的抗体的至少一个重链可变区，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中所述至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其组合。
在一些实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中CAR另外编码包含以下的胞外抗原结合结构域：CD19、CD20、CD22、CD19/22、ROR1、间皮素、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在一个实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中所述胞外抗原结合结构域包含抗CD19 ScFv抗原结合结构域、抗CD20 ScFv抗原结合结构域、抗CD22 ScFv抗原结合结构域、抗ROR1 ScFv抗原结合结构域、抗间皮素ScFv抗原结合结构域、抗CD33 ScFv抗原结合结构域、抗CD38 ScFv抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)ScFv抗原结合结构域、抗CD138 ScFv抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)ScFv抗原结合结构域、抗GPC2 ScFv抗原结合结构域、抗GPC3 ScFv抗原结合结构域、抗FGFR4 ScFv抗原结合结构域、抗c-Met ScFv抗原结合结构域、抗PMSA ScFv抗原结合结构域、抗糖脂F77ScFv抗原结合结构域、抗EGFRvIII ScFv抗原结合结构域、抗GD-2 ScFv抗原结合结构域、抗NY-ESo-1 TCR ScFv抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCR ScFv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中所述胞外抗原结合结构域包含仅免疫球蛋白可变重链(VH)抗CD19抗原结合结构域、抗CD20 VH抗原结合结构域、抗CD22 VH抗原结合结构域、抗ROR1 VH抗原结合结构域、抗间皮素VH抗原结合结构域、抗CD33 VH抗原结合结构域、抗CD38 VH抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)VH抗原结合结构域、抗CD138 VH抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)VH抗原结合结构域、抗GPC2 VH抗原结合结构域、抗GPC3 VH抗原结合结构域、抗FGFR4 VH抗原结合结构域、抗c-Met VH抗原结合结构域、抗PMSA VH抗原结合结构域、抗糖脂F77 VH抗原结合结构域、抗EGFRvIII VH抗原结合结构域、抗GD-2 VH抗原结合结构域、抗NY-ESO-1 TCRVH抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCR VH抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中所述胞外抗原结合结构域包含能够特异性结合靶抗原的蛋白质或肽(P)序列，其可来源于包含以下的天然或合成序列：抗CD19 P抗原结合结构域、抗CD20 P抗原结合结构域、抗CD22 P抗原结合结构域、抗ROR1 P抗原结合结构域、抗间皮素P抗原结合结构域、抗CD33 P抗原结合结构域、抗CD38 P抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)P抗原结合结构域、抗CD138 P抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)P抗原结合结构域、抗GPC2 P抗原结合结构域、抗GPC3 P抗原结合结构域、抗FGFR4 P抗原结合结构域、抗c-Met P抗原结合结构域、抗PMSA P抗原结合结构域、抗糖脂F77 P抗原结合结构域、抗EGFRvIII P抗原结合结构域、抗GD-2 P抗原结合结构域、抗NY-ESO-1TCR P抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCR P抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。在另一个实施方案中，提供了CAR，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
在另一个实施方案中，提供了基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其组合。
在另一个实施方案中，编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸序列包含SEQ ID NO：139的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体。
在另一个实施方案中，编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸序列包含SEQ ID NO：140的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体。
在另一个实施方案中，编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸序列包含SEQ ID NO：77的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体。
在一个方面中，本文中公开的受表面抗原调节的诱导型启动子基于CAR的治疗性载荷构建体被修饰以表达或包含可检测标志物以用于诊断、监测和/或预测治疗结果(例如癌症患者的无进展存活)或用于监测这样的治疗的进展。
在一个实施方案中，编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸分子可包含在载体，例如病毒载体中。载体是DNA载体、RNA载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，或其组合。
在另一个实施方案中，表达基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的载体还可被修饰以包含一个或更多个控制CAR T细胞表达或借助自杀开关来消除CAR-T细胞的操纵元件。自杀开关可包括例如凋亡诱导性信号传导级联反应或诱导细胞死亡的药物。在一个优选实施方案中，表达CAR的载体还可被修饰以表达酶，例如胸苷激酶(thymidine kinase，TK)或胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)。
在另一个方面中，还提供了包含编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞，例如从对象获得的原代T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CD8+T细胞。
在一个方面中，本文中提供了包含编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷的分离的核酸分子的经转导T细胞，其中受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体赋予所述经转导CAR T细胞以下能力：根据靶细胞上表面抗原的表达水平提高(mount)抗肿瘤响应，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在另一个方面中，本文中提供了包含编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的CAR的分离的核酸分子的经转导CAR T细胞，其中受表面抗原调节的诱导型启动子CAR构建体赋予所述经转导CAR T细胞以下能力：根据靶细胞上相应表面抗原的表达水平提高抗肿瘤响应，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶表面抗原水平精确调节的CAR T细胞响应，其中i)在不存在肿瘤靶表面抗原表达的情况下，受表面抗原调节的诱导型启动子赋予低基础水平的CAR表达；ii)在靶细胞表面上存在靶表面抗原活化的情况下，CAR被活化，这触发了可适用的信号转导途径的激活，从而活化受表面抗原调节的诱导型启动子的信号调节子，由此导致CAR的表达提高至高于基础表达水平；iii)给定靶表面抗原的较高表达导致CAR的较高表达并且反之亦然，从而导致对CAR表达的有效调节以实现针对在特定位点和时间下存在的靶标水平精确调整的CAR T细胞响应；iv)CAR表达的提高导致最佳的抗肿瘤活性和靶肿瘤细胞的快速消除；以及v)随着肿瘤细胞量的降低/去除，CAR的表达水平恢复至其基础表达水平。
在一个实施方案中，具有提高的CAR表达的经转导T细胞导致最佳的抗肿瘤活性和靶肿瘤细胞的快速消除，使得随着肿瘤细胞量的降低/去除，治疗性载荷表达水平恢复至基础表达水平(参见，前抗肿瘤响应表达水平)。
在一个实施方案中，经转导T细胞是自体的。在另一个实施方案中，经转导T细胞是同种异体的。
在另一个方面中，提供了包含抗肿瘤有效量的人T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含含有选自以下的氨基酸序列的抗原结合结构域：SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136；其中所述T细胞是患有癌症的人的T细胞。所述癌症尤其包括血液学癌症(hematological cancer)，例如白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML))、淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma))或多发性骨髓瘤(MM)，或其组合。
在一个实施方案中，提供了药物组合物，其中基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，间皮素，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中人癌症包括成人上皮癌(adultcarcinoma)，其包括口腔和咽癌(oral and pharynx cancer)(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌症、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿科肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma))、中枢神经系统的肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶(orbit)、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了包含抗肿瘤有效量的患有癌症之人的人T细胞群的药物组合物，其中所述癌症是对一种或更多种化学治疗剂不具有响应性的难治性癌症。所述癌症包括造血系统癌症(hematopoietic cancer)、骨髓增生异常综合征、胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、成人B细胞恶性肿瘤(包括CLL(慢性淋巴细胞白血病)、CML(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、儿科B细胞恶性肿瘤(包括B谱系ALL(急性淋巴细胞白血病))中的微小残留病(minimal residual disease，MRD)、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤或其他血液学癌症和实体瘤，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体通过利用基于天然细胞活化、促分裂状态或其组合的天然效应细胞途径来调节治疗性载荷的活性。
在另一个方面中，提供了制备包含CAR的T细胞(以下称为“CAR-T细胞”)的方法。所述方法包括用包含受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷、编码所公开的CAR的载体或核酸分子转导T细胞，从而制备CAR-T细胞，所述所公开的CAR特异性结合间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38，或其组合。
在另一个方面中，提供了产生RNA经改造细胞群的方法，其包括将包含受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷、编码所公开的CAR的核酸分子的体外转录RNA或合成RNA引入到对象的细胞中，从而产生CAR T细胞。
在另一个方面中，提供了用于诊断与细胞中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的表达相关的疾病、障碍或病症的方法，所述构建体包含选自SEQ ID NO：139、140和141或其组合的核苷酸序列，所述方法包括使所述细胞与人抗间皮素、抗CD33、抗CD19、抗CD19/CD20、抗CD22、抗ROR1、抗CD123或抗CD38抗体或其片段、或其组合接触，其中所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136或其组合的氨基酸序列；以及b)检测抗原间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、ROR1、CD123或CD38或其组合的存在，其中间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、ROR1、CD123或CD38或其组合的存在诊断与间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、ROR1、CD123或CD38或其组合的表达相关的疾病、障碍或病症。
在一个实施方案中，与间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38或其组合的表达相关的疾病、障碍或病症是癌症，其包括造血系统癌症、骨髓增生异常综合征、胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成人B细胞恶性肿瘤(包括CLL(慢性淋巴细胞白血病)、CML(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(NHL))、儿科B细胞恶性肿瘤(包括B谱系ALL(急性淋巴细胞白血病))中的微小残留病(MRD)、多发性骨髓瘤(MM)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤或其他血液学癌症和实体瘤，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中对间皮素-、CD33-、CD19-、CD19/CD20-、CD22-、CD19/22-、ROR1-、CD123-或CD38-(或其组合)相关疾病进行诊断、预后或确定风险的方法，其包括检测来源于哺乳动物的样品中间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38或其组合的表达，包括：a)使所述样品与包含人抗间皮素、抗CD33、抗CD19、抗CD19/CD20、抗CD22、抗CD19/22、抗ROR1、抗CD123、或抗CD38、(或其组合)抗体或其片段的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体接触，其中所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136的氨基酸序列；以及b)检测一种或更多种抗原的存在，其中所述抗原的存在诊断哺乳动物中的间皮素、CD33-、CD19、CD19/CD20-、CD22-、CD19/22-、ROR1-、CD123-或CD38-相关疾病。
在另一个实施方案中，提供了重定向CAR抗原靶标的方法，其包括使细胞与包含人抗间皮素、抗CD33、抗CD19、抗CD19/CD20、抗CD22、抗CD19/22、抗ROR1、抗CD123或抗CD38抗体或其片段的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体接触，其中所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细胞选自表达间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞和其任意组合。
在另一个方面中，提供了用于在哺乳动物中诱导抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的用受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体转导的T细胞，所述T细胞包含编码所公开的治疗性载荷，例如但不限于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA或蛋白酶、或其组合的载体或核酸分子。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以在哺乳动物中有效治疗或预防癌症的量向所述哺乳动物施用一种或更多种所公开的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体。所述方法包括在以下条件下向对象施用治疗有效量的表达特异性结合间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38和/或一种或更多种前述抗原的所公开的CAR的宿主细胞，所述条件足以在所述对象中形成CAR上的抗原结合结构域与间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38和/或一种或更多种前述抗原的胞外结构域的免疫复合体。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用包含一种或更多种所公开的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的药物组合物，所述药物组合物包含抗肿瘤有效量的T细胞群，其中所述T细胞包含编码CAR的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个胞外间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136或其任意组合的氨基酸序列，并且其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。
在另一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用包含一种或更多种所公开的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的药物组合物，所述药物组合物包含抗肿瘤有效量的T细胞群，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ IDNO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136或其任意组合的氨基酸序列，其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。在前述方法的一些实施方案中，所述至少一个跨膜结构域包含以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，间皮素，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了用于在被诊断患有癌症的人中产生持续性经遗传改造T细胞群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向人施用经遗传改造以表达受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)的T细胞，其中自驱动的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体包含至少一个间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：8、10、12、16、18、20、22、24、26、88、90、92、94、98、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136或其任意组合的氨基酸序列，其中在施用之后，所述持续性经遗传改造T细胞群或所述T细胞的后代群在人中持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年或3年。
在一个实施方案中，人中的后代T细胞包含记忆T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞是自体T细胞。
在本文中所述方法的所有方面和实施方案中，与肿瘤抗原表达升高相关的任何前述癌症、疾病、障碍或病症均可使用本文中所公开的一种或更多种受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体来治疗或预防或改善。
为避免疑义，本文中公开的说明书和权利要求书以附带条件的方式特别地排除了如分别在美国专利No.9.670,281(2017年6月6日授权，标题为Binding-triggeredtranscriptional switches and methods of use thereof)和美国专利No.9,834,608(2017年12月5日授权)(Wendell A.Lim等)中阐述的Syn-Notch构建体以及在美国专利No.8,556,882(2013年10月15日授权)(Richard A.Morgan等)中阐述的IL-12的受NFAT调节的表达。
在另一个方面中，提供了用于在如上文所述的T细胞中制备受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体或用于在对象中预防、治疗或改善如上文所述的与肿瘤抗原表达升高相关的任何癌症、疾病、障碍或病症的药盒(kit)，所述药盒包含含有上文所公开的核酸分子、载体、宿主细胞或组合物的任一种或其任意组合的容器，以及使用所述药盒的说明书。
应理解，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体、宿主细胞、核酸以及方法在本文中详细描述的具体方面和实施方案之外是可用的。从下面参照附图进行的详细描述中，本公开内容的前述特征和优点将变得更明显。
附图简述
图1描绘了自驱动的STAT5 CAR通过IL-2途径和AP1/NFκB CAR通过细胞因子/CAR刺激途径的正调节的示意图。
图2描绘了STAT5和AP1/NFκB诱导型CAR LTG1563以及组成型EF1α-驱动的CARLTG1563的结构。
图3描绘了在一名健康供体(2名供体中的代表性的)中，在STAT5和AP1/NFκB诱导型CAR LTG1563中，通过细胞因子驱动的正反馈环对CAR表达的诱导。T细胞在活化之后5天(转导之后4天)，用不同浓度的IL2和TNFα处理18小时。
图4描绘了与EF1α驱动的组成型CAR相比，受AP1/NFκB调节的自驱动的CARLTG1563在抗原暴露之后表现出CAR表达的快速恢复。在2名健康供体中，在与Raji细胞初始共培养之后，自驱动的CAR构建体和EF1α驱动的组成型CAR构建体的表达受诱导型STAT5&AP1/NFκB启动子的调节。细胞在D0时用TransAct试剂活化，在D1时用MOI为10的LV载体转导，并从活化之后D2至D6用0IU/mL IL-2或30IU/mL IL2洗涤和处理。从活化之后D6开始，将CAR LTG1563 T细胞与Raji-GFP(CD19+)细胞一起以效应物：靶标比为1∶3共培养。示出了2名中的一名代表性供体的共培养(D6)之前和共培养之后1天(D7)的CAR表达。
图5A至5C描绘了在CAR LTG1563 T细胞由AP1-NFκB-正反馈环调节的情况下，优越的Raji肿瘤杀伤和T细胞扩增，(图5A)长期杀伤测定：共培养时间进程图。细胞在D0时用TransAct试剂活化，在D1时用MOI为10的LV载体转导，并从活化之后D2至D6用0IU/mL IL-2或30IU/mL IL2洗涤和处理。从活化之后D6至D13，将CAR LTG1563 T细胞与Raji-GFP(CD19+)细胞一起以效应物∶靶标比为1∶3共培养(共培养1)，并且从D13至D20，将细胞用Raji-GFP细胞再刺激。(图5B)在共培养1期间的CAR LTG1563依赖性的Raji细胞毒性。(图5C)在共培养1&2期间的CAR LTG1563依赖性的T细胞扩增。(图5B、图5C)。n＝3名供体(*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；双因素ANOVA与Tukey校正)。
图6描绘了具有另外的辅助组分(例如，显性负受体)的AP1/NFκB诱导型和组成型EF1α驱动的CAR：CAR LTG1563-TGFBRIIdn、CAR LTG1563-PD1dn和CAR LTG1563-PD1dn-TGFBRIIdn的结构。
图7A至7C描绘了与EF1α驱动的组成型CAR相比，具有另外的辅助组分的受AP1/NFKB调节的自驱动的CAR LTG 1563在抗原暴露之后表现出载荷(CAR和相关辅助组分：TGFBRIIdn、PD1dn)表达的快速诱导。在2名健康供体中，在与Raji细胞初始共培养之后，自驱动的CAR构建体和EF1α驱动的组成型CAR构建体的表达受诱导型AP1/NFκB启动子的调节。细胞在D0时用TransAct试剂活化，在D1时用MOI为10的LV载体转导，并从活化之后D2至D5用30IU/mL IL2洗涤和处理。从活化之后D5开始，将CAR LTG1563 T细胞与Raji-GFP(CD19+)细胞一起以效应物∶靶标比为1∶3共培养。示出了2名中的一名代表性供体的共培养(D5)之前和共培养之后1天(D6)的CAR、TGFBRII和PD1表达。
图8A至8C描绘了在CAR LTG 1563(具有另外的辅助组分)T细胞免受TGF-β抑制的情况下，优越的Raji肿瘤杀伤和T细胞扩增。(图8A)长期杀伤测定的共培养时间进程图。细胞在D0时用TransAct试剂活化，在D1时用LV载体(0.5％v/v)转导，并从活化之后D2至D5用0IU/mL IL-2或30IU/mL IL2洗涤和处理。从活化之后D5至D9，在存在或不存在10ng/mLTGF-β的情况下将CAR LTG1563 T细胞与Raji-GFP(CD19+)细胞一起以效应物∶靶标比为1∶3共培养(共培养1)；从D9至D13，在存在或不存在10ng/mL TGF-β的情况下将细胞用Raji-GFP细胞再刺激(共培养2)，以及从D13至19，在存在或不存在10ng/mL TGF-β的情况下将细胞用Raji-GFP细胞再刺激(共培养3)。(图8B)在共培养1至3期间的CAR LTG1563依赖性的T细胞扩增。(图8C)在共培养1至3期间的CAR LTG1563依赖性的Raji细胞毒性。(图8B、图8C)。n＝2名供体。
图9A至9C描绘了在CAR LTG 1563(具有另外的辅助组分)T细胞免受TGF-β抑制的情况下，优越的Raji肿瘤杀伤和较少的T细胞耗竭。(图9A)长期杀伤测定的共培养时间进程图。细胞在D0时用TransAct试剂活化，在D1时用LV载体(0.5％v/v)转导，并从活化之后D0至D8用30IU/mL IL2洗涤和处理。从活化之后D8至D14，在存在或不存在10ng/mL TGF-β的情况下将CAR LTG1563 T细胞与Raji-GFP(CD19+)细胞一起以效应物∶靶标比为1∶3共培养(共培养1)；从D14至D20，在存在或不存在10ng/mL TGF-β的情况下将细胞用Raji-GFP细胞以效应物∶靶标比为1∶3再刺激(共培养2)。(图9B)在共培养1至2期间的CAR LTG1563依赖性的Raji细胞毒性。(图9C)在与CD19+Raji-GFP细胞共培养之前和之后(共培养1&2)的不同时间点处，通过流式细胞术在活化之后D20(共培养2，D8)时对CAR T耗竭标志物表达(PD1)的量化。(图9B、图9C)。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001。UTD＝未经转导的T细胞。n＝3名独立的供体。
图10A至10E描绘了在CAR LTG 1563(具有另外的辅助组分)T细胞免受TGF-β抑制和PD-L1抑制二者的情况下，优越的Raji肿瘤杀伤、提高的T细胞扩增和提高的T细胞细胞因子产生。(图10A)PD-L1在经转导的和磁选(magnetically-sorted)的Raji-GFP-PDL1 NHL B细胞系上的表达。(图10B)长期杀伤测定的共培养时间进程图。细胞在D0时用TransAct试剂活化，在D1时用LV载体(0.5％v/v)转导，并从活化之后D0至D8用30IU/mL IL2洗涤和处理。从活化之后D8至D14，在存在或不存在10ng/mL TGF-β的情况下将CAR LTG1563 T细胞与Raji-GFP(CD19+、PDL1-)或Raji-GFP-PDL1(CD19+、PDL1+)细胞一起以效应物∶靶标比为1∶3共培养(共培养1)；从D14至D20，在存在或不存在10ng/mL TGF-β的情况下将细胞用Raji-GFP或Raji-GFP-PDL1细胞以效应物∶靶标比为1∶3再刺激(共培养2)。(图10C)在共培养1和共培养2中分析的最终时间点(分别为活化之后D14、活化之后D20)处的CAR LTG1563依赖性的Raji细胞毒性。(图10D)在完整的T细胞培养时间(包括共培养1至2)期间，CAR LTG1563依赖性的T细胞扩增。(图10E)在与CD19+Raji-GFP或Raji-GFP-PDL1细胞共培养(共培养1&2)之后24小时，通过流式细胞术对CAR T IL-2产生的量化。(图10B至10E)。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001。UTD＝未经转导的T细胞。n＝3名独立的供体。
发明详述
定义
除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，术语“抗原”包括单个/种或多个/种抗原，并且可认为与短语“至少一个/种抗原”等同。本文中使用的术语“包含”意指“包括”。因此，“包含抗原”意指“包括抗原”而不排除其他要素。短语“和/或”意指“和”或“或/或者”。应进一步理解，除非另外指出，否则对于核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且是出于描述的目的而提供。虽然可使用与本文中描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料，但是下文描述了特定的合适的方法和材料。在有冲突的情况下，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，材料、方法和实例仅是举例说明性的，而不旨在是限制性的。为了便于查阅多个实施方案，提供了以下对术语的解释：
术语“约”当指可测量值(例如量、持续时间等)时意指涵盖与特定值的.+-.20％、或在一些情况下.+-.10％、或在一些情况下.+-.5％、或在一些情况下.+-.1％、或在一些情况下.+-.0.1％的变化，因为这样的变化适合于进行所公开的方法。
除非另外指出，否则根据常规用法使用本文中的技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes VII，Oxford University出版社出版，1999；Kendrew等(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994；以及Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：AComprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995；以及其他类似的参考文献。
如本文中公开和描述的，本发明基于出乎意料的发现：对治疗性载荷构建体的受表面抗原调节的启动子的表达的调整或调节可与治疗性载荷的活性直接相关，并因此与靶细胞环境中的表面抗原的表达水平直接相关。
本公开内容提供了新的自驱动的诱导型启动子-治疗性载荷构建体、以及表达所述受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体的宿主细胞(例如，T细胞)和编码所述受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸分子，所述自驱动的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的一种或更多种治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞环境中表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平。
不受任何特定作用机制的限制，本文中使用的“自驱动的”受表面抗原调节的诱导型启动子是指利用受表面抗原调节的诱导型启动子驱动治疗性载荷，以在不存在肿瘤靶抗原表达的情况下提供低基础水平的治疗性载荷表面表达。在靶细胞表面上存在靶抗原活化的情况下，治疗性载荷被活化，这触发了可适用的信号转导途径的激活，从而活化受表面抗原调节的诱导型启动子的信号调节子，由此导致治疗性载荷的表达提高至高于基础表达水平。以这种方式，产生了一个正反馈环，由此给定靶抗原的较高表达导致治疗性载荷的较高表达并且反之亦然，从而导致对治疗性载荷表达的有效调节以实现针对在特定位点和时间下存在的靶标水平精确调整的T细胞响应。治疗性载荷表达的提高导致最佳的抗肿瘤活性和靶肿瘤细胞的快速消除。随着肿瘤细胞量的降低/去除，治疗性载荷表达水平恢复至其基础表达水平。
这种自驱动的活化模式将在随后再暴露于抗原(例如但不限于，通过肿瘤复发、转移事件、肿瘤迁移/扩散等发生)时重复。作为结果，这种对自驱动的治疗性载荷T细胞响应的随时间和幅度的控制提供了改善的治疗效力、降低的肿瘤逃逸风险以及降低的治疗毒性。这类似于在细胞水平上针对疾病状态在生物学上或内源性地调整治疗剂量。
以下是对自驱动的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的详细描述，包括对受表面抗原调节的诱导型启动子、治疗性载荷的描述，以及对自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体、抗体及其抗原结合片段、缀合物、核苷酸、表达、载体和宿主细胞、治疗方法、组合物和使用所公开的自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的药盒的更详细的描述。
A.受表面抗原调节的诱导型启动子
在一个方面中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137和138或其组合的核苷酸序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137和138或其组合的核苷酸序列，或者与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在另一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137和138或其组合的核苷酸序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平上调一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在另一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137和138或其组合的核苷酸序列，或者与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平上调一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在另一个实施方案中，可上调本文中所述的受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体的表达水平，例如但不限于，从约10％至100％、200％、300％、400％和500％。本文中记载的范围具体地包含其中的所有整数数字，如同对其进行了具体记载一样。
在一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137和138或其组合的核苷酸序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平下调一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在另一个实施方案中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137和138或其组合的核苷酸序列，或者与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平下调一种或更多种治疗性载荷的表达水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
在另一个实施方案中，可下调本文中所述的受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体的表达水平，例如但不限于，从约10％至100％、200％、300％、400％和500％。本文中记载的范围具体地包含其中的所有整数数字，如同对其进行了具体记载一样。
B.治疗性载荷
在其最广泛的方面中，本文中提供了自驱动的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体、以及表达所述受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体的宿主细胞(例如，T细胞)和编码所述受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸分子，所述自驱动的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的至少一种治疗性载荷，所述治疗性载荷包含嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA或蛋白酶，或其组合，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含STAT5响应元件、AP-1响应元件或NFκB响应元件、或其组合，该受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节治疗性载荷的表达水平。
在一个方面中，本文中提供了自驱动的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体、以及表达所述受表面抗原调节的诱导型启动子治疗性载荷构建体的宿主细胞(例如，T细胞)和编码所述受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的核酸分子，所述自驱动的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性CAR和至少一种治疗性载荷，所述治疗性载荷包含CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA或蛋白酶，或其组合，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含STAT5响应元件、AP-1响应元件或NFκB响应元件、或其组合，该受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节治疗性CAR和治疗性载荷的表达水平。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含含有以下的细胞因子：IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含例如但不限于包含以下的细胞因子：CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL21、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR2、CCR3、CCR4、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR3、CXCR4、CXCR6、SIP1，或其任意组合，该运输受体用于帮助CART细胞运输至肿瘤部位。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含例如但不限于双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体、或抗CD3和抗CD22靶向抗体、或抗CD3和抗CD20靶向抗体、或抗CD3和抗CD33靶向抗体、或抗CD3和抗CD123靶向抗体、或抗CD3和抗CD38靶向抗体、其他多靶向的抗体。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、PD-L2、CD95L、TRAIL受体、IL-6R、IL-1R、TGFβ受体、PD-1、LAG-3、Tim-3、TGFβ、IL-10、CTLA-4、VISTA、TIGIT、IL-1、IL-1R的，表达为scFv、或IgG、或scFvFc、或VHH、或F(ab)、或F(ab)2、或天然配体结合结构域，或为其他构型的，该中和/阻断抗体用于增强T细胞裂解功能、细胞因子释放、持续性、增殖潜能、防止T细胞检查点阻断、耗竭、凋亡、活化诱导的细胞死亡。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含T细胞刺激受体，例如但不限于IL-2Rα、IL-15Rα、IL-7Rα、CXCR5，该刺激性受体用于增强T细胞抗肿瘤功能。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含截短的抑制性受体(显性负(dominant negative)；“dn”)，例如但不限于dn-TGFβ受体II、dn-PD-1、dn-CTLA-4、dn-IL-10受体、dn-KLRG1、dn-CD160、dn-TIM3、dn-LAG3、dn-BTLA、dn-VISTA，该截断的抑制性受体用于防止抑制T细胞功能。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域(endodomain)融合的PD-1的胞外结构域(ectodomain)、与gp130的胞内结构域融合的TGFβ受体II的胞外结构域、与4-1BB的胞内结构域融合的IL-10受体的胞外结构域、或与IL-7受体的胞内结构域融合的IL-4受体，该杂合的抑制性/活化受体用于将T细胞抑制性信号转化为T细胞激活信号。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2、MCL-1、CED9、Bfl-1、Brag-1、A-1或BCL-XL，该抗凋亡蛋白用于延长T细胞持续性并防止凋亡。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含shRNA，例如但不限于针对PD-1、CTLA-4、KLRG-1、CD160、TGFβ受体II、IL-10R的，该shRNA用于下调T细胞抑制性因子并增强T细胞抗肿瘤功能。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含蛋白酶，例如MMP2、MMP4，该蛋白酶用于消化肿瘤基质并提高T细胞向肿瘤中的渗透。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含肽，例如iRGD肽，该肽用于提高抗癌药物的肿瘤渗透。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含第二CAR T构建体，该CAR T构建体用于靶向第二肿瘤抗原，或靶向在肿瘤微环境中存在的抑制性细胞上表达的抗原，例如但不限于，存在于MDSC和抑制性B细胞上的PD-L1、PD-L2、TRAIL受体CD33、CD138。
在另一个实施方案中，一种或更多种治疗性载荷(例如但不限于基于嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA或蛋白酶的)在受表面抗原调节的诱导型启动子的控制下表达，其中通过2A核糖体跳读序列或内部核糖体进入序列(IRES)或其组合分离一种或更多种治疗性载荷。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体还包含：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
C.嵌合抗原受体(CAR)
在一个较窄的方面中，如本文中公开和描述的，本发明基于出乎意料的发现：对治疗性载荷构建体的受表面抗原调节的启动子的表达的调整或调节可与治疗性载荷的活性直接相关，并因此与靶细胞环境中的表面抗原的表达水平直接相关。
与表达由组成型启动子调节的先前存在的CAR T构建体相比，本文中所述的基于CAR的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体相对于现有技术具有一定的优势，包括，例如但不限于：i)针对当时由肿瘤表达的抗原的特定量调整或调节抗肿瘤响应的时间和幅度，从而实现抗肿瘤CAR功能的最佳执行；ii)防止有害的T细胞过度活化(耗竭、活化诱导的细胞死亡、代谢能力降低、快速终末分化)；iii)降低或消除与不适当的CAR活化或过度活化相关的毒性风险；iv)降低或消除CAR相关的细胞因子释放综合征(cytokinerelease syndrome，CRS)；或v)降低或消除CAR相关的神经毒性；或其任意组合。
因此，如本文中公开和描述的，在本发明的一个方面中，本文中提供的由受表面抗原调节的诱导型启动子自驱动的至少一种基于CAR的治疗性载荷构建体包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的至少一种嵌合抗原受体，该受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节一种或更多种治疗性载荷的表达水平。
在一个实施方案中，本文中提供的自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体包含例如但不限于与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的一种或更多种基于CAR的治疗性载荷，并且其中基于CAR的治疗性载荷包含这样的CAR：从N端至C端包含至少一个胞外结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外结合结构域包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
CAR是人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含通过跨膜结构域与T细胞信号传导结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(ScFv))。CAR的特征包括其能够以非MHC限制性方式朝着所选靶标重定向T细胞特异性和反应性，以及利用单克隆抗体的抗原结合性质。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞以不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，因此绕过了主要的肿瘤逃逸机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(T cell receptor，TCR)α和β链二聚化。
将来源于不同蛋白质结构域的功能性部分组合的独特能力是CAR的关键创新特征。这些蛋白质结构域中每一个的选择是关键的设计特征，其特异性组合的方式也是如此。每个设计结构域都是可在不同CAR平台之间使用以改造淋巴细胞的功能的必需组分。例如，胞外结合结构域的选择可使在其他情况下无效的CAR变得有效。
用于产生自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的胞外抗原结合结构域的免疫球蛋白来源蛋白质序列的物理化学性质可以是完全中性的，或者其可自缔合并驱使T细胞达到代谢耗竭的状态，由此使表达该自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的治疗性T细胞的效果远远更低。这独立于该CAR结构域的抗原结合功能而发生。此外，胞内信号传导结构域的选择也可控制用于免疫治疗的治疗性淋巴细胞群的活性和持久性。尽管分别通过这些胞外和胞内结构域结合靶抗原的能力和向T细胞传递活化信号的能力是重要的CAR设计方面，但还是变得明显的是，胞外抗原结合片段来源的选择可对自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的效力具有显著作用，并且从而对自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的功能和临床效用具有限定作用。
如本文中所公开的，自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的胞内T细胞信号传导结构域可包含例如，T细胞受体信号传导结构域、T细胞共刺激信号传导结构域或这二者。T细胞受体信号传导结构域是指包含T细胞受体的胞内结构域(例如如但不限于，CD3ζ蛋白的胞内部分)的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的一部分。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的一部分，所述共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。
以下是对本发明的自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的详细描述，包括对其胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域的描述，以及对自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子治疗性载荷构建体、抗体及其抗原结合片段、缀合物、核苷酸、表达载体和宿主细胞、治疗方法、组合物和使用所公开的自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的药盒的另一些描述。
1.胞外结构域
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体包含靶标特异性结合元件，其也称为抗原结合结构域或部分。结构域的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域以识别充当靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。因此，可充当治疗性表面抗原靶标特异性启动子-载荷构建体的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的一些实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫病和癌细胞相关的那些。
在一个实施方案中，可通过改造与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的期望抗原结合结构域来改造受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体以靶向目的肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引起免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)的蛋白质。抗原结合结构域的选择将取决于待治疗癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域公知的，并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、.β.-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活蛋白(survivin)和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(prostate-carcinomatumor antigen-1，PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2(ephrinB2)、CD22、胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。本文中公开的肿瘤抗原仅以举例的方式包括在内。该列表并不旨在是排他性的，并且其他实例对于本领域技术人员而言将是明显的。
在一个实施方案中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一种或更多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可充当免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。另一些靶分子属于转化相关分子的组，例如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌-胚胎抗原(onco-fetal antigen)，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤独特的真正肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(例如CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的另一些候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20，独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶标，但成效有限。
肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的，并且不在体内的其他细胞上出现。TAA不是肿瘤细胞独有的，并且相反在无法诱导对抗原免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是当免疫系统不成熟并且不能应答时在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者其可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA的一些非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2；以及肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位造成的独特的肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如EB病毒(Epstein Barrvirus)抗原EBVA和人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
此外，在某些实施方案中，使用人胞外抗原结合结构域代替小鼠来源的结合结构域导致产生自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体，其在体内更好地发挥功能，同时避免在宿主免疫应答中诱导抗CAR免疫和杀伤与基于鼠的抗原结合结构域相关的CAR-T细胞群。
表达完全人胞外ScFv抗原结合结构域的自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体表现出优异的活性/特性，其包括i)防止如在小鼠来源的结合序列的情况下所见的差的CAR-T持续性和功能；ii)使缺乏区域性递送自驱动的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的需求有效；以及iii)能够基于对相应抗原具有高亲和力和低亲和力的结合物二者产生CAR-T细胞设计。后一种特性允许研究者更好地调节CAR-T产物的效力与毒性，和/或组织特异性，因为由于肿瘤上某些抗原的表达高于正常组织，因此相对于正常组织，较低亲和力的结合物可对肿瘤具有更高的特异性，这可防止脱靶肿瘤毒性(on-target off tumor toxicity)和旁观者(bystander)细胞杀伤。
在一个优选实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的抗原结合结构域部分靶向包括但不限于以下的抗原：CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR等。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含，例如如在2017年1月9日首次作为临时专利申请No.62/444,201提交并于2019年1月22日授权的标题为Compositions and Methods for TreatingCancer with Anti-Mesothelin Immunotherapy并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_017)的申请人发布的美国专利No.10，183,993中公开的scFV结合物。
在一个优选实施方案中，编码胞外间皮素抗原结合结构域的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：87的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素抗原结合结构域包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或与SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：89的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：90中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。除可用作基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域的scFv序列之外，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含可并入到功能性CAR中的单链抗原结合物(与scFv相对)。
例如，如在2018年3月24日提交的标题为Compositions and Methods ForTreating Cancer With Anti-CD33 Immunotherapy并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_018)的申请人的共同未决非临时专利申请No.15/934,770(临时专利No.62/476,438)中公开的CD33特异性仅重链结合物。
在一个实施方案中，编码胞外CD33抗原结合结构域的分离的核酸分子包含SEQ IDNO：91的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD33抗原结合结构域包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列或与SEQ ID NO：92的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD33的恶性肿瘤的功能性CAR LTG1906的核酸序列包含SEQ ID NO：93的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：94中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含例如，如在2018年11月30日提交的标题为Compositions andMethods for Treating Cancer with Anti-CD38 Immunotherapy并且转让给LentigenTechnology，Inc.(事件编号LEN_026)的申请人的共同未决临时专利申请No.62/773,940中公开的scFV结合物。
在一个实施方案中，编码胞外CD38抗原结合结构域M3803的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：144的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD38抗原结合结构域包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列或与SEQ ID NO：145的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD38抗原结合结构域M3804的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：146的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD38抗原结合结构域包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列或与SEQ ID NO：147的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD38抗原结合结构域M3809的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：148的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD38抗原结合结构域包含SEQ ID NO：149的氨基酸序列或与SEQ ID NO：149的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD38抗原结合结构域M3811的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：150的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD38抗原结合结构域包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列或与SEQ ID NO：151的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码靶向表达CD38的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2091的核酸序列包含SEQ ID NO：7的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD38的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2092的核酸序列包含SEQ ID NO：9的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD38的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2095的核酸序列包含SEQ ID NO：11的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD38的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2097的核酸序列包含SEQ ID NO：15的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含例如，如在2018年11月2日提交的标题为Compositions andMethods for Treating Cancer with Anti-ROR1 Immunotherapy并且转让给LentigenTechnology，Inc.(事件编号LEN_022)的申请人的共同未决非临时专利申请No.16/179,364中公开的scFV结合物。
在一个实施方案中，编码胞外ROR1抗原结合结构域的分离的核酸分子包含SEQ IDNO：152的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外ROR1抗原结合结构域包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列或与SEQ ID NO：153的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外ROR1抗原结合结构域的分离的核酸分子包含SEQ IDNO：154的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外ROR1抗原结合结构域包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列或与SEQ ID NO：155的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外ROR1抗原结合结构域的分离的核酸分子包含SEQ IDNO：156的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外ROR1抗原结合结构域包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列或与SEQ ID NO：157的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码靶向表达ROR1的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 1941的核酸序列包含SEQ ID NO：17的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达ROR1的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 1942的核酸序列包含SEQ ID NO：19的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达ROR1的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 1943的核酸序列包含SEQ ID NO：21的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含例如，如在2018年9月20日提交的标题为Compositions andMethods for Treating Cancer with Anti-CD123 Immunotherapy并且转让给LentigenTechnology，Inc.(事件编号LEN_024)的申请人的共同未决临时专利申请No.62/734,106中公开的scFV结合物。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12303的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：158的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列或与SEQ ID NO：159的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12304的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：160的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列或与SEQ ID NO：161的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12305的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：162的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列或与SEQ ID NO：163的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12306的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：164的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列或与SEQ ID NO：165的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12308的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：166的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列或与SEQ ID NO：167的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12311的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：168的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列或与SEQ ID NO：169的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12313的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：170的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：171的氨基酸序列或与SEQ ID NO：171的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12315的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：172的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：173的氨基酸序列或与SEQ ID NO：173的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12317的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：174的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列或与SEQ ID NO：175的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD123抗原结合结构域M12318的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：176的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD123抗原结合结构域包含SEQ ID NO：177的氨基酸序列或与SEQ ID NO：177的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2075的核酸序列包含SEQ ID NO：23的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2076的核酸序列包含SEQ ID NO：25的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2077的核酸序列包含SEQ ID NO：115的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2078的核酸序列包含SEQ ID NO：117的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2079的核酸序列包含SEQ ID NO：119的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：120中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2082的核酸序列包含SEQ ID NO：121的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：122中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2083的核酸序列包含SEQ ID NO：123的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：124中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2085的核酸序列包含SEQ ID NO：125的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：126中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2087的核酸序列包含SEQ ID NO：127的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：128中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD123的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2088的核酸序列包含SEQ ID NO：129的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：130中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含例如，如在2018年9月26日提交的标题为Compositions andMethods for Treating Cancer with Human Anti-CD19/22 Immunotherapy并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_025)的申请人的共同未决临时专利申请No.62/736,955中公开的scFV结合物。
在一个实施方案中，编码胞外CD19/CD22抗原结合结构域的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：178，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素抗原结合结构域包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列或与SEQ ID：179的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD19/CD22的恶性肿瘤的功能性CAR LTG2737的核酸序列包含SEQ ID NO：131的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：132中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含例如，如在2018年10月16日提交的标题为Compositions andMethods for Treating Cancer with Human Anti-CD22 Immunotherapy并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_021)的申请人的共同未决非临时专利申请No.16/161,542中公开的scFV结合物。
在一个实施方案中，编码胞外CD22抗原结合结构域16P17的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：180，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素抗原结合结构域包含SEQ ID NO：181的氨基酸序列或与SEQ ID：181的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD22抗原结合结构域16P13的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：182，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素抗原结合结构域包含SEQ ID NO：183的氨基酸序列或与SEQ ID：183的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD22的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2209的核酸序列包含SEQ ID NO：133的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：134中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD22的恶性肿瘤的功能性CAR LTG 2219的核酸序列包含SEQ ID NO：135的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：136中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域可包含例如，如在2018年7月31日提交的标题为Compositions andMethods for Treating Cancer with Anti-CD19/20Immunotherapy并且转让给LentigenTechnology，Inc.(事件编号LEN_019)的申请人的共同未决非临时专利申请No.16/050,754中公开的scFV结合物。
在一个实施方案中，编码胞外CD19/CD20抗原结合结构域的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：141，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素抗原结合结构域包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列或与SEQ ID：112的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码胞外CD19/CD20抗原结合结构域的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：113，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素抗原结合结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID：114的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD19/CD20的恶性肿瘤的功能性CAR LTG1496的核酸序列包含SEQ ID NO：95的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：96中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码靶向表达CD19/CD20的恶性肿瘤的功能性CAR LTG1497的核酸序列包含SEQ ID NO：97的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的核酸序列包含于2018年9月18日提交，标题为Compositions and Methods forTreating Cancer with DuoCARs的申请人的共同未决的部分继续专利申请No.16/134,735中所公开的一个或更多个核酸序列，所述部分继续专利申请No.16/134,735要求2017年9月1日提交的PCT申请No.PCT/US17/49923的优先权，所述PCT申请No.PCT/US17/49923进而根据35 U.S.C.第119(e)节要求于2016年9月2日提交的美国临时专利申请No.62/382,791的优先权权益，其各自的全部内容通过引用并入本文。
因此，在一个实施方案中，已知在申请人的DuoCAR环境中相容的基于变体单特异性的CAR结构也可用于产生基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体。基于DuoCAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体技术可基于的单特异性治疗性受表面抗原调节的启动子-载荷构建体(例如，基于CAR的)的一些具体实例包括单一CD20靶向载体LTG1495，其具有核苷酸序列SEQ ID NO：142和氨基酸序列SEQ ID NO：143。第二实例是对CD22具有特异性的单特异性CAR LTG2200，其具有核苷酸序列SEQ ID NO：69和氨基酸序列SEQ ID NO：70。
在另一个实施方案中，已知在DuoCAR环境中相容的变体CAR结构也可用于产生本公开内容范围内包含的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体。这些包括分别在核苷酸序列SEQ ID NO：71和氨基酸序列SEQ ID NO：72中描述的CD19特异性CARLTG1494。该序列包括连接scFv的重链和轻链的良好描述的接头，其被称为Whitlow接头(氨基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：184)，参见Whitlow M.，等，1993，ProteinEng.6：989-995)。在一些情况下，Whitlow接头被(GGGGS)n接头(SEQ ID NO：185)替换，例如以CD19 CAR格式，如在LTG1538中，其分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：73和氨基酸序列SEQID NO：74。在另一个实例中，产生具有替代跨膜结构域的CAR。分别具有核苷酸序列SEQ IDNO：75和氨基酸序列SEQ ID NO：76的抗CD19 CAR LTG1562利用CD4(与CD8相对)跨膜结构域。类似地，抗CD19 CAR LTG1563(其分别具有核苷酸序列SEQ ID NO：77和氨基酸序列SEQID NO：78)具有来源于TNFRSF19的替代跨膜。
在另一个实施方案中，治疗性应用的另一个实例是用本发明的基于DuoCAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体治疗表达CD19、CD20和TSLPR抗原的白血病。特别地，基于DuoCAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体包含与TSLPR特异性CAR(LTG1789)(分别具有SEQ ID NO：101和氨基酸序列SEQ ID NO：102)组合的LTG1496或LTG1497(分别具有SEQ ID NO：95、97)，所述TSLPR特异性CAR(LTG1789)由TSLPR特异性scFV结构域(具有核苷酸序列SEQ ID NO：99和氨基酸序列SEQ ID NO：100)产生。
在一个实施方案中，前述基于DuoCAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的每一个，各自的CAR构建体是由单一受表面抗原调节的启动子自驱动的，其中CAR构建体通过其间的核糖体2A跳读位点分离。
在另一个实施方案中，前述基于DuoCAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的每一个，各自的CAR构建体是由独立的受表面抗原调节的启动子自驱动的。
在某些实施方案中，本文中使用的抗cd19 CAR构建体的一些非限制性实例包括抗cd19 CAR构建体，其由本文中称为LTG1563(参见，SEQ ID NO：77)的核苷酸序列编码，并且所述核苷酸序列编码在本文中被确定为CAR-LTG1563(参见，SEQ ID NO：78)的抗cd19 CAR构建体。
在一个实施方案中，在下文实施例1中描述了如下的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的构建：其包含SEQ ID NO：139的核酸序列并且编码包含SEQ IDNO：78的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体(CAR LTG1563)。
在一个实施方案中，在下文实施例1中描述了如下的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的构建：其包含SEQ ID NO：140的核酸序列并且编码包含SEQ IDNO：78的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体(CAR LTG1563)。
在一个实施方案中，在下文实施例1中描述了如下的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的构建：其包含SEQ ID NO：77的核酸序列并且编码包含SEQ IDNO：78的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体(CAR LTG1563)。
在不旨受任何特定作用机制的限制，认为与本发明的示例性受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体相关的增强的治疗性功能的可能原因包括，例如但不限于：a)改善了在质膜内的横向运动从而允许更有效的信号转导，b)在质膜微结构域(例如脂筏)内的优异位置，以及与与T细胞活化相关的跨膜信号传导级联相互作用的更大能力，c)通过优先移动远离抑制性(dampening)或下调性的相互作用(例如与磷酸酶(例如CD45)的接近性或相互作用较低)而在质膜内的优异位置，以及d)优异组装成T细胞受体信号传导复合体(例如免疫突触)，或其任意组合。
根据待靶向的期望抗原，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体可被改造成包含对期望抗原靶标具有特异性的合适抗原结合结构域。例如但不限于，如果CD19是待靶向的期望抗原，则可将针对CD19的抗体用作并入到受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的抗原结合结构域。
在一个示例性实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的抗原结合结构域部分靶向CD19。优选地，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的胞外抗原结合结构域是抗CD19scFV，其中胞外抗CD19scFV的核酸序列包含SEQ ID NO：37所示的序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞外抗CD19 scFV包含编码SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CAR的胞外抗CD19 scFV部分包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在本发明的一个方面中，提供了能够与非TSA或非TAA结合的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体，所述非TSA或非TAA包括例如但不限于来源于以下的抗原：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1和HIV-LP)、微小RNA病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)、风疹病毒、冠状病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科(例如1型和2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和疱疹病毒)、痘病毒科(例如天花病毒、牛痘病毒和痘病毒)或丙型肝炎病毒，或其任意组合。
在本发明的另一个方面中，提供了能够与来源于以下的细菌菌株的抗原结合的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体：葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)或沙门菌属(Salmonella)。特别地，提供了能够与来源于以下的感染性细菌的抗原结合的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体：例如幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sps.)的细菌菌株(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)或戈登分枝杆菌(M.gordonea))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌(Group A Streptococcus)、B组链球菌(GroupB Streptococcus)(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或破伤风梭菌(Clostridium tetani)，或其组合。
2.跨膜结构域
关于跨膜结构域，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体包含与受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的胞外结构域融合的一个或更多个TNFRSF跨膜结构域。
在一个实施方案中，TNFRSF跨膜结构域包含至少一个TNFRSF19跨膜结构域。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的TNFRSF跨膜结构域包含TNFRSF19跨膜结构域。
在一个实施方案中，编码TNFRSF19跨膜结构域的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：51的核苷酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的TNFRSF19跨膜结构域包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
跨膜结构域可来源于天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
特别用于本文中所述的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的跨膜区可来源于以下(即，至少包含其跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，间皮素，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每个末端。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选地长度为2至10个氨基酸)可在受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，除上述跨膜结构域之外，还使用天然与受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中结构域之一缔合的跨膜结构域。
在一些情况下，可通过氨基酸替换对跨膜结构域进行选择以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合从而使与受体复合体的其他成员的相互作用最小化。
在一个实施方案中，本发明的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：27的核酸序列。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含编码SEQ ID NO：28的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所编码的跨膜结构域包含具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，替换)但不超过20、10或5个修饰(例如，替换)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列。
在一些情况下，CAR的跨膜结构域包含CD8.α.铰链结构域。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO：29的核酸序列。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含编码SEQ ID NO：30的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ IDNO：30的氨基酸序列，或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来源于CD8的胞外结构域，并且与跨膜CD8结构域、跨膜CD28结构域，或其组合连接。
在如本文中公开的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞细胞群的一个实施方案中，用于本文中公开的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的一些非限制性示例性跨膜结构域包括TNFRSF16和TNFRSF19跨膜结构域，其可用于获得如在2018年4月9日提交的标题为CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND METHODS OF USE并且转让给LentigenTechnology，Inc.(事件编号LEN_015)(US)的申请人的共同未决专利申请No.15/767,076中公开的TNFRSF跨膜结构域和/或接头或间隔区结构域，特别包括其中如表1中列出的肿瘤坏死因子受体超家族内列出的那些其他TNFRSF成员。
在一个实施方案中，本发明CAR中的跨膜结构域是TNFRSF19跨膜结构域。在一个实施方案中，TNFRSF19跨膜结构域包含SEQ ID NO：51的核酸序列。在一个实施方案中，TNFRSF19跨膜结构域包含编码SEQ ID NO：52的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，TNFRSF19跨膜结构域包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所编码的跨膜结构域包含具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，替换)但不超过20、10或5个修饰(例如，替换)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列。
3.间隔区结构域
在基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中，可在胞外结构域与TNFRSF跨膜结构域之间，或在胞内结构域与TNFRSF跨膜结构域之间布置间隔区结构域。间隔区结构域意指用于将TNFRSF跨膜结构域与胞外结构域和/或TNFRSF跨膜结构域与胞内结构域连接的任何寡肽或多肽。间隔区结构域包含多至300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，且最优选25至50个氨基酸。
在数个实施方案中，接头可包含间隔区元件，其在存在时增大接头的大小，使得效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段之间的距离增大。示例性间隔区是普通技术人员已知的，并且包括以下中列出的那些：美国专利No.7,964,5667、498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414以及美国专利公开No.20110212088和20110070248，其各自通过引用整体并入本文。
间隔区结构域优选具有促进基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体与抗原结合并增强信号传导进入细胞的序列。预期促进结合的氨基酸的一些实例包括半胱氨酸、带电荷的氨基酸以及潜在的糖基化位点中的丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可用作构成间隔区结构域的氨基酸。
作为间隔区结构域，可使用以下的全部或一部分：CD8.α.(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)的第118至178位氨基酸(其为铰链区)(SEQ ID NO：31)，CD8.β.(GenBank：AAA35664.1)的第135至195位氨基酸，CD4(NCBI RefSeq：NP.sub.--000607.1)的第315至396位氨基酸，或CD28(NCBI RefSeq：NP.sub.--006130.1)的第137至152位氨基酸。此外，作为间隔区结构域，可使用抗体H链或L链的恒定区的一部分(CH1区或CL区，例如，具有SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的肽)。此外，间隔区结构域可以是人工合成的序列。
另外，可使用包含人IgG4(UniProt ID：P01861)恒定区的氨基酸的全部或一部分，其包含CH1(第1至98位氨基酸)、铰链(SEQ ID NO：80，和相应核苷酸SEQ ID NO：79)(第99至110位氨基酸)、CH2(氨基酸SEQ ID NO：81和相应核苷酸SEQ ID NO：80)(第111至220位氨基酸)和CH3(SEQ ID NO：84和相应核苷酸SEQ ID NO：83)(第221至327位氨基酸)或其组合，例如IgG4铰链CH2CH3结构域(SEQ ID NO：86和相应核苷酸SEQ ID NO：85)。
在一个实施方案中，CAR的间隔区结构域包含TNFRSF19铰链结构域，其包含SEQ IDNO：53的核酸序列。在一个实施方案中，TNFRSF19铰链结构域包含编码SEQ ID NO：54的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，TNFRSF19铰链结构域包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR的间隔区结构域包含TNFRSF19截短的铰链结构域，其包含SEQ ID NO：55的核酸序列。在一个实施方案中，TNFRSF19截短的铰链结构域包含编码SEQID NO：56的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，TNFRSF19截短的铰链结构域包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，TNFRSF19铰链和跨膜结构域包含SEQ ID NO：49的核酸序列。在一个实施方案中，TNFRSF19铰链和跨膜结构域包含编码SEQ ID NO：50的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，TNFRSF19铰链和跨膜结构域包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CD8a铰链结构域与TNFRSF19跨膜结构域融合，其包含SEQ IDNO：57的核酸序列。在一个实施方案中，CD8a铰链结构域与TNFRSF19跨膜结构域融合，其包含编码SEQ ID NO：58的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8a铰链结构域与TNFRSF19跨膜结构域融合，其包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
另外，在受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体中，信号肽序列(也称为前导肽)可与N端连接。信号肽序列存在于许多分泌蛋白和膜蛋白的N端，并且长度为15至30个氨基酸。由于上文作为胞内结构域提及的很多蛋白质分子均具有信号肽序列，因此这些信号肽可用作受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的信号肽。在一个实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列)。
在一个实施方案中，CD8α前导肽包含SEQ ID NO：43的核酸序列。在一个实施方案中，CD8α前导肽包含编码SEQ ID NO：44的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8a铰链结构域与TNFRSF19跨膜结构域融合，其包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在另一个实施方案中，GMCSF前导肽包含SEQ ID NO：39的核酸序列。在一个实施方案中，GMCSF前导肽包含编码SEQ ID NO：40的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8a铰链结构域与TNFRSF19跨膜结构域融合，其包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在另一个实施方案中，TNFRSF19前导肽包含SEQ ID NO：41的核酸序列。在一个实施方案中，TNFRSF19前导肽和CD8α前导肽包含编码SEQ ID NO：42的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8a铰链结构域与TNFRSF19跨膜结构域融合，其包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，编码表皮生长因子受体的截短序列(tEGFR)的标签序列包含SEQ ID NO：67的核酸序列。在一个实施方案中，tEGFR包含编码SEQ ID NO：68的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，tEGFR标签包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列，或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，设计用于标签序列和治疗性载荷序列的同时双顺反子表达的弗林蛋白酶识别位点和下游T2A自切割肽序列包含SEQ ID NO：65的核酸序列。在一个实施方案中，弗林蛋白酶和T2A序列包含编码SEQ ID NO：66的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，tEGFR标签包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，设计用于标签序列和CAR序列的同时双顺反子表达的上游弗林蛋白酶识别位点和T2A自切割肽序列以及弗林蛋白酶识别下游位点包含SEQ ID NO：67的核酸序列。在一个实施方案中，弗林蛋白酶和T2A序列包含编码SEQ ID NO：68的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，tEGFR标签包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的靶向结构域以单克隆抗体、ScFv Fab、Fab’2的形式单独表达，并且包含在结合标签或表位，而受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的效应细胞表达组分包含结合结构域，所述结合结构域被特异性地针对以结合可溶性CAR模块上表达的标签或表位，例如CAR的可溶性组分与细胞结合组分的特异性结合形成完整的功能性CAR结构。
4.胞内结构域
CAR的胞质结构域或其他胞内信号传导结构域负责活化其中已置入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应物功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白质的部分。尽管通常可使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应物功能信号，就可使用这样的截短部分代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应物功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于CAR的胞内信号传导结构域的一些优选实例包括T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列，其在抗原受体接合后共同发挥作用以引发信号转导；以及具有相同功能能力的这些序列的任何衍生物或变体以及任何合成序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两种不同种类的胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级信号或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合体的初级活化。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列可包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
特别用于本文中公开的CAR中的包含初级胞质信号传导序列的ITAM的一些实例包括来源于以下的那些：TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。ITAM的一些具体的非限制性实例包括具有以下序列的肽：CD3.ζ.(NCBI RefSeq：NP.sub.--932170.1)的第51至164位氨基酸，Fc.ε.RI.γ(NCBI RefSeq：NP.sub.--004097.1)的第45至86位氨基酸，Fc.ε.RI.β(NCBI RefSeq：NP.sub.--000130.1)的第201至244位氨基酸，CD3.γ.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000064.1)的第139至182位氨基酸，CD3.δ.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000723.1)的第128至171位氨基酸，CD3.ε.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000724.1)的第153至207位氨基酸，CD5(NCBI RefSeq：NP.sub.--055022.2)的第402至495位氨基酸，0022(NCBI RefSeq：NP.sub.--001762.2)的第707至847位氨基酸，CD79a(NCBI RefSeq：NP.sub.--001774.1)的第166至226位氨基酸，CD79b(NCBI RefSeq：NP.sub.--000617.1)的第182至229位氨基酸，以及CD66d(NCBI RefSeq：NP.sub.--001806.2)的第177至252位氨基酸，及其与这些肽具有相同功能的变体。基于本文中所述的NCBI RefSeq ID或GenBank的氨基酸序列信息的氨基酸号是基于每种蛋白质的前体(包含信号肽序列等)的全长进行编号的。在一个实施方案中，CAR中的胞质信号传导分子包含来源于CD3ζ的胞质信号传导序列。
在一个优选实施方案中，可将CAR的胞内结构域设计成自身包含CD3-ζ信号传导结构域，或者将其与在CAR的情况下可用的任何其他期望的胞质结构域组合。例如，CAR的胞内结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这样的共刺激分子的一些实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。这样的共刺激分子的一些具体的非限制性实例包括具有以下序列的肽：CD2(NCBIRefSeq：NP.sub.--001758.2)的236至351位氨基酸，CD4(NCBI RefSeq：NP.sub.--000607.1)的第421至458位氨基酸，CD5(NCBI RefSeq：NP.sub.--055022.2)的第402至495位氨基酸，CD8.α.(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)的第207至235位氨基酸，CD83(GenBank：AAA35664.1)的第196至210位氨基酸，CD28(NCBI RefSeq：NP.sub.--006130.1)的第181至220位氨基酸，CD137(4-1BB，NCBI RefSeq：NP.sub.--001552.2)的第214至255位氨基酸，CD134(OX40，NCBI RefSeq：NP.sub.--003318.1)的第241至277位氨基酸和ICOS(NCBI RefSeq：NP.sub.--036224.1)的第166至199位氨基酸，及其与这些肽具有相同功能的变体。因此，尽管本文中的公开内容主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件来举例说明，但其他共刺激元件也在本公开内容的范围内。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选地长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域以及CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含分别在SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：45或SEQ ID NO：59中所示的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含分别在SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：61中所示的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含分别编码SEQ ID NO：34、SEQID NO：46或SEQ ID NO：60的氨基酸序列的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：62的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含分别在SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：46或SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含分别在SEQID NO：36、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：62中所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含CD28的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中CD28的信号传导结构域包含分别在SEQ ID NO：45或SEQ IDNO：59中所示的核酸序列，并且CD3-ζ的信号传导结构域包含分别在SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：47或SEQ ID NO：61中所示的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含CD28的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中CD28的信号传导结构域包含分别编码SEQ ID NO：46或SEQID NO：60的氨基酸序列的核酸序列，并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO：36、或SEQ ID NO：48、或SEQ ID NO：62的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含CD28的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中CD28的信号传导结构域包含分别在SEQ ID NO：46或SEQ IDNO：60中所示的氨基酸序列，并且CD3-ζ的信号传导结构域包含分别在SEQ ID NO：36、SEQID NO：48或SEQ ID NO：62中所示的氨基酸序列。
5.具有另外的辅助组分的CAR
在另一个实施方案中，在下文实施例2中描述了包含另外的辅助组分的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体的构建，所述另外的辅助组分包含缺乏TGFBRII(TGFBRIIdn)和/或PD1(PD1dn)的胞内信号传导结构域的显性负受体，上述受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体通过核糖体跳读位点(P2A)与CAR LTG1563构建体一起共表达以产生以下的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体：包含SEQ IDNO：103、105、107或其组合的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：104、106、108或其组合的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体。
在另一个实施方案中，包含另外的辅助组分(包含缺乏TGFBRII(TGFBRIIdn)或PD1(PD1dn)的胞内信号传导结构域的显性负受体)的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体通过跳读位点(P2A)与CAR LTG1563构建体一起共表达以产生以下的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体：包含SEQ ID NO：103、105、107或其组合的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：104、106、108或其组合的氨基酸序列的基于CAR的启动子-治疗性载荷构建体，使得显性负受体dnTGFb和dnPD1的使用产生了对通常与组成型活化的显性负受体的使用相关的自身免疫毒性的预防，同时当CAR被表达且是功能性的时受益于T细胞功能的免疫抑制降低，或者通过每个dn受体单独或其组合的肿瘤微环境产生对CAR T细胞的免疫抑制的更大抗性。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含SEQ ID NO：103的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：104中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、具有显性负形式的抑制性TGF-β受体的CAR LTG1563。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含SEQ ID NO：105的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、具有显性负形式的PD1的CAR LTG1563。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体具有AP1-NFκB_RE启动子，具有显性负形式的抑制性TGF-β受体和显性负形式的PD1，与CAR LTG1563构建体一起共表达，由核糖体跳读位点(P2A)隔开，包含SEQ ID NO：107的核酸序列(所述构建体具有显性负形式的抑制性TGF-β受体和显性负形式的PD1，与CAR LTG1563构建体一起共表达，由核糖体跳读位点(P2A)隔开，并且编码包含SEQID NO：108中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的CAR。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中具有STAT5_RE启动子的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含SEQ ID NO：109的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：104中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、具有显性负形式的抑制性TGF-β的CAR LTG1563。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中具有STAT5_RE启动子的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体包含SEQ ID NO：110的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、具有显性负形式的PD1的CAR LTG1563。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中具有STAT5_RE启动子、具有显性负形式的抑制性TGF-β受体和显性负形式的PD1的受表面抗原调节的诱导型启动子-治疗性载荷构建体与CAR LTG1563构建体一起共表达，由核糖体跳读位点(P2A)隔开，包含SEQID NO：111的核酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：108中所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的CAR。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中具有EF1a启动子、具有显性负形式的抑制性TGF-β受体的组成型启动子-治疗性载荷构建体与CAR LTG1563构建体一起共表达，其中组成型EF1a启动子用于与共表达的CAR LTG1563构建体一起表达另外的蛋白质。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中具有EF1a启动子、具有显性负形式的PD1的组成型启动子-治疗性载荷构建体与CAR LTG1563构建体一起共表达，其中组成型EF1a启动子用于与共表达的CAR LTG1563构建体一起表达另外的蛋白质。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中具有EF1a启动子、具有显性负形式的抑制性TGF-β受体和显性负形式的PD1的组成型启动子-治疗性载荷构建体与CARLTG1563构建体一起共表达，并且由核糖体跳读位点(P2A)隔开，其中组成型EF1a启动子用于与共表达的CAR LTG1563构建体一起成功地表达另外的蛋白质。
6.CAR的另外的描述
本发明范围内还明确包括本文中公开的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)的功能性部分。当在提及CAR使用时，术语“功能性部分”是指本文中所公开的一个或更多个CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留其作为部分的CAR(亲本CAR)的生物学活性。功能性部分涵盖例如保留与亲本CAR在相似程度上或在相同程度上或在更高程度上识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的那些CAR部分。根据亲本CAR，功能性部分可包含例如亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能性部分可在该部分的氨基端或羧基端或在两端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于亲本CAR的氨基酸序列中。期望地，另外的氨基酸不干扰功能性部分的生物学功能(例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等)。更期望地，与亲本CAR的生物学活性相比，另外的氨基酸增强了生物学活性。
本公开内容的范围内包括本文中公开的CAR的功能性变体。本文中使用的术语“功能性变体”是指与亲本CAR具有实质或显著序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，所述功能性变体保留其作为变体的CAR的生物学活性。功能性变体涵盖例如保留与亲本CAR在相似程度、相同程度或更高程度上识别靶细胞的能力的本文中所述的CAR(亲本CAR)的那些变体。根据亲本CAR，功能性变体可例如与亲本CAR在氨基酸序列方面具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更多的同一性。
功能性变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸替换的亲本CAR的氨基酸序列。作为替代或补充，功能性变体可包含具有至少一个非保守氨基酸替换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选地非保守氨基酸替换不干扰或抑制功能性变体的生物学活性。非保守氨基酸替换可增强功能性变体的生物学活性，以使得与亲本CAR相比，功能性变体的生物学活性提高。
CAR的氨基酸替换优选为保守氨基酸替换。保守氨基酸替换是本领域中已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学特性的一个氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理特性的另一个氨基酸的氨基酸替换。例如，保守氨基酸替换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸替换另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸替换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)，碱性/带正电荷的极性氨基酸替换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸替换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr等)，具有β分支侧链的氨基酸替换另一个具有β分支侧链的氨基酸(例如，He、Thr和Val)，具有芳香族侧链的氨基酸替换另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
CAR可基本上由本文中所述的特定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如其他氨基酸)不会实质上改变功能性变体的生物学活性。
CAR(包括功能性部分和功能性变体)可具有任何长度，即，可包含任何数目的氨基酸，前提是CAR(或其功能性部分或功能性变体)保留其生物学活性，例如，与抗原特异性结合、检测哺乳动物中的患病细胞、或者在哺乳动物中治疗或预防疾病等的能力。例如，CAR的长度可以为约50至约5000个氨基酸，例如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。
CAR(包括本发明的功能性部分和功能性变体)可包含合成氨基酸以代替一种或更多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域中已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、γ-二氨基丁酸、β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
可将CAR(包括功能性部分和功能性变体)糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化(通过例如二硫桥)或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚化或缀合。
可通过本领域中已知的方法获得CAR(包括其功能性部分和功能性变体)。CAR可通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法制备。从头合成多肽和蛋白质的合适方法描述于参考文献中，例如Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，Oxford University出版社，Oxford，United Kingdom，2000；Peptide and Protein Drug Analysis，编辑，Reid，R.，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，编辑，Westwood等，Oxford University出版社，Oxford，United Kingdom，2001；以及美国专利5,449,752。另外，可使用本文中所述的核酸使用标准重组方法重组产生多肽和蛋白质。参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版.，Cold Spring Harbor出版社，Cold Spring Harbor，NY2001；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons，NY，1994。另外，一些CAR(包括其功能性部分和功能性变体)可从例如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(例如，大鼠、人)等的来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域中公知的。或者，本文中所述的CAR(包括其功能性部分和功能性变体)可由公司商业化合成。在这方面中，CAR可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
在以上部分A的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式或辅助组分：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
D.抗体和抗原结合片段
一个实施方案还提供了与本文中公开的一种或更多种抗原特异性结合的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体，例如但不限于表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合结构域或部分。本文中使用的“表达CAR的T细胞”或“CAR T细胞”意指表达CAR的T细胞，并且具有通过例如CAR的抗体来源的靶向结构域确定的抗原特异性。
本文中使用的“抗原结合结构域”可包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其抗原结合片段，只要它们显示出所期望的抗原结合活性即可。抗体的一些非限制性实例包括例如保留对抗原的结合亲和力的本领域中已知的完整的免疫球蛋白及其变体和片段。
“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然存在的突变之外，包含该群的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原表位。修饰语“单克隆”表示如从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。在一些实例中，单克隆抗体是由B淋巴细胞的单克隆或已经被编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染的细胞或其后代产生的抗体。在一些实例中，单克隆抗体从对象中分离。单克隆抗体可具有保守氨基酸替换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本无影响。产生单克隆抗体的示例性方法是已知的，例如，参见Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，第2版.Cold Spring Harbor Publications，New York(2013)。
通常来说，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(H)和轻链(L)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变结构域基因。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。存在决定抗体分子之功能活性的五种主要的重链种类(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链均包含恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域；参见，例如Kindt等Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。在数个实施方案中，重链和轻链可变区组合以特异性地结合抗原。在另外的一些实施方案中，仅需要重链可变区。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼科(camelid)抗体在不存在轻链的情况下是有功能且稳定的(参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature，363：446-448，1993；Sheriff等，Nat.Struct.Biol.，3：733-736，1996)。提及“VH”或“VH”是指抗体重链的可变区，包括抗原结合片段，例如Fv、ScFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指抗体轻链的可变结构域，包括Fv、ScFv、dsFv或Fab的可变结构域。
轻链和重链可变区包含被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区(即成分轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和对齐CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。给定CDR的氨基酸序列边界可使用许多公知的方案中的任一种来容易地确定，包括由以下描述的那些：Kabat等(“Sequences of Proteinsof Immunological Interest，”第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991；“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等(JMB 273，927-948，1997；“Chothia”编号方案)和Lefranc等(“IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains，”Dev.Comp.Immunol.，27：55-77，2003；“IMGT”编号方案)。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端至C端)，并且通常也由其中特定CDR所定位的链来鉴定。因此，VH CDR3是来自其中存在它的抗体的重链的可变结构域的CDR3，而VL CDR1是来自其中存在它的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。轻链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR有时被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
“抗原结合片段”是保留了特异性识别同源抗原之能力的全长抗体的一部分以及这样的部分的多种组合。抗原结合片段的一些非限制性实例包括Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如，ScFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰完整抗体产生的抗原结合片段或使用重组DNA方法从头合成的那些(参见，例如，Kontermann和Dubel(编辑)，Antibody Engineering，第1至2卷，第2版，Springer出版社，2010)。
单链抗体(ScFv)是包含作为遗传融合的单链分子的通过合适的多肽接头连接的一个或更多个抗体的VH和VL结构域的经遗传改造的分子(参见，例如，Bird等，Science，242：423426，1988；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：58795883，1988；Ahmad等，Clin.Dev.Immunol.，2012，doi：10.1155/2012/980250；Marbry，IDrugs，13：543-549，2010)。ScFv中的VH结构域和VL结构域的分子内取向对于ScFv通常不是决定性的。因此，可使用具有这两种可能的排列(VH结构域-接头结构域-VL结构域；VL结构域-接头结构域-VH结构域)的ScFv。
在dsFv中，重链和轻链可变链已突变以引入二硫键从而使链的缔合稳定化。还包括双抗体，其是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但是使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：64446448，1993；Poljak等，Structure，2：1121 1123，1994)。
抗体还包括经遗传改造形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。另见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版.，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
非天然存在的抗体可使用固相肽合成来构建，可重组产生，或者可例如如Huse等，Science 246：1275-1281(1989)(其通过引用并入本文)所述通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库而获得。制备例如嵌合的、人源化的、CDR移植的、单链和双功能性抗体的这些和其他方法是本领域技术人员公知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14：243-246(1993)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，同上，1988；Hilyard等，Protein Engineering：A practical approach(IRL出版社1992)；Borrabeck，AntibodyEngineering，第2版.(Oxford University出版社1995)；其各自通过引用并入本文)。
作为参照抗体的“与相同表位结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参照抗体与其抗原结合的50％或更多的抗体，并且反过来，参照抗体在竞争性测定中阻断该抗体与其抗原结合的50％或更多。抗体竞争测定是已知的，并且本文中提供了示例性的竞争测定。
“人源化”抗体或抗原结合片段包含人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)抗体或抗原结合片段的一个或更多个CDR。提供CDR的非人抗体或抗原结合片段被称为“供体”，并且提供框架的人抗体或抗原结合片段被称为“接纳体”。在一个实施方案中，在人源化的免疫球蛋白中，所有CDR均来自供体免疫球蛋白。恒定区不需要存在，但是如果存在的话，其可与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，例如具有至少约85％至90％，例如约95％或更高的同一性。因此，除了可能的CDR之外，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分均与天然人抗体序列的相应部分基本上相同。
“嵌合抗体”是包含来源于两种不同抗体(其通常来自不同的物种)的序列的抗体。在一些实例中，嵌合抗体包含来自一种人抗体的一个或更多个CDR和/或框架区和来自其他人抗体的CDR和/或框架区。
“完全人抗体”或“人抗体”是包含来自(或来源于)人基因组的序列，但不包含来自其他物种的序列的抗体。在一些实施方案中，人抗体包含来自(或来源于)人基因组的CDR、框架区和Fc区(如果存在的话)。人抗体可使用用于基于来源于人基因组的序列产生抗体的技术来鉴定和分离，例如通过噬菌体展示或使用转基因动物(参见，例如Barbas等Phagedisplay：A Laboratory Manuel.第1版.New York：Cold Spring Harbor Laboratory出版社，2004.Print.；Lonberg，Nat.Biotech.，23：1117-1125，2005；Lonenberg，Curr.Opin.Immunol.，20：450-459，2008)。
抗体可具有一个或更多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可彼此相同或者可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体具有两个不同的结合位点。
测试抗体与CAR的任何功能性部分结合的能力的方法是本领域中已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如如放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、ELISA、Westem印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定法(参见，例如，Janeway等，见下文，美国专利申请公开No.2002/0197266 A1和美国专利No.7,338,929)。
此外，CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分可被修饰以包含可检测标记，例如如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
在以上部分B的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CDl9靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
E.缀合物
对本文中公开的一种或更多种抗原具有特异性的表达例如CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)或单克隆抗体或其抗原结合片段可使用任意数目的本领域技术人员已知的方法与试剂例如效应分子或可检测标志物缀合。可使用共价和非共价连接方式二者。缀合物包括但不限于其中存在效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段的共价连接的分子，所述抗体或抗原结合片段特异性结合本文中公开的一种或更多种抗原。本领域技术人员将理解，可使用多种效应分子和可检测标志物，包括(但不限于)化学治疗剂、抗血管生成剂、毒素、放射性试剂(例如125I、32P、14C、3H和35S)和其他标记、靶部分和配体等。
特定效应分子或可检测标志物的选择取决于特定的靶分子或细胞以及期望的生物学效应。因此，例如，效应分子可以是用于导致特定靶细胞(例如肿瘤细胞)死亡的细胞毒素。
用于将效应分子或可检测标志物附接至抗体或抗原结合片段的方法根据效应物的化学结构而变化。多肽通常包含多种官能团；例如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，其可用于与抗体上的合适官能团反应以导致效应分子或可检测标志物的结合。或者，将抗体或抗原结合片段衍生化以暴露或附接另外的反应性官能团。衍生化可涉及附接许多已知接头分子(例如，可获自Pierce Chemical Company，Rockford，IL的那些)中的任一种。接头可以是用于将抗体或抗原结合片段连接至效应分子或可检测标志物的任何分子。接头能够与抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标志物二者形成共价键。合适的接头是本领域技术人员公知的，且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标志物是多肽时，接头可通过其侧基连接至组成氨基酸(例如通过二硫键连接至半胱氨酸)或连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在数个实施方案中，接头可包含间隔区元件，其在存在时增大接头的大小，使得效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段之间的距离增大。示例性间隔区是本领域普通技术人员已知的，并且包括以下中列出的那些：美国专利No.7,964,5667、498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414，以及美国专利公开No.20110212088和20110070248，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，接头在胞内条件下是可切割的，使得在胞内环境中接头的切割从抗体或抗原结合片段释放效应分子或可检测标志物。在另一些实施方案中，接头不可切割，并且效应分子或可检测标志物例如通过抗体降解而释放。在一些实施方案中，接头可被存在于胞内环境(例如，在溶酶体或内体或陷窝(caveolea)内)中的切割剂切割。接头可以是例如肽接头，其被胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割。在一些实施方案中，肽接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。然而，接头可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长，例如1至2、1至3、2至5、3至10、3至15、1至5、1至10、1至15个氨基酸长。蛋白酶可包括组织蛋白酶(cathepsin)B和D以及纤溶酶，已知所有这些均水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内活性药物的释放(参见，例如Dubowchikand Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123)。例如，可使用可被巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶B切割的肽接头(例如，苯丙氨酸-亮氨酸或甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸接头(SEQ ID NO：186))。这样的接头的另一些实例在例如美国专利No.6,214,345中描述，其通过引用并入本文。在一个具体的实施方案中，可被胞内蛋白酶切割的肽接头是缬氨酸-瓜氨酸接头或苯丙氨酸-赖氨酸接头(参见，例如美国专利No.6,214,345，其描述了具有缬氨酸-瓜氨酸接头的多柔比星的合成)。
在另一些实施方案中，可切割接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。通常来说，pH敏感接头在酸性条件下可水解。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见，例如美国专利No.5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik and Walker，1999，Pharm.Therapeutics83：67-123；Neville等，1989，Biol.Chem.264：14653-14661)。这样的接头在中性pH条件(例如在血液中的条件)下相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。在某些实施方案中，可水解接头是硫醚接头(例如，如通过酰腙键与治疗剂连接的硫醚(参见，例如美国专利No.5,622,929)。
在另一些实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域中已知的，包括例如使用以下可形成的那些：SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB和SMPT。(参见，例如Thorpe等，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编辑，Oxford U.出版社，1987)；Phillips等，Cancer Res.68：92809290，2008)。另见美国专利No.4,880,935)。
在另一些具体实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等，1995，AnticancerRes.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰基接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在另一些实施方案中，接头不可切割，并且效应分子或可检测标志物通过抗体降解而释放(参见美国公开No.2005/0238649，其通过引用整体并入本文)。
在数个实施方案中，接头对胞外环境中的切割具有抗性。例如，当缀合物存在于胞外环境中(例如血浆中)时，缀合物的样品中不多于约20％、不多于约15％、不多于约10％、不多于约5％、不多于约3％、或不多于约1％的接头被切割。可例如通过将包含目标接头的缀合物与血浆一起孵育预定的时间段(例如，2、4、8、16或24小时)并随后对血浆中存在的游离效应分子或可检测标志物的量进行定量来确定接头是否对胞外环境中的切割具有抗性。可用于缀合物中的多种示例性接头在WO 2004-010957、美国公开No.2006/0074008、美国公开No.20050238649和美国公开No.2006/0024317中描述，其各自通过引用整体并入本文。
在数个实施方案中，提供了表达例如CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体缀合物(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、抗体或其抗原结合部分、和一种或更多种小分子毒素(例如加利车霉素(calicheamicin)、美登素类化合物(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、奥瑞斯他汀(auristatin)、单端孢菌烯(trichothecene)和CC1065)以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
适合用作美登素类化合物毒素部分的美登素化合物是本领域中公知的，并且可根据已知方法从天然来源分离，使用基因工程技术产生(参见Yu等(2002)PNAS 99：7968-7973)，或根据已知方法合成地制备美登醇和美登醇类似物。美登素类化合物是通过抑制微管蛋白聚合而发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)中分离(美国专利No.3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登素类化合物，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物例如在以下中公开：美国专利No.4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533，其各自通过引用并入本文。包含美登素类化合物的缀合物、其制备方法及其治疗用途在例如美国专利No.5,208,020、5,416,064、6,441,163以及欧洲专利EP 0 425235 B1中公开，其公开内容在此通过引用明确地并入。
另外的毒素可与表达例如CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体缀合物(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分一起使用。示例性毒素包括假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)、蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉毒素及其亚基、核毒素(ribotoxin)、核糖核酸酶、皂草毒蛋白(saporin)和加利车霉素以及肉毒杆菌毒素A至F。这些毒素是本领域中公知的，并且许多可从商业来源容易地获得(例如SigmaChemical Company，St.Louis，MO)。所考虑的毒素还包括毒素的变体(参见，例如美国专利No.5,079,163和4,689,401)。
皂草毒蛋白是来自肥皂草(Saponaria officinalis)的毒素，其通过使核糖体复合体的60S部分失活来破坏蛋白质合成(Stirpe等，Bio/Technology，10：405-412，1992)。然而，该毒素不具有特异性进入细胞的机制，并因此需要与识别细胞表面蛋白质的抗体或抗原结合片段缀合，所述细胞表面蛋白质被内化以被细胞有效地摄取。
白喉毒素分离自白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)。通常来说，用于免疫毒素的白喉毒素被突变以降低或消除非特异性毒性。具有完全酶活性但显著降低的非特异性毒性的被称为CRM107的突变体自二十世纪七十年代就已知(Laird和Groman，J.Virol.19：220，1976)，并且已被用于人临床试验。参见美国专利No.5,792,458和美国专利No.5,208,021。
蓖麻毒素是来自蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻籽)的凝集素RCA60。对于蓖麻毒素的实例，参见美国专利No.5,079,163和美国专利No.4,689,401。根据其分子量，蓖麻凝集素(Ricinus communis agglutinin，RCA)以分别为约65和120kD的被称为RCA60和RCA120的两种形式存在(Nicholson&Blaustein，J.Biochim.Biophys.Acta 266：543，1972)。A链负责使蛋白质合成失活和杀伤细胞。B链使蓖麻毒素与细胞表面半乳糖残基结合，并且有助于A链转运到胞质溶胶中(Olsnes等，Nature 249：627-631，1974和美国专利No.3,060,165)。
核糖核酸酶也与靶向分子缀合以用作免疫毒素(参见Suzuki等，Nat.Biotech.17：265-70，1999)。一些示例性核毒素(ribotoxin)(例如α-帚曲毒蛋白(α-sarcin)和局限曲菌素(restrictocin))在例如Rathore等，Gene 190：31-5，1997；和Goyal和Batra，Biochem.345 Pt 2：247-54，2000中讨论。加利车霉素首次分离自棘孢小单孢(Micromonospora echinospora)，并且是烯二炔类抗肿瘤抗生素家族的成员，其造成DNA中的双链断裂，导致凋亡(参见，例如Lee等，J.Antibiot.42：1070-87，1989)。该药物是临床试验中免疫毒素的毒性部分(参见，例如Gillespie等，Ann.Oncol.11：735-41，2000)。
相思豆毒蛋白包含来自相思子(Abrus precatorius)的毒性凝集素。毒素原理，相思豆毒蛋白a、b、c和d的分子量为约63至67kD，并且由两个二硫键连接的多肽链A和B构成。A链抑制蛋白质合成；B链(相思豆毒蛋白-b)与D-半乳糖残基结合(参见Funatsu等，Agr.Biol.Chem.52：1095，1988；以及Olsnes，Methods Enzymol.50：330-335，1978)。
对本文中公开的一种或更多种抗原具有特异性的表达例如CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、单克隆抗体、其抗原结合片段也可与可检测标志物缀合；例如能够通过以下检测的可检测标志物：ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如计算机断层扫描(computed tomography，CT)、计算机轴向断层扫描(computed axialtomography，CAT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、核磁共振成像(nuclear magnetic resonance imaging，NMRI)、磁共振断层扫描(magnetic resonancetomography，MTR)、超声、纤维镜检查和腹腔镜检查)。可检测标志物的一些具体的非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性铁氧化物纳米晶体)。例如，可用的可检测标志物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。生物发光标志物也是有用的，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)、黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein，YFP)。CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分也可与可用于检测的酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)缀合。当CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分与可检测酶缀合时，其可通过添加另外的试剂来检测，酶使用该试剂产生可辨别的反应产物。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺产生视觉上可检测的有色反应产物。CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分也可与生物素缀合，并且通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。应指出，亲和素本身可与酶或荧光标记缀合。
表达例如CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、抗体或其抗原结合部分可与顺磁性试剂(例如钆)缀合。顺磁性试剂(例如超顺磁性铁氧化物)也可用作标记。抗体也可与镧系元素(例如铕和镝)和锰缀合。抗体或抗原结合片段还可用被第二报道物识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。
表达例如CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、抗体或其抗原结合部分也可与放射性标记的氨基酸缀合。放射性标记可用于诊断目的和治疗目的二者。例如，放射性标记可用于通过x射线、发射光谱或其他诊断技术来检测本文中公开的一种或更多种抗原和表达抗原的细胞。此外，放射性标记可治疗性地用作毒素以用于在对象中治疗肿瘤，例如用于治疗神经母细胞瘤。多肽标记的一些实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
检测这样的可检测标志物的手段是本领域技术人员公知的。因此，例如，可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可使用光电检测器检测荧光标记以检测发射的照射。通常通过向酶提供底物并检测酶对底物之作用产生的反应产物来检测酶标记，并通过简单地使有色标记可视化来检测比色标记。
在以上部分C的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
F.核苷酸、表达、载体和宿主细胞
本发明的一个实施方案还提供了包含编码本文中所述的任何受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、抗体或其抗原结合部分(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可包含编码本文中所述的任何前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域和/或胞内T细胞信号传导结构域的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核苷酸序列可以是经密码子修饰的。不受特定理论的约束，认为核苷酸序列的密码子优化提高了mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可涉及将天然密码子替换成编码相同氨基酸但可被细胞内更容易获得的tRNA翻译的另一密码子，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可降低干扰翻译的二级mRNA结构，从而提高翻译效率。
在本发明的一个实施方案中，核酸可包含编码本发明CAR的抗原结合结构域的经密码子修饰的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中，核酸可包含编码本文中所述的任何CAR(包括其功能性部分和功能性变体)的经密码子修饰的核苷酸序列。
本文中使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(例如，分离和/或纯化)的，其可包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可包含天然、非天然或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，而不是存在于未经修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，如本文中所讨论的，在一些情况下，核酸包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换可以是合适的。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列或具有通过序列的两个在其他情况下分开的区段的人工组合制备的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成，或者更常见地通过分离的核酸区段的人工操作，例如通过基因工程技术(例如Sambrook等(同上)中描述的那些)来完成。可使用本领域中已知的方法基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见，例如Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)。例如，可使用天然存在的核苷酸或多种经修饰核苷酸来化学合成核酸，所述经修饰核苷酸被设计成提高分子的生物学稳定性或提高杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的一些实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，本发明的一种或更多种核酸可从公司(例如Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA))购买。
核酸可包含编码任何CAR或其功能性部分或功能性变体的任何分离的或纯化的核苷酸序列。或者，核苷酸序列可包含简并至任何序列或简并序列之组合的核苷酸序列。
一个实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，所述核酸包含与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可在高严格条件下杂交。“高严格条件”意指核苷酸序列以比非特异性杂交可检测地更强的量与靶序列(本文中所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或仅包含少数分散的错配的多核苷酸与碰巧具有少数与核苷酸序列匹配的小区域(例如，3至10个碱基)的随机序列区分开的条件。这样的互补小区域比14至17个或更多个碱基的全长互补序列更容易解链，并且高度严格杂交使得它们可易于区分。相对高严格条件包括例如低盐和/或高温条件，例如通过在约50℃至70℃的温度下由约0.02M至0.1M NaCl或等同物来提供。这样的高严格条件容许核苷酸序列与模板或靶链之间小的(如果有的话)错配，并且特别适合于检测任何本发明CAR的表达。通常认识到，通过添加提高量的甲酰胺可使条件变得更加严格。
还提供了包含与本文中所述的任何核酸具有至少约70％或更多，例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，可将核酸并入到重组表达载体中。在这一点上，一个实施方案提供了包含任何核酸的重组表达载体。为了本文中的目的，术语“重组表达载体”意指经遗传性修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下使载体与细胞接触时，其允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。载体作为整体不是天然存在的。
但是，载体的部分可以是天然存在的。重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链或双链的，合成的或部分地从天然来源获得的，并且其可包含天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连接或这两种类型的连接。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于增殖和扩增或者用于表达或用于这二者的载体，例如质粒和病毒。载体可选自pUC系列(Fermentas Life Sciences，GlenBumie，MD)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)、pET系列(Novagen，Madison，WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。
也可使用噬菌体载体，例如
Figure BPA0000312587760000731
λZapII(Stratagene)、EMBL4和λNMI149。植物表达载体的一些实例包括pBIOl、pBI101.2、pBHOl.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的一些实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。慢病毒载体是来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括自我失活性慢病毒载体，如Milone等，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的。可用于临床的慢病毒载体的另一些实例包括例如但不限于来自Oxford BioMedica plc的LENTIVECTOR.RTM.基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAX.TM.载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的并且是本领域技术人员已知的。
许多转染技术通常是本领域中已知的(参见，例如Graham等，Virology，52：456-467(1973)；Sambrook等，同上；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier(1986)；以及Chu等，Gene，13：97(1981)。
转染方法包括磷酸钙共沉淀(参见，例如Graham等，同上)、直接微量注射到培养的细胞中(参见，例如Capecchi，Cell，22：479-488(1980))、电穿孔(参见，例如Shigekawa等，BioTechniques，6：742-751(1988))、脂质体介导的基因转移(参见，例如Mannino等，BioTechniques，6：682-690(1988))、脂质介导的转导(参见，例如Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987))和使用高速微弹(microprojectile)的核酸递送(参见，例如Klein等，Nature，327：70-73(1987))。
在一个实施方案中，可使用以下中描述的标准重组DNA技术来制备重组表达载体：例如，Sambrook等，同上，以及Ausubel等，同上。可制备环状或线性的表达载体构建体，以包含在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。复制系统可来自例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其对于将酌情引入载体的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型是特异性的，并考虑载体是基于DNA还是RNA。重组表达载体可包含限制性位点以促进克隆。
重组表达载体可包括一个或更多个标记基因，其允许选择经转化或转染的宿主细胞。标记基因包含杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等。用于本发明表达载体的合适标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可包含天然或非天然启动子，所述启动子与编码CAR(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列或与和编码CAR的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。启动子(例如，强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性)的选择在技术人员的普通技术范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技术范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
重组表达载体可设计成用于瞬时表达、用于稳定表达或用于这二者。此外，可使重组表达载体用于组成型表达或用于诱导型表达。
此外，重组表达载体可被制备成包含自杀基因。本文中使用的术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达基因的细胞对试剂(例如，药物)的敏感性，并且当细胞接触或暴露于试剂时造成细胞死亡的基因。自杀基因是本领域中已知的(参见，例如，Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews，Springer，Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics，Institute ofCancer Research，Sutton，Surey，UK)，Humana出版社，2004)，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
一个实施方案还提供了包含本文中所述的任何重组表达载体的宿主细胞。本文中使用的术语“宿主细胞”是指可包含本发明重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞(即从生物体(例如人)直接分离的)。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞(即悬浮生长的细胞)。合适的宿主细胞是本领域中已知的，并且包括例如DH5a大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5a细胞。为了产生重组CAR的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。尽管宿主细胞可以是任何细胞类型，可来源于任何类型的组织，并且可处于任何发育阶段，但宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)或外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。宿主细胞可以是T细胞。
为了本文中的目的，T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系(例如Jurkat、SupTl等)的T细胞，或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，则T细胞可获自多种来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。T细胞也可以是富集或纯化的。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、记忆干细胞(即Tscm)、幼稚T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在一个实施方案中，本文中所述的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体可用于合适的非T细胞。这样的细胞是具有免疫效应功能的那些，例如如NK细胞和由多能干细胞产生的T样细胞。
一个实施方案还提供了包含本文中所述的至少一种宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异质群，其包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞，此外还包含至少一种不含任何重组表达载体的其他细胞(例如宿主细胞(例如T细胞))，或者T细胞以外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以是基本上同质群，其中群主要包含(例如，基本上由其组成)含有重组表达载体的宿主细胞。群也可以是细胞的克隆群，其中群的所有细胞都是包含重组表达载体的单宿主细胞的克隆，使得群的所有细胞都包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有本文中所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群。
可分离和/或纯化CAR(包括其功能性部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)。例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是其中宿主细胞比体内天然环境中细胞的纯度更高的制备物。这样的宿主细胞可例如通过标准纯化技术来生产。在一些实施方案中，纯化宿主细胞的制备物，使得宿主细胞占制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％、约70％或约80％，或者可以是约100％。
在以上部分D的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体核苷酸、表达载体和宿主细胞之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
G.治疗方法
预期本文中公开的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)可用于在哺乳动物中治疗或预防疾病的方法。在这点上，一个实施方案提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括向哺乳动物施用在哺乳动物中有效治疗或预防癌症之量的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体和/或其抗原结合部分和/或药物组合物。
一个实施方案还包括在施用本文中公开的CAR之前对哺乳动物进行淋巴细胞清除(lymphodepleting)。淋巴细胞清除的一些实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除化学治疗、清髓性淋巴细胞清除化学治疗、全身辐照等。
对于其中施用宿主细胞或细胞群的方法，细胞可以是哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。本文中使用的同种异体意指来源于与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或更多个基因座的基因不同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。在一些方面中，来自相同物种的个体的同种异体材料可以是基因上足够不同以抗原性地相互作用。本文中使用的“自体”意指来自随后重新引入材料的个体的同一个体的任何材料。
本文中提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文中使用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，以及兔形目(Lagomorpha)的哺乳动物，例如兔。哺乳动物可来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或者奇蹄目(order Perissodactyla)，包括马科(马)。哺乳动物可以是灵长目、Ceboid或Simoid(猴)，或者类人猿目(order Anthropoids)(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
对于所述方法，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、肺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌症(例如膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠的类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。
本文中使用的术语“治疗”和“预防”以及从其来源的词语不必需意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果即可。在这一点上，该方法可提供对哺乳动物中癌症的任何量或任何水平的治疗或预防。
此外，由该方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防所治疗或预防的疾病(例如，癌症)的一种或更多种病症或症状。而且，为了本文中的目的，“预防”可涵盖延迟疾病或其症状或病症的发作。
另一个实施方案提供了在哺乳动物中检测癌症之存在的方法，其包括：(a)使来自哺乳动物的包含一个或更多个细胞的样品与CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体和/或其抗原结合部分或药物组合物接触，从而形成复合体，(b)以及检测该复合体，其中复合体的检出指示哺乳动物中癌症的存在。
样品可通过任何合适的方法(例如活检或尸检)获得。活检是从个体中取出组织和/或细胞。这样的取出可以是从个体收集组织和/或细胞，以便在取出的组织和/或细胞上进行实验。该实验可包括确定个体是否具有和/或患有某病症或疾病状态的实验。病症或疾病可以是例如癌症。
关于在哺乳动物中检测增殖性病症(例如癌症)之存在的方法的一个实施方案，包含哺乳动物细胞的样品可以是包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物级分(例如，核或胞质级分、全蛋白质级分或核酸级分)的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
接触可相对于哺乳动物在体外或体内发生。优选地，接触是体外的。
此外，复合体的检测可通过本领域中已知的任意数量的方式进行。例如，可用可检测标记(例如如上文公开的放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒))来标记本文中公开的CAR、本文中所述的多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或其抗原结合部分。
测试CAR识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域中已知的。例如，Clay等，J.Immunol，163：507-513(1999)教导了测量细胞因子(例如，干扰素-γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(granulocyte/monocyte colony stimulating factor，GM-CSF)、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a，TNF-a)或白介素2(interleukin 2，IL-2))释放的方法。另外，可通过测量细胞的细胞毒性来评价CAR功能，如Zhao等，J.Immunol.174：4415-4423(2005)中所述。
另一个实施方案提供了本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物用于在哺乳动物中治疗或预防增殖性病症(例如癌症)的用途。癌症可以是本文中所述的任何癌症。
任何施用方法都可用于所公开的治疗剂，包括局部施用和全身施用。例如，可使用表面、经口、血管内(例如静脉内)、肌内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内和皮下施用。具体施用方式和剂量方案将由主治临床医生考虑病例的详情(例如，对象、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)来选择。在其中施用多于一种药剂或组合物的情况下，可使用一种或更多种施用途径；例如，化学治疗剂可经口施用，并且抗体或抗原结合片段或缀合物或组合物可静脉内施用。施用方法包括注射，其中CAR、CAR T细胞、缀合物、抗体、抗原结合片段或组合物提供在无毒可药用载体(例如水、盐水、林格液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、固定油、油酸乙酯或脂质体)中。在一些实施方案中，可使用所公开化合物的局部施用，例如通过将抗体或抗原结合片段施用于除去肿瘤的组织区域或怀疑易于发生肿瘤的区域。在一些实施方案中，包含治疗有效量的抗体或抗原结合片段的药物制剂的持续肿瘤内(或肿瘤旁)释放可以是有益的。在另一些实例中，将缀合物作为滴眼剂表面施用于角膜，或玻璃体内施用到眼中。
所公开的治疗剂可配制成适合精确剂量的单独施用的单位剂型。另外，所公开的治疗剂可以以单剂量或多剂量方案施用。多剂量方案是其中主要治疗过程可具有多于一个分开的剂量(例如1至10个剂量)，然后根据需要以随后的时间间隔给予其他剂量以维持或加强组合物的作用的方案。治疗可涉及在数天到数个月甚至数年的时期中化合物的每日剂量或多个每日剂量。因此，剂量方案还将至少部分地基于待治疗的对象的特定需求来确定，并将取决于施用操作者的判断。
抗体或缀合物的典型剂量可以是约0.01至约30mg/kg，例如约0.1至约10mg/kg。
在一些具体的实例中，以多个每日给药方案(例如至少两个连续日，10个连续日等，例如持续数周、数月或数年的时间)，向对象施用包含缀合物、抗体、组合物、CAR、CAR T细胞或另外的药剂中的一种或更多种的治疗组合物。在一个实例中，向对象施用缀合物、抗体、组合物或另外的药剂至少30天，例如至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月的时间。
在一些实施方案中，所公开的方法包括与所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR或表达CAR的T细胞组合，向对象提供手术、放射治疗和/或化学治疗剂(例如，先后地、基本上同时或同时)。这样的药剂和治疗的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医生确定。另外的药剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由熟练的从业人员根据经验确定。这样的化学治疗的制备和给药方案也在ChemotherapyService，(1992)编辑，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD中描述。
在一些实施方案中，组合治疗可包括向对象施用治疗有效量的另外的癌症抑制剂。可与组合治疗一起使用的另一些治疗剂的一些非限制性实例包括微管结合剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂、DNA和RNA转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂、基因调节剂和血管生成抑制剂。这些药剂(以治疗有效量施用)和治疗可单独或组合使用。例如，可将任何合适的抗癌剂或抗血管生成剂与本文中公开的CAR、CAR-T细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物组合施用。这样的药剂的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医生确定。
另外的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，例如氮芥类(例如，苯丁酸氮芥、二氯乙基甲胺(chlormethine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)、亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀和链脲霉素)、铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂和BBR3464)、白消安、达卡巴嗪、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派和乌拉莫司汀(uramustine)；抗代谢物类，例如叶酸类(例如，甲氨喋呤、培美曲塞和雷替曲塞)、嘌呤类(例如，克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤和硫鸟嘌呤)、嘧啶类(例如，卡培他滨)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和吉西他滨；植物生物碱，例如鬼臼类(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷类(例如，多西他赛和紫杉醇)、长春花类(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如蒽环类家族成员(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、博来霉素、利福平、羟基脲和丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康和伊立替康；单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗；光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、卟吩姆钠(porfimer sodium)和维替泊芬；以及另一些药剂，例如阿利维A酸、六甲蜜胺、安丫啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿西替尼、贝沙罗汀、贝伐单抗、硼替佐米、塞来昔布、地尼白介素(denileukin diftitox)、厄罗替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、喷司他丁、马索罗酚(masoprocol)、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、他莫昔芬、索拉非尼、舒尼替尼、威罗菲尼(vemurafinib)、凡德他尼和维甲酸。这样的药剂的选择和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医生确定。
组合治疗可提供协同作用并证明是协同的，即当活性成分一起使用时实现的效果大于单独使用化合物所产生的效果的总和。当活性成分为如下时可获得协同作用：(1)在组合的单位剂型中共配制并同时施用或递送；(2)作为独立制剂交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案。当交替递送时，例如通过在分开的注射器中的不同注射先后施用或递送化合物时可获得协同作用。一般来说，在交替期间，先后(即，依次)施用每种活性成分的有效剂量，而在组合治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量一起施用。
在一个实施方案中，在抗癌治疗之后将有效量的与本文中公开的一种或更多种抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段或其缀合物施用于患有肿瘤的对象。在已经流逝了足够量的时间以允许所施用的抗体或抗原结合片段或缀合物与各癌细胞上表达的抗原形成免疫复合体之后，检测免疫复合体。免疫复合体的存在(或不存在)指示治疗的有效性。例如，与在治疗之前取得的对照相比免疫复合体的提高指示治疗是无效的，而与在治疗之前取得的对照相比免疫复合体的降低指示治疗是有效的。
在以上部分E的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体的治疗方法之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
H.生物药物组合物
本文中提供了用于基因治疗、免疫治疗和/或细胞治疗的生物药物或生物制品组合物(以下称为“组合物”)，所述组合物包含在载体(例如可药用载体)中的所公开的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR或表达与本文中公开的一种或更多种抗原特异性结合的CAR的T细胞中的一种或更多种。该组合物可制备成单位剂型用于向对象施用。施用的量和时间由治疗临床医生决定，以达到期望的结局。组合物可配制用于全身(例如静脉内)或局部(例如肿瘤内)施用。在一个实例中，公开的CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物配制成用于肠胃外施用，例如静脉内施用。包含如本文中公开的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物用于例如治疗和检测肿瘤，例如但不限于神经母细胞瘤。在一些实例中，组合物可用于治疗或检测癌。包含如本文中公开的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物还用于例如检测病理性血管生成。
用于施用的组合物可包含溶解在可药用载体(例如水性载体)中的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的溶液。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。这些组合物可通过常规、公知的灭菌技术灭菌。所述组合物可根据需要包含可药用辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、辅助剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中，CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的浓度可广泛地变化，并将主要根据所选择的具体施用方式和对象的需要基于流体体积、黏度、体重等来进行选择。制备用于基因治疗、免疫治疗和/或细胞治疗的这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或将是明显的。
用于静脉内施用的典型组合物包含每个对象每天约0.01至约30mg/kg抗体或抗原结合片段或缀合物(或相应剂量的CAR、或表达CAR的T细胞、包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。制备可施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员来说将是已知的或明显的，并且在出版物如Remington’s Pharmaceutical Science，第19版，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1995)中更详细地描述。
CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物可以以经冻干的形式提供，并且在施用之前用无菌水再水化，但是其也可以以已知浓度的无菌溶液提供。然后将CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的溶液添加至输注袋，所述输注袋包含0.9％氯化钠(USP)，并且在一些情况下以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。本领域中在施用抗体或抗原结合片段和缀合物药物中有相当多的经验可获得；例如，自1997年批准
Figure BPA0000312587760000831
以来，抗体药物已在美国上市。CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、其抗原结合片段和缀合物可通过缓慢输注而不是通过静脉内推注或快速浓注(bolus)施用。在一个实例中，施用较高负荷剂量，随后将施用剂量维持在较低水平。例如，4mg/kg抗体或抗原结合片段(或相应剂量的包含抗体或抗原结合片段的缀合物)的初始负载剂量可在约90分钟的时间内输注，然后如果先前的剂量良好耐受，则每周2mg/kg的维持剂量在约30分钟的时间内输注，持续4至8周。
控释胃肠外制剂可制备为植入物、油性注射剂或制备为颗粒体系。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见，Banga，A.J.，Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Technomic Publishing Company，Inc.，Lancaster，PA，(1995)。颗粒体系包括微球、微粒、微囊、纳米囊、纳米球和纳米粒。微囊包含治疗性蛋白质(例如细胞毒素或药物)作为中心核。在微球中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微囊通常分别被称为纳米粒、纳米球和纳米囊。毛细血管具有约5μm的直径，所以仅纳米粒是静脉内施用的。微粒的直径通常为约100μm，并且皮下或肌内施用。参见例如Kreuter，J.，Colloidal Drug Delivery Systems，J.Kreuter，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，第219至342页(1994)；和Tice&Tabibi，Treatise onControlled Drug Delivery，A.Kydonieus，编辑，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，第315至339页，(1992)。
聚合物可用于本文中公开的CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物组合物的离子受控的释放。用于受控的药物递送的多种可降解和不可降解的聚合物基质是本领域中已知的(Langer，Accounts Chem.Res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温下作为黏性流动液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。已显示其是配制和持续递送重组白介素-2和脲酶的有效载剂(Johnston等，Pharm.Res.9：425-434，1992；和Pec等，J.Parent.Sci.Tech.44(2)：58-65，1990)。或者，羟基磷灰石已被用作蛋白质受控释放的微载体(Ijntema等，Int.J.Pharm.112：215-224，1994)。在另一个方面中，脂质体用于脂质封装之药物的受控释放以及药物靶向(Betageri等，Liposome Drug DeliverySystems，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。用于治疗性蛋白质的受控递送的许多另外的系统是已知的(参见美国专利No.5,055,303、美国专利No.5,188,837、美国专利No.4,235,871、美国专利No.4,501,728、美国专利No.4,837,028、美国专利No.4,957,735、美国专利No.5,019,369、美国专利No.5,055,303、美国专利No.5,514,670、美国专利No.5,413,797、美国专利No.5,268,164、美国专利No.5,004,697、美国专利No.4,902,505、美国专利No.5,506,206、美国专利No.5,271,961、美国专利No.5,254,342和美国专利No.5,534,496)。
在以上部分F的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体组合物之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
I.药盒
在一个方面中，还提供了使用本文中公开的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体(例如基于CAR、细胞因子、趋化因子、运输受体、双特异性抗体、中和/阻断抗体、T细胞刺激受体、截短的抑制性受体、杂合的抑制性/活化受体、抗凋亡蛋白、shRNA、蛋白酶的)的药盒。例如，用于在对象中治疗肿瘤或制备表达本文中公开的一种或更多种CAR的CART细胞的药盒。药盒通常将包含如本文中公开的公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞。可在药盒中包含多于一种所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞。
药盒可包含容器和在容器上或与容器缔合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器通常容纳包含所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞中的一种或更多种的组合物。在数个实施方案中，容器可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，其具有可被皮下注射针头刺穿的塞)。标签或包装插页指示组合物用于治疗特定病症。
标签或包装插页通常还将包含例如在治疗或预防肿瘤或制备CAR T细胞的方法中使用所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞的说明书。包装插页通常包含习惯上包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这样的治疗产品的适应证、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。指导材料可以是以电子形式(例如计算机软盘或光盘)书写的，或者可以是可视的(例如视频文件)。药盒还可包含另外的组分以有利于为其设计药盒的特定应用。因此，例如，药盒可另外地包含检测标记的手段(例如酶标记的酶底物、检测荧光标记的滤波装置、合适的次级标记(例如二抗)等)。药盒可另外包含常规用于实践特定方法的缓冲剂和其他试剂。这样的药盒和合适的内容物是本领域技术人员公知的。
在以上部分G的每个前述叙述中，除上文所述的基于CAR的受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体之外，受表面抗原调节的启动子-治疗性载荷构建体还可包含含有以下中的一种或更多种的多种其他治疗方式：细胞因子，包含IL-2、IL-15、IL-7、TNFa、IFNγ、IFNβ、IFNα、IL-21、IL-33、IL-22、IL-6、IL-10、IL-9、IL-4、IL-12、TGFβ、IL-17、IL-18；趋化因子，包含CCR4、CCR6、CXCR5；运输受体，例如细胞因子受体，例如但不限于CCR4、CCR7、CCR2；双特异性抗体，包括双特异性T细胞接合物(BiTE)，例如但不限于抗CD3和抗CD19靶向抗体或其他多靶向的抗体；中和/阻断抗体，例如但不限于针对PD-L1、IL-6R、IL-1R的，表达为scFv或IgG，或为其他构型的；T细胞刺激受体；截短的抑制性受体；杂合的抑制性/活化受体，例如但不限于与CD28的胞内结构域融合的PD-1的胞外结构域；抗凋亡蛋白，例如但不限于BCL-2或BCL-XL；shRNA；蛋白酶；第二CAR T构建体；或其任意组合；各自均具有其如上文所列的前述生物学特性。
实施例
通过以下实施例进一步举例说明了本发明，这些实施例不应以任何方式被解释为对本发明范围加以限制。相反，应清楚地理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围的情况下，可采取多种其他实施方案、修改及其等同方案，在阅读了本文中的描述之后，所述其他实施方案、修改及其等同方案本身已向本领域技术人员提示。
实施例1
靶向CD19抗原的自驱动的CAR构建体的产生
尽管基于抗CD19(例如CAR LTG1563)的癌症治疗在临床上取得了成功，但是在一个方面的次优的CAR活化和持续性以及在另一方面的CAR过度活化和相关毒性(CRS、神经毒性)提出了问题。为了提高CAR T治疗的安全性和效力，产生了自驱动的CAR。
在本实施例中，描述了利用CAR信号传导以通过两种机制调节其自身表达和共调节的转基因之表达的CAR T细胞，以及这些机制在CAR表达之外的用途：
1.通过细胞因子(例如IL-2/IL-15/IL-7)驱动的STAT5响应元件(STAT5_RE)对CART表达的正调节，其诱导CAR分子(例如抗CD19CAR LTG1563)的表达。当CAR T检测到肿瘤抗原时，缓慢的正反馈环被激活，这提高了CAR T细胞上的CAR表达。一旦肿瘤被消除，正反馈环逐渐减小并关闭，从而自然地降低CAR表面表达并使其回到监测状态(图1)。
2.通过细胞因子(例如IL-2/IL-15/IL-7/TNFα)驱动的和CAR/TCR驱动的AP1/NFκB响应元件(AP1/NFκB_RE)的组合对CAR T表达的正调节，其诱导CAR分子(例如CAR LTG1563)的表达。当CAR T检测到肿瘤抗原时，快速的正反馈环被激活，这提高了CAR-T细胞上的CAR表达。随着时间的推移，相对于组成型表达的CAR，AP1/NFκB驱动的CAR LTG1563表现出更大的CD19依赖性杀伤活性、提高的细胞因子分泌、降低的耗竭和CAR T细胞的整体适应性。一旦肿瘤被消除，正反馈环逐渐减小并关闭，从而自然地降低CAR表面表达并使其回到监测状态(图1)。
3.在存在CAR抗原的情况下表达另外的蛋白质以调节CAR T功能，其包括但不限于：负T细胞调节(显性负TGFBRII受体、抗PD1抗体等)的逃逸、T细胞生长的正调节子(IL15、IL12等)、T细胞归巢至肿瘤(趋化因子受体)，以及更接近于肿瘤微环境(基质金属蛋白酶)，或者一个组成型CAR和第二诱导型CAR，例如两种CAR均由相同的慢病毒载体编码，并且例如诱导型CAR由于组成型CAR的活化而表达。第二CAR可靶向第二肿瘤抗原，或在髓样来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)上表达的抗原(例如CD33、间皮素)或在抑制性B细胞上表达的抗原(例如，CD19)。在每种情况下，这些诱导型蛋白质将在存在CAR刺激的情况下表达，并在CAR信号传导终止之后下调。
4.STAT5_RE与AP1/NFκB_RE启动子可用于以限定的方式调节CAR蛋白或T细胞功能调节蛋白的自表达。STAT5_RE的更大的细胞因子(IL2)依赖性响应(图3)可用于在CAR-T细胞中以肿瘤附近的旁分泌方式表达不直接响应于抗原的蛋白质。或者，由于通过该元件的最大响应需要CAR信号传导，因此蛋白质可在响应于肿瘤的CAR T细胞中通过AP1/NFκB_RE特异性地表达(图4)。
材料和方法：
表达嵌合抗原受体(CAR)的载体的产生
为了产生新的CAR LTG1563跨膜结构域，使用了取向为VL至VH并通过(GGGGS)3柔性链内接头(SEQ ID NO：187)连接的来源于FMC-63小鼠杂交瘤的单链可变片段(scFv)(FMC-63：第1至267位AA，GenBank ID：HM852952.1)。然后将所得靶向结构域与人CD8铰链(第138至179位AA，参考序列ID NP_001759.3)、人TNF受体超家族19跨膜结构域(TNFRSF19，第167至196位AA、UntProt序列ID：Q9NS68)、人4-1BB共刺激结构域(CD137，第214至255位AA，UniProt序列ID：Q07011)和人CD3ζ信号传导结构域(CD247，第52至163位AA，参考序列ID：NP_000725.1.)框内连接。包含来自人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体α亚基(第1至22位AA，GenBank ID：EAW98673.1)的前导序列以促进细胞表面处的CAR表达。在下述受表面抗原调节的诱导型启动子或作为对照的组成型MSCV或EF1α启动子的调节下，将CAR序列进行密码子优化并克隆到第三代慢病毒质粒骨架中。
用于证明CAR活性的细胞系
除非另有说明，否则伯基特淋巴瘤细胞系Raji细胞系、慢性髓细胞性白血病系K562系和试剂均购自美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)(ATCC，Manassass，VA)。将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(fetal bovine serum)(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾系293T购自ATCC并在CD FortiCho培养基(Gibco/ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)中增殖。通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，随后克隆和选择萤光素酶阳性克隆产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。
用于证明CAR活性的原代人T细胞
在捐赠者的书面同意下，从Oklahoma血液研究所(Oklahoma Blood Institute，OBI)的健康志愿者中收集全血。经处理的血沉棕黄层购自OBI(Oklahoma City，OK)。使用CD4-和CD8-微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)的1∶1混合物根据制造商的方案通过阳性选择从血沉棕黄层中纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
原代T细胞转导
将来自正常供体的人原代CD4+和CD8+T细胞在TexMACS培养基中以1×106个细胞/ml的密度培养，在第0天用CD3/CD28
Figure BPA0000312587760000881
GMP T细胞TransAct试剂活化(所有试剂均来自Miltenyi Biotec)，并在第1/2天用编码CAR构建体的LV转导过夜，并在第2/3天更换培养基。如所描述的进行细胞因子(IL-2、TNFα；Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)补充。使培养物增殖直至在第5至6天收获以用于共孵育分析。
免疫效应物测定(CTL和细胞因子)
对于长期共孵育测定，如上使表达CAR T效应物和GFP的靶细胞增殖，并利用流式细胞术分析来确定靶细胞群杀伤的程度以及CAR T群存活和扩增。基于前向和侧向散射以及活(7AAD-阴性)细胞对细胞进行设门。基于Raji靶标的GFP阳性和CAR T效应物的CD3，确定共培养之后存活细胞的百分比。另外，通过用CD19 Fc肽随后是抗Fc(Fab’)2-FL试剂进行染色来确定活的CD3阳性细胞中的CAR T表达。
结果：
通过将来源于GMCSFR的前导肽序列、全人抗人CD19 ScFv序列、CD8铰链、TNFRSF19跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z激活结构域框内组合设计靶向CD19抗原的全人CART构建体。
通过将CAR LTG1563表达置于串联STAT5响应元件随后是最小启动子序列的控制下设计CAR正调节环。当IL-2结合T细胞表面上的天然IL-2受体时，启动Jak/STAT信号传导，STAT5易位至CAR启动子的调节区并增强CAR表达。构建组成型表达的EF1α启动子驱动的CARLTG1563作为对照，并与受STAT-5和AP1/NFκB调节的CAR并行测试。在图1中描绘了通过(1)IL-2驱动的Stat5和(2)IL-2/TNFα和CAR驱动的AP1/NFκB介导的机制进行的正CAR调节的方案，并且在图2中描绘了这些构建体中的每一个的结构。
使用CD4和CD8珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物通过免疫原性选择，从两名不相关健康供体的血液中纯化T细胞。如材料和方法中所述，在不存在细胞因子补充的情况下，用CAR LTG1563构建体转导细胞。实验组包括在MOI 10下由EF1α启动子驱动的CD19 CAR，或具有STAT5_RE CAR LTG1563和AP1/NFκB_RE CAR LTG1563(在0.25％体积/体积LV制备物下正调节的自驱动的CAR)(图3)。在相同条件下培养的未经转导细胞(UTD)用作阴性对照。在第5天，选择组接受IL-2或TNFα补充，并在20小时之后通过流式细胞术检测CAR表达。根据转导的MOI，EF1α驱动的CAR表达为30％至40％，并且不因IL-2/TNFα补充而变化。相比之下，STAT5_RE CAR表达通过IL-2补充显著增强，但通过TNFα补充并未显著增强，如预期的那样(图3)。AP1/NFκB_RE CAR表达通过IL-2和TNFα二者均增强，但程度低于IL-2驱动的STAT5_RE CAR LTG1563表达。
此外，在该实验中，通过CD19抗原刺激评估了STAT5和AP1/NFκB响应元件二者驱动CAR LTG1563表达的自驱动特性(图4)。这是使用来自供体A和供体B的CAR T细胞与稳定表达GFP的CD19阳性Raji NHL肿瘤细胞共培养进行的。引人注目的是，在刺激之后20小时内，在AP1/NFκB_RE驱动的CAR LTG1563 T细胞中强烈诱导了CAR表达(图4B)，证明了当将这些响应元件用于驱动CAR时CAR信号传导和CAR依赖性细胞因子表达二者的整合。这种刺激比单纯通过用细胞因子刺激这些细胞可观察到的大得多，表明了对CAR信号传导的更强的直接响应。这种快速的AP1/NFκB依赖性CAR上调与组成型表达的EF1α驱动的CAR LTG1563形成鲜明对比，后者因CD19抗原介导的CAR刺激而暂时降低(可能是由于这些受体的内化)。相比之下，STAT5_RE驱动的CAR LTG1563是通过与CD19+Raji细胞共培养诱导的，但时间尺度比对于AP1/NFκB驱动的CAR LTG1563所观察到的长得多。这可能反映了STAT5响应元件的功能性、通过CAR T细胞产生IL2和伴随的STAT5信号传导所需的中间步骤。从活化之后D3至D5的这些细胞的IL2补充显著提高了通过STAT5元件对CAR LTG1563表达的诱导，这可能是通过引发STAT介导的信号传导进行的。
值得注意的是，可在用CD19+Raji细胞多重刺激(活化之后D6至D22)期间重诱导AP1-NFκB CAR LTG1563的表达，这表明CAR T细胞保持了AP1/NFκB信号传导响应性，即使在长期离体培养期间也是如此(数据未显示)。重要的是，在AP1/NFκB启动子的控制下的CAR表达的程度暂时地与共培养物中Raji细胞的数目相当好地相关(数据未显示)。这些结果表明，在存在同源CD19抗原的情况下，AP1/NFκB元件快速驱动CAR LTG1563表达，而在不存在抗原的情况下，CAR LTG1563被快速下调。
在接下来的实验中，使用CD4和CD8珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物通过免疫原性选择从三名不相关健康供体的血液中纯化T细胞。如材料和方法中所述，在不存在细胞因子补充的情况下，在活化之后D1时用CAR LTG1563构建体转导细胞。实验组包括由组成型EF1α来源的CAR驱动的CD19 CAR，STAT5 RE CAR LTG1563和AP1-NFκB CAR LTG1563用MOI为10的LV转导(图3)。在样品的亚组中，从活化之后D3至D6进行IL2补充(30IU/mL)，以引发STAT5 RE CAR LTG1563和AP1/NFκB CAR LTG1563二者的表达。通过将CAR T细胞与稳定表达GFP的CD19+Raji NHL细胞共培养来评估CAR LTG1563依赖性细胞毒性。使用非常低的效应物与靶标比(1∶3 CAR T∶Raji细胞)，并通过从活化之后D6至D13(共培养1)GFP+Raji细胞的流式细胞术计数来评估CD19依赖性细胞毒性。通过从活化之后D13至D20(共培养2)以类似的效应物与靶标比(1∶3共培养物1∶Raji细胞)再刺激细胞来评估CAR T细胞的长期功能和扩增。
检查与靶细胞共孵育的CAR T，持续了总共14天(共培养1&2)，在此期间，通过流式细胞术分析对活的Raji和T细胞的数目进行计数(图5)。尽管在仅Raji组和UTD对照组中的Raji细胞继续不受阻碍地生长至实验第8天，但CAR LTG1563 T细胞在所有组中均强烈抑制Raji扩增，而不论IL2引发如何。值得注意的是，STAT5 RE和AP1/NFκB CAR LTG1563二者在整个初始共培养(共培养1)期间在肿瘤杀伤方面均优于EF1αCAR LTG1563，如在Raji添加之后在第1、2、3、6和7天测量的(图5B)。引人注目的是，尽管在IL2-培养物中初始CAR LTG1563表达低，但STAT5RE和AP1/NFκB二者均优于组成型表达EF1α的CAR LTG1563构建体(图5B)。这潜在地表明，在不存在同源抗原的情况下(即使持续较短时间(活化之后D2至D6))，CAR的组成型表达也可负面影响CAR T细胞的效力，这可能是由于强直信号传导。
此外，通过用CD19+Raji细胞再刺激CAR T细胞来评估CAR LTG1563依赖性细胞毒性的长期分析。所有CAR组再次证明对Raji扩增的有效抑制(数据未显示)，其中与组成型表达的EF1α_CAR LTG1563相比，AP1/NFκB驱动的CAR LTG1563显示出优越的肿瘤杀伤功能(图5B)。在整个培养期间，表达AP1/NFκB_CAR LTG1563的T细胞比表达STAT5RE_CAR LTG1563或EF1α_CAR LTG1563的T细胞扩增至更大的程度(图5C)。这可能是由于仅当靶CD19+细胞也存在时才存在CAR信号传导，从而保持这些细胞的整体健康并导致伴随更大的T细胞扩增。
总体而言，所述结果证明了诱导型自驱动的AP1/NFκB RE CAR LTG1563的优越性，其表现为较低的未经刺激的CAR表达和较低的耗竭易感性、由细胞因子补充引起的低水平引发以及在存在肿瘤Raji细胞的情况下的快速上调和持续表达。另外，在初始活性方面，与在组成型EF1α启动子的控制下的相同CAR构建体相比，观察到了优越的CTL功能。相对于所有其他受试构建体，由于抗原刺激，这与这些AP1/NFκB CAR T细胞的更大整体扩增相关。
实施例2
自驱动表达向辅助蛋白的扩展
鉴于诱导型AP1/NFκB启动子在自驱动高水平CAR LTG1563表达方面，特别是在存在同源CAR抗原(CD19)的情况下的成功，期望将该启动子的功能扩展至辅助蛋白，为CAR-T细胞提供另外的功能。CAR抗原诱导型AP1/NFκB启动子的优势在于，在该启动子的控制下的任何蛋白质仅当存在CAR肿瘤抗原时才高度表达。因此，AP1/NFκB启动子被用于表达使CAR-T细胞逃避免疫抑制的蛋白质，例如显性负TGF-β受体(TGFBRIIdn)和显性负程序性细胞死亡蛋白1(PD1dn)。预期这些显性负受体使CAR-T细胞分别通过TGF-β或PD-L1逃避免疫抑制。使用AP1/NFκB启动子的预期优势在于在患者中TGF-β/PD-L1免疫抑制在正常条件下发挥重要作用，以防止T细胞介导的自身免疫的发生。然而，许多癌症的微环境的特征在于TGF-β和/或PD-L1的过表达，这可阻止T细胞或CAR-T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。因此，表达这些显性负受体(特别是在存在肿瘤细胞的条件下)将是高度有利的。
材料和方法：
表达显性负受体的载体的产生
为了产生显性负受体TGFBRIIdn和PD1dn，将蛋白质与表达CAR LTG1563的载体(LTG1563)框内连接。在CAR LTG1563序列的下游，引入由以下组成的经切割的核糖体跳读位点(FP2AF)：与来源于猪捷申病毒-1多蛋白(第976至997位AA，GenBank ID：CAB40546.1，突变的残基为P977S)的核糖体跳读位点(P2A)融合的共有弗林蛋白酶切割位点(氨基酸；RAKR(SEQ ID NO：188))，所述核糖体跳读位点(P2A)与共有弗林蛋白酶切割序列(氨基酸：RAKR(SEQ ID NO：188))融合。在TGFBRIIdn单表达载体(LTG2864和LTG2867)中，所得CARLTG1563-FP2AF序列与显性负TGF-β受体II序列(TGFBRII：第1至191位AA，Uniprot ID：P37173)共表达。在PD1dn单表达载体(LTG2864和LTG2867)中，所得CAR LTG1563-FP2AF序列与显性负PD1受体(PD1：第1至199位AA，Uniprot ID：Q15116)共表达。
在CAR-FP2AF-PD1dn-P2AF-TGFBRIIdn表达载体中，CAR LTG1563-FP2AF与显性负PD1受体(PD1：第1至199位AA，Uniprot ID：Q15116)随后是与来源于猪捷申病毒-1多蛋白(第976至997位AA，GenBank ID：CAB40546.1，突变的残基P977S)的核糖体跳读位点(P2A)融合的共有弗林蛋白酶切割序列(氨基酸：RAKR(SEQ ID NO：188))共表达，并且其继而与显性负TGF-β受体II序列(TGFBRII：第1至191位AA，Uniprot ID：P37173)共表达。在受表面抗原调节的诱导型启动子AP1/NFκB或作为对照的组成型EF1α启动子的调节下，将蛋白质序列进行密码子优化并克隆到第三代慢病毒质粒骨架中。
用于证明CAR活性的细胞系
除非另有说明，否则伯基特淋巴瘤细胞系Raji细胞系、慢性髓细胞性白血病系K562系和试剂均购自美国组织培养物保藏中心(ATCC，Manassass，VA)。将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(Thermo FisherScientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾系293T购自ATCC并在CDFortiCho培养基(Gibco/Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)中增殖。通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，随后克隆和选择萤光素酶阳性克隆产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。
用于证明CAR活性的原代人T细胞
在捐赠者的书面同意下，从Oklahoma血液研究所(OBI)的健康志愿者中收集全血。经处理的血沉棕黄层购自OBI(Oklahoma City，OK)。使用CD4-和CD8-微珠(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)的1∶1混合物根据制造商的方案通过阳性选择从血沉棕黄层中纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
原代T细胞转导
将来自正常供体的人原代CD4+和CD8+T细胞在TexMACS培养基中以1×106个细胞/ml的密度培养，在第0天用CD3/CD28
Figure BPA0000312587760000931
GMP T细胞TransAct试剂活化(所有试剂均来自Miltenyi Biotec)，并在第1/2天用编码CAR构建体的LV转导过夜，并在第2/3天更换培养基。如所描述的进行细胞因子(IL-2、TNFβ；Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)补充。使培养物增殖直至在第5至6天收获以用于共孵育分析。
免疫效应物测定(CTL和细胞因子)
对于长期共孵育测定，如上使表达CAR T效应物和GFP的靶细胞增殖，并利用流式细胞术分析来确定靶细胞群杀伤的程度以及CAR T群存活和扩增。基于前向和侧向散射以及活(7AAD-阴性)细胞对细胞进行设门。基于Raji靶标的GFP阳性和CAR T效应物的CD3，确定共培养之后存活细胞的百分比。另外，通过用CD19 Fc肽随后是抗Fc(Fab’)2-FL试剂进行染色来确定活的CD3阳性细胞中的CAR T表达。还确定了PD1和TGFBRII表达(涵盖转基因PD1dn和TGFBRIIdn二者以及天然PD1和TGFBRII蛋白)。
结果：
CAR LTG1563构建体的自驱动能力被扩展至包括辅助组分，以向CAR-T细胞或CAR添加另外的功能。在这种情况下，缺乏TGFBRII(TGFBRIIdn)或PD1(PD1dn)的胞内信号传导结构域的显性负受体通过核糖体跳读位点(P2A)与CAR LTG1563构建体一起共表达。构建组成型表达的EF1α启动子驱动的CAR LTG1563作为对照，并与具有辅助组分的受AP1/NFκB调节的CAR并行测试。在图6中描绘了具有辅助组分的这些CAR构建体中的每一个的结构。
使用CD4和CD8珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物通过免疫原性选择，从两名不相关健康供体的血液中纯化T细胞。如材料和方法中所述，在不存在细胞因子补充的情况下，用具有辅助组分的CAR LTG1563构建体转导细胞。实验组包括由EF1α启动子驱动的CARLTG1563、CAR LTG1563-TGFBRIIdn、CAR LTG1563-PD1dn或CAR LTG1563-PD1dn-TGFBRIIdn，或具有AP1/NFκB_RE驱动的CAR LTG1563，其为CAR LTG1563-TGFBRIIdn、CAR LTG1563-PD1dn或CAR LTG1563-PD1dn-TGFBRIIdn正调节的自驱动的CAR，具有在0.5％体积/体积LV制备物下的辅助组分(图6)。在相同条件下培养的未经转导细胞(UTD)用作阴性对照。CARLTG1563和辅助组分(TGFBRII、PD1)的表达通过流式细胞术计数评估；然而，辅助组分的表达也反映了CAR-T细胞上这些蛋白质的天然全长形式的表达。在组成型EF1α启动子的控制下，分别观察到了EF1a-CAR LTG1563-TGFBRIIdn和EF1a-CAR LTG1563-PD1dn构建体的这些TGFBRII和PD1蛋白表达的显著提高(图6B至6C)，证明了可在高于这些蛋白质的天然表达下检测到辅助转基因的表达。
此外，在该实验中，通过CD19抗原刺激评估了AP1/NFκB响应元件二者驱动CARLTG1563表达的自驱动特性(图6)。这是使用来自供体A和供体B的CAR T细胞与稳定表达GFP的CD19阳性Raji NHL肿瘤细胞共培养进行的。引人注目的是，在刺激之后20小时内，在AP1/NFκB_RE-CAR LTG1563-TGFBRIIdn T细胞中强烈诱导了CAR(图6A)和TGFBRII(图6B)表达。这表明AP1/NFκB启动子可用于在存在抗原信号传导的情况下通过同源CAR受体诱导除CAR之外的蛋白质。
此外，在该实验中，通过在存在或不存在免疫抑制细胞因子TGFβ(10ng/mL)的情况下，共培养CAR T细胞与稳定表达GFP的CD19+Raji NHL细胞来评估CAR LTG1563依赖性细胞毒性。使用非常低的效应物与靶标比(1∶3 CAR T∶Raji细胞)，并通过从活化之后D5至D9(共培养1)GFP+Raji细胞的流式细胞术计数来评估CD19依赖性细胞毒性。通过从活化之后D9至D13(共培养2)以类似的效应物与靶标比(1∶3共培养物1∶Raji细胞)二次再刺激细胞，以及从活化之后D13至D19(1∶3共培养物2∶Raji细胞)三次再刺激细胞来评估CAR T细胞的长期功能和扩增。
检查与靶细胞共孵育的CAR T，持续了总共15天(共培养1至3)，在此期间，通过流式细胞术分析对活的Raji和T细胞的数目进行计数(图8A)。尽管在仅Raji组和UTD对照组中的Raji细胞继续不受阻碍地生长，但在不存在TGFβ的情况下，CAR LTG1563 T细胞强烈抑制在所有载体情况下的Raji扩增，而AP1NFKB-CAR LTG1563和EF1a-CAR LTG1563载体在存在TGFβ的情况下对Raji细胞表现出差的细胞毒性。引人注目的是，在载体EF1a-CAR LTG1563-TGFBRIIdn中，显性负受体TGFBRIIdn在存在TGFβ的情况下在很大程度上恢复了CAR依赖性细胞毒性(图8B)。对于AP1NFKB-CAR LTG1563-TGFBRIIdn载体也观察到类似的CAR依赖性细胞毒性恢复，尽管在这些载体中的初始TGFBRII表达较低(图7B)。这表明AP1-NFKB启动子的可诱导性质可用于以受通过CAR的抗原信号传导调节的方式成功地表达CAR之外的其他蛋白质。对于EF1a-CAR LTG1563-TGFBRIIdn和AP1NFKB-CAR LTG1563-TGFBRIIdn载体，在存在TGFβ的情况下的细胞毒性恢复也与整个共培养1至3中CAR LTG1563依赖性T细胞扩增的显著提高相关(图8C)。总体而言，这证明了使用诱导型AP1-NFKB启动子将具有辅助组分的CAR作为单载体系统的成功使用和诱导。
实施例3
在存在TGFβ或PD-L1配体的情况下具有TGFBRIIdn和PD-1dn诱饵组分的CAR19LTG1563的表征
材料和方法：
用于证明CAR活性的细胞系
除非另有说明，否则伯基特淋巴瘤细胞系Raji细胞系、慢性髓细胞性白血病系K562系和试剂均购自美国组织培养物保藏中心(ATCC，Manassass，VA)。将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(Thermo FisherScientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾系293T购自ATCC并在CDFortiCho培养基(Gibco/Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)中增殖。通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，随后克隆和选择萤光素酶阳性克隆产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。通过用编码GFP和/或PD-L1(PDL1：第1至290位AA，Uniprot ID：Q9NZQ7)的慢病毒载体稳定转导激活萤光素酶的肿瘤系，随后磁性地或基于FACS分离GFP+和PD-L1+细胞产生表达GFP和PDL1的细胞系。
用于证明CAR活性的原代人T细胞
在捐赠者的书面同意下，从Oklahoma血液研究所(OBI)的健康志愿者中收集全血。经处理的血沉棕黄层购自OBI(Oklahoma City，OK)。使用CD4-和CD8-微珠(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)的1∶1混合物根据制造商的方案通过阳性选择从血沉棕黄层中纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
原代T细胞转导
将来自正常供体的人原代CD4+和CD8+T细胞在TexMACS培养基中以1×106个细胞/ml的密度培养，在第0天用CD3/CD28
Figure BPA0000312587760000961
GMP T细胞TransAct试剂活化(所有试剂均来自Miltenyi Biotec)，并在第1天用编码CAR构建体的LV转导过夜，并在第3天更换培养基。如所描述的进行细胞因子(IL-2、TNFβ；Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)补充。使培养物增殖直至在第8天收获以用于共孵育分析。
免疫效应物测定(CTL和细胞因子)
对于长期共孵育测定，如上使表达CAR T效应物和GFP的靶细胞增殖，并利用流式细胞术分析来确定靶细胞群杀伤的程度以及CAR T群存活和扩增。基于前向和侧向散射以及活(7AAD-阴性)细胞对细胞进行设门。基于Raji靶标的GFP阳性和CAR T效应物的CD3，确定共培养之后存活细胞的百分比。另外，通过用CD19 Fc肽随后是抗Fc(Fab’)2-FL试剂进行染色来确定活的CD3阳性细胞中的CAR T表达。还通过流式细胞术确定了PD1和TGFBRII表达。
结果：
先前用表达辅助组分TGFBRIIdn的CAR LTG1563构建体进行的实验(图8)证明了显著地免受免疫抑制细胞因子TGFβ的抗炎作用的影响。因此，这些结果被扩展到包括另外的T细胞供体并分析CAR T效力的另一些参数(细胞因子产生、活化标志物表达和耗竭标志物表达)。简言之，使用CD4和CD8珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物通过免疫原性选择从三名不相关健康供体的血液中纯化T细胞。如材料和方法中所述，在存在IL2补充的情况下，用具有辅助组分的CAR LTG1563构建体转导细胞。实验组包括由EF1α启动子驱动的CAR LTG1563或CAR LTG1563-TGFBRIIdn，或具有AP1/NFκB_RE驱动的CAR LTG1563，其为CAR LTG1563-TGFBRIIdn调节的自驱动的CAR，具有在0.5％体积/体积LV制备物下的辅助组分(图9A)。在相同条件下培养的未经转导细胞(UTD)用作阴性对照。在用Raji NHL肿瘤细胞刺激CD19抗原之前和之后两种情况下，通过流式细胞术计数评估CAR LTG1563和辅助组分(TGFBRIIdn)的表达，其表现出与先前实验类似的特征(图8并且数据未显示)。
此外，在该实验中，通过在存在或不存在免疫抑制细胞因子TGFβ(10ng/mL)的情况下，共培养CAR T细胞与稳定表达GFP的CD19+Raji NHL细胞来评估CAR LTG1563依赖性细胞毒性。使用非常低的效应物与靶标比(1∶3 CAR T∶Raji细胞)，并通过从活化之后D8至D14(共培养1，图9A)GFP+Raji细胞的流式细胞术计数来评估CD19依赖性细胞毒性。通过从活化之后D14至D20(共培养2)以类似的效应物与靶标比(1∶3共培养物1∶Raji细胞)二次再刺激细胞来评估CAR T细胞的长期功能和扩增。检查与靶细胞共孵育的CAR T，持续了总共14天(共培养1至2)，在此期间，通过流式细胞术分析对活的Raji和T细胞的数目进行计数(图9B)。尽管在仅Raji组和UTD对照组中的Raji细胞继续不受阻碍地生长，但在不存在TGFβ的情况下，CAR LTG1563 T细胞强烈抑制在所有载体情况下的Raji扩增，而在存在TGFβ的情况下，经AP1NFKB-CAR LTG1563和EF1a-CAR LTG1563转导的T细胞对Raji细胞表现出差的细胞毒性。引人注目的是，在载体EF1a-CAR LTG1563-TGFBRIIdn中，显性负受体TGFBRIIdn在存在TGFβ的情况下在很大程度上恢复了CAR依赖性细胞毒性(图8B)。对于AP1NFKB-CARLTG1563-TGFBRIIdn载体也观察到类似的CAR依赖性细胞毒性恢复，尽管在这些载体中的初始TGFBRII表达较低(数据未显示)。这些结果扩展了先前的发现，即AP1-NFκB启动子的可诱导性质可用于以受通过CAR的抗原信号传导调节的方式成功地表达CAR之外的其他蛋白质。
在实验过程中评估了另一些T细胞参数。在存在TGFβ的情况下，辅助组分TGFBRIIdn的表达恢复了促炎细胞因子(例如IL2)的高水平产生和活化标志物(例如CD25)的表达(数据未显示)。对CAR T共培养的TGFβ补充导致耗竭标志物PD1的显著高表达水平(图9C)，如在共培养2结束时(活化之后D20)测量的。值得注意的是，相对于在相同条件下表达AP1NFKB-CAR LTG1563和EF1a-CAR LTG1563的CAR T细胞，在存在TGFβ的情况下，在表达AP1NFKB-CAR LTG1563-TGFBRIIdn和EF1a-CAR LTG1563-TGFBRIIdn的CAR T细胞二者中均观察到耗竭标志物PD1表达的显著降低(图9C)。PD1的TGFβ依赖性表达降低导致这样的假设：TGFBRIIdn表达不仅可保护CAR-T细胞免受TGFβ的抗炎作用，还可免受PD-1信号传导的负面作用。
因此，通过用稳定表达PD-L1的慢病毒载体转导CD19+靶标Raji-GFP NHL细胞以产生细胞系Raji-GFP-PDL1来评估辅助CAR组分TGFBRIIdn免受PD-1/PD-L1信号传导的免疫抑制作用的能力。进行了PDL1细胞的磁选，并通过流式细胞术评估了数周时间内PDL1在Raji-GFP-PDL1细胞上的稳定表达(数据未显示)。如前所述，使用CD4和CD8珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物通过免疫原性选择从三名不相关健康供体的血液中纯化T细胞。如材料和方法中所述，在存在IL2补充的情况下，用具有辅助组分的CAR LTG1563构建体转导细胞。实验组包括由EF1α启动子驱动的CAR LTG1563或CAR LTG1563-TGFBRIIdn，或具有AP1/NFκB_RE驱动的CAR LTG1563，其为CAR LTG1563-TGFBRIIdn调节的自驱动的CAR，具有在0.5％体积/体积LV制备物下的辅助组分(图9A)。在相同条件下培养的未经转导细胞(UTD)用作阴性对照。通过在存在或不存在免疫抑制细胞因子TGFβ(10ng/mL)的情况下，共培养CAR T细胞与CD19+Raji-GFP或CD19+Raji-GFP-PDL1NHL细胞来评估CAR LTG1563依赖性细胞毒性。使用非常低的效应物与靶标比(1∶3 CAR T∶Raji细胞)，并通过从活化之后D8至D14(共培养1，图10C)GFP+Raji细胞的流式细胞术计数来评估CD19依赖性细胞毒性。通过从活化之后D14至D20(共培养2)以类似的效应物与靶标比(1∶3共培养物1∶Raji细胞)二次再刺激细胞来评估CART细胞的长期功能和扩增。检查与靶细胞共孵育的CAR T，持续了总共14天(共培养1至2)，在此期间，通过流式细胞术分析对活的Raji和T细胞的数目进行计数(图10C)。
虽然靶Raji NHL细胞上单独的PD-L1表达不足以显著影响CAR LTG1563依赖性细胞毒性(图10A)，但在存在靶标PD-L1表达和TGFβ补充二者的情况下，观察到表达AP1NFKB-CAR LTG1563和EF1a-CAR LTG1563的CAR T的细胞毒性能力的协同降低。值得注意的是，辅助组分TGFBRIIdn的共表达能够在存在靶标PD-L1表达和TGFβ补充二者的情况下恢复CAR T细胞的CD19依赖性杀伤能力，但是没有达到在不存在PD-1/PD-L1和TGFβ信号传导二者的情况下观察到的程度。这与在存在TGFBRIIdn表达的情况下观察到的防止TGFβ诱导的PD-1表达部分但不完全一致(图9C)。
在该实验过程中还评估了TGFBRIIdn转基因对CAR LTG1563依赖性T细胞扩增的作用。概述了先前的结果(图5C)，表明AP1NFKB-CAR LTG1563相对于EF1a-CAR LTG1563表现出优越的CD19抗原依赖性T细胞扩增(图9C，左起第一个图)。值得注意的是，当将Raji-PDL1靶标用于共培养时，先前在AP1-NFKB_CAR19情况下观察到的较大的CAR19依赖性T细胞扩增相对于EF1α_CAR19变得更加明显，即使在不存在TGFβ的情况下也是如此(图9C，左起第三个图)。在出现PD1检查点信号传导的条件下，强直CAR信号传导的任何负面作用(如在组成型CAR表达期间潜在地存在的情况(图4))均将变得更加明显，这将是与Raji-PDL1细胞共培养下的情况。在所有情况下，在存在TGFβ补充和靶细胞PDL1表达二者的情况下，TGFBRIIdn转基因的表达显著提高了CAR19依赖性T细胞扩增(图9C，左起第4个图)，表明通过降低TGFβ信号传导免受抗炎PD1/PD-L1信号传导的作用。
序列表的引用
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本公开内容的序列
如37 C.F.R.1.822中所限定的，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的单字母或三字母代码来示出下文所列的核酸和氨基酸序列。仅示出每个核酸序列的一条链，但互补链被理解为通过对所示链的任何引用而被包含在内。在所附序列表中：
SEQ ID NO：1 STAT5响应元件的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001001
SEQ ID NO：2 AP-1响应元件序列1的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001002
SEQ ID NO：3 AP-1响应元件序列2的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001003
SEQ ID NO：4 NF κB响应元件序列1的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001004
SEQ ID NO：5 NF κB响应元件序列2的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001005
SEQ ID NO：6 NF κB响应元件序列3的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001006
SEQ ID NO：7 LTG 2091(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001011
SEQ ID NO：8 LTG 2091(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001021
SEQ ID NO：9 LTG 2092(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001022
Figure BPA0000312587760001031
SEQ ID NO：10 LTG 2092(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001032
SEQ ID NO：11 LTG 2095(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001041
SEQ ID NO：12 LTG 2095(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001051
SEQ ID NO：13前导/信号肽序列的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001052
SEQ ID NO：14前导/信号肽序列的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001053
SEQ ID NO：15 LTG 2097(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001054
Figure BPA0000312587760001061
SEQ ID NO：16 LTG 2097(hScFv aCD38 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001062
SEQ ID NO：17 ROR1-CAR LTG1941(LP-ScFV4-CD8H/CD8TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001071
SEQ ID NO：18 ROR1-CAR LTG1941(LP-ScFV4-CD8H/CD8TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001072
SEQ ID NO：19 ROR1-CAR LTG1942(LP-ScFV9-CD8H/CD8TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001081
SEQ ID NO：20 ROR1-CAR LTG1942(LP-ScFV9-CD8H/CD8TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001091
SEQ ID NO：21 ROR1-CAR LTG1943(LP-对照ScFv-CD8H/CD8TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001092
SEQ ID NO：22 ROR1-CAR LTG1943(LP-对照ScFv-CD8H/CD8TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001101
SEQ ID NO：23 LTG 2075(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001102
Figure BPA0000312587760001111
SEQ ID NO：24 LTG 2075(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001112
SEQ ID NO：25 LTG 2076(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001121
SEQ ID NO：26 LTG 2076(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001122
SEQ ID NO：27 DNA CD8跨膜结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001123
SEQ ID NO：28 CD8跨膜结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001131
SEQ ID NO：29 DNA CD8铰链结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001132
SEQ ID NO：30 CD8铰链结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001133
SEQ ID NO：31 CD8.α.(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)的第118至178位氨基酸铰链区的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001134
SEQ ID NO：32人IgG CL序列的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001135
SEQ ID NO：33 4-1BB的DNA信号传导结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001136
SEQ ID NO：34 4-1BB的信号传导结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001141
SEQ ID NO：35 CD3-ζ的DNA信号传导结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001142
SEQ ID NO：36 CD3ζ的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001143
SEQ ID NO：37 ScFv CD 19的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001144
SEQ ID NO：38 ScFv CD 19的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001151
SEQ ID NO：39 GMCSF前导肽的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001152
SEQ ID NO：40 GMCSF前导肽的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001153
SEQ ID NO：41 TNFRSF19前导肽的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001154
SEQ ID NO：42 TNFRSF19前导肽的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001155
SEQ ID NO：43 CD8α前导肽的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001156
SEQ ID NO：44 CD8α前导肽的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001157
SEQ ID NO：45 CD28共刺激结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001161
SEQ ID NO：46 CD28共刺激结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001162
SEQ ID NO：47 CD3ζ激活结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001163
SEQ ID NO：48 CD3ζ激活结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001164
SEQ ID NO：49 TNFRSF19铰链和跨膜结构域的核苷酸序列(跨膜结构域带下划线)
Figure BPA0000312587760001165
SEQ ID NO：50 TNFRSF19铰链和跨膜结构域的氨基酸序列(跨膜结构域带下划线)
Figure BPA0000312587760001166
SEQ ID NO：51 TNFRSF19跨膜结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001167
SEQ ID NO：52 TNFRSF 19跨膜结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001168
SEQ ID NO：53 TNFRSF19铰链结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001171
SEQ ID NO：54 TNFRSF19铰链结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001172
SEQ ID NO：55截短的TNFRSF19铰链结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001173
SEQ ID NO：56截短的TNFRSF19铰链结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001174
SEQ ID NO：57与TNFRSF19跨膜结构域融合的CD8a铰链结构域的核苷酸序列(跨膜序列带下划线)
Figure BPA0000312587760001175
SEQ ID NO：58与TNFRSF19跨膜结构域融合的CD8a铰链结构域的氨基酸序列(跨膜序列带下划线)
Figure BPA0000312587760001176
SEQ ID NO：59 CD28共刺激结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001177
SEQ ID NO：60 CD28共刺激结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001178
SEQ ID NO：61 CD3ζ形式2的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001181
SEQ ID NO：62 CD3ζ形式2的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001182
SEQ ID NO：63弗林蛋白酶P2A弗林蛋白酶的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001183
SEQ ID NO：64弗林蛋白酶P2A弗林蛋白酶的氨基酸序列(弗林蛋白酶序列带下划线)
Figure BPA0000312587760001184
SEQ ID NO：65弗林蛋白酶T2A的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001185
SEQ ID NO：66弗林蛋白酶T2A的氨基酸序列(弗林蛋白酶序列带下划线)
Figure BPA0000312587760001186
SEQ ID NO：67截短的EGFR(tEGFR)标签的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001191
SEQ ID NO：68截短的EGFR(tEGFR)标签的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001192
SEQ ID NO：69 CAR LTG2200(LP-2200-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001193
Figure BPA0000312587760001201
SEQ ID NO：70 CAR LTG2200(LP-2200-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001202
SEQ ID NO：71 CAR LTG 1494(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001203
Figure BPA0000312587760001211
SEQ ID NO：72 CAR LTG 1494(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001212
SEQ ID NO：73 CAR LTG1538(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-信号(LTI经再改造的CD19 CAR)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001213
Figure BPA0000312587760001221
SEQ ID NO：74 CAR LTG1538(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-信号(LTI经再改造的CD19 CAR)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001222
SEQ ID NO：75 CAR LTG1562(LP-CD19结合物-CD8接头-CD4tm-4-1BB-CD3-ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001223
Figure BPA0000312587760001231
SEQ ID NO：76 CAR LTG1562(LP-CD19结合物-CD8接头-CD4tm-4-1BB-CD3-ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001232
SEQ ID NO：77 CAR LTG1563(LP-CD19-TNFRSF19TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001233
Figure BPA0000312587760001241
SEQ ID NO：78 CAR LTG1563(LP-CD19-TNFRSF19TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001242
SEQ ID NO：79人IgG4铰链的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001243
SEQ ID NO：80人IgG4铰链的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001244
SEQ ID NO：81人IgG4 CH2结构域的核昔酸序列
Figure BPA0000312587760001245
SEQ ID NO：82人IgG4 CH2结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001246
SEQ ID NO：83人IgG4 CH3结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001251
SEQ ID NO：84人IgG4 CH3结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001252
SEQ ID NO：85人IgG4铰链CH2 CH3结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001253
SEQ ID NO：86人IgG4铰链CH2 CH3结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001254
SEQ ID NO：87间皮素反应性-scFv结合结构域(LTG1904)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001261
SEQ ID NO：88间皮素反应性-scFv结合结构域(LTG1904)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001262
SEQ ID NO：89 CAR LTG1904(LP-LTG1904-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001271
SEQ ID NO：90 CAR LTG1904(LP-LTG1904-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001281
SEQ ID NO：91 CD33反应性单链结合结构域VH-4(LTG1906)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001282
SEQ ID NO：92 CD33反应性单链结合结构域VH-4(LTG1906)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001283
SEQ ID NO：93 CAR LTG1906(LP-VH4-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001291
SEQ ID NO：94 CAR LTG1906(LP-VH4-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001292
SEQ ID NO：95 CAR LTG1496(LP-LTG1496-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD19 VL-Whitlow接头-CD19 VH(GGGGS)5 CD20 VH(GGGGS)3-CD20 VL CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001301
Figure BPA0000312587760001311
SEQ ID NO：96 CAR LTG1496(LP-LTG1496-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD19 VL-Whitlow接头-CD19 VH-(GGGGS)5-CD20 VH(GGGGS)3-CD20 VL-CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001312
SEQ ID NO：97 CAR LTG1497(LP-LTG1497-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD20 VH-(GGGGS)3-CD20 VL-(GGGGS)5-CD19VL-Whitlow接头-CD19 VH-CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001321
Figure BPA0000312587760001331
SEQ ID NO：98 CAR LTG1497(LP-LTG1497-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD20VH-(GGGGS)3-CD20 VL-(GGGGS)5-CD19VL-Whitlow接头-CD19 VH-CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001332
SEQ ID NO：99 TSLPR反应性scFv结合结构域(LTG1789)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001341
SEQ ID NO：100 TSLPR反应性scFv结合结构域(LTG1789)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001342
SEQ ID NO：101 CAR LTG1789(LP-3G11-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001343
Figure BPA0000312587760001351
SEQ ID NO：102 CAR LTG1789(LP-3G11-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001352
SEQ ID NO：103 CAR LTG2864(AP1NFKB-CAR LTG1563-FP2AF-TGFBRIIdn)的核苷酸序列(句子中的启动子序列)
Figure BPA0000312587760001361
Figure BPA0000312587760001371
SEQ ID NO：104 CAR LTG2864(AP1NFKB-CAR LTG1563-FP2AF-TGFBRIIdn)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001372
SEQ ID NO：105 CAR LTG2865(AP1NFKB-CAR LTG1563-FP2AF-PD1dn)的核苷酸序列(句子中的启动子序列)
Figure BPA0000312587760001381
Figure BPA0000312587760001391
SEQ ID NO：106 CAR LTG2865(AP1NFKB-CAR LTG1563-FP2AF-PD1dn)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001392
SEQ ID NO：107 CAR LTG2866(AP1NFKB-CAR LTG1563-FP2AF-PD1dn-P2AF-TGFBRIIdn)的核苷酸序列(句子中的启动子序列)
Figure BPA0000312587760001401
Figure BPA0000312587760001411
SEQ ID NO：108 CAR LTG2866(AP1NFKB-CAR LTG1563-FP2AF-PD1dn-P2AF-TGFBRIIdn)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001412
Figure BPA0000312587760001421
SEQ ID NO：109 CAR(STAT5-CAR LTG1563-FP2AF-TGFBRIIdn)的核苷酸序列(句子中的启动子序列)
Figure BPA0000312587760001422
Figure BPA0000312587760001431
SEQ ID NO：110 CAR(STAT5-CAR LTG1563-FP2AF-PD1dn)的核苷酸序列(句子中的启动子序列)
Figure BPA0000312587760001432
Figure BPA0000312587760001441
Figure BPA0000312587760001451
SEQ ID NO：111 CAR(STAT5-CAR LTG1563-FP2AF-PD1dn-P2AF-TGFBRIIdn)的核苷酸序列(句子中的启动子序列)
Figure BPA0000312587760001452
Figure BPA0000312587760001461
SEQ ID NO：112 LTG 1496的CD19/CD20特异性结合物的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001471
SEQ ID NO：113 LTG 1497的CD19/CD20特异性结合物的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001472
SEQ ID NO：114 LTG 1497的CD19/CD20特异性结合物的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001473
SEQ ID NO：115 LTG 2077(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001481
SEQ ID NO：116 LTG 2077(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001491
SEQ ID NO：117 LTG 2078(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001492
Figure BPA0000312587760001501
SEQ ID NO：118 LTG 2078(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001502
SEQ ID NO：119 LTG 2079(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001503
Figure BPA0000312587760001511
SEQ ID NO：120 LTG 2079(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001512
SEQ ID NO：121 LTG 2082(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001521
SEQ ID NO：122 LTG 2082(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001531
SEQ ID NO：123 LTG 2083(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001532
Figure BPA0000312587760001541
SEQ ID NO：124 LTG 2083(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001542
SEQ ID NO：125 LTG 2085(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001543
Figure BPA0000312587760001551
SEQ ID NO：126 LTG 2085(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001552
SEQ ID NO：127 LTG 2087(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001561
SEQ ID NO：128 LTG 2087(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001562
SEQ ID NO：129 LTG 2088(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001571
SEQ ID NO：130 LTG 2088(hScFv aCD123 CD8 TM 4-1BB CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001572
SEQ ID NO：131 LTG 2737(Ef1a-CAR22-19 CD8BBz)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001581
Figure BPA0000312587760001591
SEQ ID NO：132 LTG 2737(Ef1a-CAR22-19 CD8 BBz)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001592
Figure BPA0000312587760001601
SEQ ID NO：133 CD22 CAR LTG2209(LP-scFv12-CD8TM-41BB-CD3ζ)的核酸序列
Figure BPA0000312587760001602
Figure BPA0000312587760001611
SEQ ID NO：134 CD22 CAR LTG2209(LP-scFV12-CD8TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001612
SEQ ID NO：135 CD22 CAR LTG2219(LP-scFV17-CD8TM-41BB-CD3ζ)的核酸序列
Figure BPA0000312587760001613
Figure BPA0000312587760001621
SEQ ID NO：136 CD22 CAR LTG2219(LP-scFv17-CD8TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001622
SEQ ID NO：137用于CAR构建体LTG2764的STAT5RE启动子DNA序列
Figure BPA0000312587760001623
SEQ ID NO：138用于CAR构建体LTG2765的AP1NFKBRE启动子DNA序列
Figure BPA0000312587760001631
SEQ ID NO：139 pLTG2764 STAT5(句子中的启动子)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001632
Figure BPA0000312587760001641
SEQ ID NO：140 CAR LTG2765 AP1NFKB(句子中的启动子)的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001642
Figure BPA0000312587760001651
SEQ ID NO：141 LTG 1496的CD19/CD20特异性结合物的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001652
SEQ ID NO：142 CAR LTG1495(LP-1495-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000312587760001661
SEQ ID NO：143 CAR LTG1495(LP-1495-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001662
SEQ ID NO：144 CD38 hScFv结合物M3803的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001671
SEQ ID NO：145 CD38 hScFv结合物M3803的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001672
SEQ ID NO：146 CD38 hScFv结合物M3804的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001673
Figure BPA0000312587760001681
SEQ ID NO：147 CD38 hScFv结合物M3804的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001682
SEQ ID NO：148 CD38 hScFv结合物M3809的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001683
Figure BPA0000312587760001691
SEQ ID NO：149 CD38 hScFv结合物M3809的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001692
SEQ ID NO：150 CD38 hScFv结合物M3811的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001693
SEQ ID NO：151 CD38 hScFv结合物M3811的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001694
SEQ ID NO：152抗ROR1结合物：ScFV4的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001701
SEQ ID NO：153抗ROR1结合物：ScFV4的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001702
SEQ ID NO：154抗ROR1结合物：ScFV9的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001703
SEQ ID NO：155抗ROR1结合物：ScFV9的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001711
SEQ ID NO：156对照抗-ROR1结合物的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001712
SEQ ID NO：157对照抗-ROR1结合物的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001713
SEQ ID NO：158 CD123 hScFv结合物M12303的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001721
SEQ ID NO：159 CD123 hScFv结合物M12303的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001722
SEQ ID NO：160 CD123 hScFv结合物M12304的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001723
Figure BPA0000312587760001731
SEQ ID NO：161 CD123 hScFv结合物M12304的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001732
SEQ ID NO：162 CD123 hScFv结合物M12305的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001733
SEQ ID NO：163 CD123 hScFv结合物M12305的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001741
SEQ ID NO：164 CD123 hScFv结合物M12306的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001742
SEQ ID NO：165 CD123 hScFv结合物M12306的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001743
SEQ ID NO：166 CD123 hScFv结合物M12308的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001751
SEQ ID NO：167 CD123 hScFv结合物M12308的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001752
SEQ ID NO：168 CD123 hScFv结合物M12311的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001753
Figure BPA0000312587760001761
SEQ ID NO：169 CD123 hScFv结合物M12311的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001762
SEQ ID NO：170 CD123 hScFv结合物M12313的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001763
Figure BPA0000312587760001771
SEQ ID NO：171 CD123 hScFv结合物M12313的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001772
SEQ ID NO：172 CD123 hScFv结合物M12315的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001773
SEQ ID NO：173 CD123 hScFv结合物M12315的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001774
SEQ ID NO：174 CD123 hScFv结合物M12317的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001781
SEQ ID NO：175 CD123 hScFv结合物M12317的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001782
SEQ ID NO：176 CD123 hScFv结合物M12318的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001783
SEQ ID NO：177 CD123 hScFv结合物M12318的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001791
SEQ ID NO：178 LTG 2737的CD19/CD22结合物的核苷酸序列
Figure BPA0000312587760001792
SEQ ID NO：179 LTG 2737的CD19/CD22结合物的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001801
SEQ ID NO：180 CD22特异性结合物(scFv12)16P17的核酸序列
Figure BPA0000312587760001802
SEQ ID NO：181 CD22特异性结合物(scFv12)16P17的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001803
SEQ ID NO：182 CD22特异性结合物(scFv17)16P13的核酸序列
Figure BPA0000312587760001811
SEQ ID NO：183 CD22特异性结合物(scFv17)16P13的氨基酸序列
Figure BPA0000312587760001812
Figure IPA0000312587700000011
Figure IPA0000312587700000021
Figure IPA0000312587700000031
Figure IPA0000312587700000041
Figure IPA0000312587700000051
Figure IPA0000312587700000061
Figure IPA0000312587700000071
Figure IPA0000312587700000081
Figure IPA0000312587700000091
Figure IPA0000312587700000101
Figure IPA0000312587700000111
Figure IPA0000312587700000121
Figure IPA0000312587700000131
Figure IPA0000312587700000141
Figure IPA0000312587700000151
Figure IPA0000312587700000161
Figure IPA0000312587700000171
Figure IPA0000312587700000181
Figure IPA0000312587700000191
Figure IPA0000312587700000201
Figure IPA0000312587700000211
Figure IPA0000312587700000221
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Claims (50)

1.分离的核酸分子，其编码与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137、138或其组合的核苷酸序列，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节其转录水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述治疗性载荷包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
3.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个抗原结合结构域包含与一种或更多种抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段，所述一种或更多种抗原包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38，或其组合。
4.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个抗原结合结构域包含与一种或更多种抗原结合的抗体的至少一个重链可变区，所述一种或更多种抗原包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38，或其组合。
5.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个抗原结合结构域、所述至少一个胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
6.权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所编码的接头或间隔区结构域来源于CD8、TNFRSF19或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
7.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所编码的胞外间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域之前是编码前导肽的前导核苷酸序列。
8.权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述前导核苷酸序列包含含有以下的核苷酸序列：编码SEQ ID NO：14的前导氨基酸序列的SEQ ID NO：13、或编码SEQ ID NO：40的前导氨基酸序列的SEQ ID NO：39、或编码SEQ ID NO：42的前导氨基酸序列的SEQ ID NO：41、或编码SEQ ID NO：44的前导氨基酸序列的SEQ ID NO：43。
9.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD19/CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD83、CD86、CD134、CD137、CD154和TNFRSF19，或其任意组合。
10.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子包含含有SEQ ID NO：137或138的核酸序列，或者与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
11.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
12.权利要求11所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域布置在相对于所述CD3ζ胞内结构域的C端侧。
13.权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其任意组合。
14.权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其任意组合。
15.嵌合抗原受体(CAR)，其由权利要求2所述的分离的核酸分子编码。
16.权利要求15所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含与一种或更多种抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段，所述一种或更多种抗原包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38，或其组合。
17.权利要求15所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含与一种或更多种抗原结合的抗体的至少一个重链可变区，所述一种或更多种抗原包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38，或其组合。
18.权利要求15所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154和TNFRSF19，或其任意组合。
19.权利要求18所述的CAR，其中CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
20.权利要求15所述的CAR，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述至少一个胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
21.权利要求20所述的CAR，其中所述接头或间隔区结构域来源于CD8、TNFRSF19、IgG4或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
22.权利要求17所述的CAR，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
23.权利要求22所述的CAR，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其组合。
24.载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。
25.权利要求24所述的载体，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体，或其组合。
26.细胞，其包含权利要求24所述的载体。
27.权利要求26所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
28.权利要求26所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
29.权利要求26所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
30.制备细胞的方法，其包括用权利要求24所述的载体转导T细胞。
31.产生RNA经改造细胞群的方法，其包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞中，其中所述RNA包含权利要求2所述的核酸分子。
32.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求26所述的细胞。
33.在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以在所述哺乳动物中有效地治疗或预防癌症的量向所述哺乳动物施用权利要求15所述的CAR。
34.药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的人T细胞群，其中所述T细胞包含与受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接的治疗性载荷，所述受表面抗原调节的诱导型启动子由包含SEQ ID NO：137、138或其组合的核酸序列编码，其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节其转录水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应，其中所述治疗性载荷包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，并且其中所述CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含间皮素、CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合，并且其中所述T细胞是患有癌症的人的T细胞。
35.权利要求34所述的药物组合物，其中所述至少一个跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其任意组合。
36.权利要求34所述的药物组合物，其中所述T细胞是患有血液学癌症的人的T细胞。
37.权利要求36所述的药物组合物，其中所述血液学癌症是白血病或淋巴瘤。
38.权利要求37所述的药物组合物，其中所述白血病是急性髓性白血病(AML)、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞性T细胞白血病(T-ALL)或急性淋巴细胞性B细胞白血病(B-ALL)。
39.权利要求37所述的药物组合物，其中所述淋巴瘤是套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
40.权利要求36所述的药物组合物，其中所述血液学癌症是多发性骨髓瘤。
41.权利要求36所述的药物组合物，其中人癌症包括成人上皮癌，其包括口腔和咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌症、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿科肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤)、中枢神经系统的肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任意组合。
42.治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码治疗性载荷的分离的核酸分子，其与包含SEQ ID NO：137、138或其组合的受表面抗原调节的诱导型启动子核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节其转录水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
43.权利要求42所述的方法，其中所述治疗性载荷包含含有至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123或CD38抗原结合结构域，或其组合。
44.治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，与包含SEQID NO：137、138或其组合的受表面抗原调节的诱导型启动子核苷酸序列可操作地连接，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含含有以下的抗原结合结构域或其组合：CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123、CD38、CD138、BCMA(CD269)、TSLPR、TEM-1、TEM-7、TEM-8、TEM-9、CD371、CD276、CD99、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR或MAGE A3 TCR、或其任意组合的抗原结合结构域，并且其中所述受表面抗原调节的诱导型启动子根据靶细胞上表面抗原的表达水平调节其转录水平，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶抗原水平精确调节的T细胞响应。
45.在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，与包含SEQ ID NO：137、138或其组合的受表面抗原调节的诱导型启动子核苷酸序列可操作地连接，所述至少一个胞外抗原结合结构域包含含有CD19抗原结合结构域或其组合的抗原结合结构域，其中所述CAR包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列，其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。
46.权利要求42、43、44或45所述的方法，其中所述至少一个跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其任意组合。
47.用于产生表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括向细胞中引入权利要求2所述的分离的核酸。
48.根据权利要求47所述的用于产生表达嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述细胞是T细胞或包含T细胞的细胞群。
49.治疗性CAR T细胞，其包含编码CAR的分离的核酸分子，与包含含有SEQ ID NO：137、138或其组合的核苷酸序列的受表面抗原调节的诱导型启动子可操作地连接，其中受表面抗原调节的诱导型启动子CAR构建体赋予所述经转导CAR T细胞以下能力：根据靶细胞上相应表面抗原的表达水平提高抗肿瘤响应，从而实现针对肿瘤环境中存在的靶表面抗原水平精确调节的CART细胞响应，并且其中i)在不存在肿瘤靶表面抗原表达的情况下，受表面抗原调节的诱导型启动子赋予低基础水平的CAR表达；ii)在靶细胞表面上存在靶表面抗原活化的情况下，所述CAR被活化，这触发了可适用的信号转导途径的激活，从而活化所述受表面抗原调节的诱导型启动子的信号调节子，由此导致所述CAR的表达提高至高于基础表达水平；iii)给定靶表面抗原的较高表达导致所述CAR的较高表达并且反之亦然，从而导致对CAR表达的有效调节以实现针对在特定位点和时间下存在的靶标水平精确调整的CAR T细胞响应；iv)CAR表达的提高导致最佳的抗肿瘤活性和靶肿瘤细胞的快速消除；以及v)随着肿瘤细胞量的降低/去除，所述CAR的表达水平恢复至其基础表达水平；或其任意组合。
50.权利要求49所述的治疗性CAR T细胞，其中所述治疗性载荷包含以下中的一种或更多种：CD33、CD19、CD19/CD20、CD22、CD19/CD22、ROR1、CD123、CD38、CD138、BCMA(CD269)、TSLPR、TEM-1、TEM-7、TEM-8、TEM-9、CD371、CD276、CD99、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或其任意组合。
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