CN102680631A

CN102680631A - 一种白术药材的检测方法

Info

Publication number: CN102680631A
Application number: CN2012101645974A
Authority: CN
Inventors: 彭腾; 李鸿翔; 邓赟; 贺钢民; 袁海梅; 杨菁; 黎豫川
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102680631B

Abstract

本发明公开了一种检测白术药材质量的方法，该方法是采用HPLC指纹图谱进行检测，操作步骤如下：（1）制备供试品溶液；（2）制备参照物溶液；（3）分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，以乙腈-水系统为流动相进行洗脱，在248±5nm下进行检测。本发明中，将白术药材水煎后，再应用HPLC指纹图谱技术进行检测，更能够真实反映白术的药材质量，并且，本发明中通过对流动相等色谱条件的特定选择，使得色谱图基线平稳、便于积分，特征峰分离度良好，不同药材间相似度高，表明本发明方法能够有效用于对白术的质量监控，为白术药材的用药安全提供了保障。

Description

一种白术药材的检测方法

技术领域

本发明涉及一种白术药材的检测方法，具体地，是采用HPLC指纹图谱进行检测的方法。

背景技术

白术，为菊科植物(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎，其味苦、甘，性温，归脾、胃经，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎的功效。白术是中医常用药材，但是，目前药典对白术的鉴定中，仅涉及性状、薄层等简单鉴定方法，并不能为白术药材提供一个直观的真伪鉴别方法。

当前，高效液相技术是中药质量检测中较为常用的定量、定性检测方法，可以直观地分析药材的真伪。目前，研究人员也将该技术应用到了白术药材的检验中，如何宏生等，采用甲醇-水（70：3）为流动相，对白术药材及炮制品的质量进行检测（何宏生，等，高效液相色谱法测定白术饮片及其炮制品中白术内酯Ⅰ含量，医药导报，2011年30卷5期）。但该方法中，仅用于测定药材中的白术内酯Ⅰ。虽然白术内酯为白术的抗炎有效成分，但该单一成分的含量并不能完全代表白术药材的质量差异。为了更好的监控白术药材的质量，黎琼红等，还对白术药材的指纹图谱进行了研究，以乙腈-水梯度洗脱（45%-100%乙腈），建立的指纹图谱中标定了24个共有特征峰（黎琼红，等，白术药材的指纹图谱研究，中草药，2007年38卷6期）。现有方法中，多是使用有机溶剂（如甲醇）提取白术药材制备供试品溶液进行测定的。

然而，白术在使用过程中多以水煎为主，水为溶剂时，更容易对药材完全浸润，水煎液中提取得到的化学成分比纯有机溶剂提取时更为完全，因此，对白术水煎液进行质量检测，更有利于说明白术药材的质量优劣。但是，由于水煎液中成分更为复杂，在液相检测时，常常会导致各种化学成分分离度不高；同时，水煎液中的某些成分，如糖类等，也会对基线产生较大影响，导致基线不稳，色谱效果不佳。

目前，还未见将白术药材水煎后进行HPLC指纹图谱分析的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白术药材的检测方法。

本发明提供了一种白术药材的检测方法，该方法是采用HPLC指纹图谱进行检测，其操作步骤如下：

（1）取白术药材，加水煎煮后，取水提液，干燥，再用甲醇或乙醇提取后，制备供试品溶液：

（2）取白术内酯Ⅲ，制备参照物溶液；

（3）分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，以乙腈-水系统为流动相进行洗脱，在紫外下进行检测，其液相条件如下：

色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为248±5nm；梯度洗脱条件如下：

进一步地，检测波长为248nm。

进一步地，检测温度为30±2℃；流速为1.0ml/min。

进一步地，色谱柱为Diamonsil钻石C18，250mm×4.6mm×5μm。

其中，步骤（1）的具体操作如下：

精密称取白术药材，加药材重量16-24倍水，煎煮2-3次，每次0.5-1.5h，提取液浓缩、干燥后，加入药材8-12倍w/v甲醇超声提取15-30min，过滤，浓缩，定容，作为供试品溶液。

进一步地，每毫升供试品溶液相当于0.3-0.5g白术药材。

其中，步骤（2）中，选用甲醇制备参照物溶液。

其中，所述HPLC指纹图谱中，有12个共有特征峰；以白术内酯Ⅲ的色谱峰的保留时间为1计算其他峰的相对保留时间：1号峰的相对保留时间为0.52±0.02；2号峰的相对保留时间为0.63±0.01；3号峰的相对保留时间为0.66±0.01；4号峰的相对保留时间为0.78±0.01；5号峰的相对保留时间为0.80±0.005；6号峰的相对保留时间为0.82±0.01；8号峰的相对保留时间为1.10±0.01；9号峰的相对保留时间为1.125±0.004；10号峰的相对保留时间为1.135±0.004；11号峰的相对保留时间为1.145±0.005；12号峰的相对保留时间为1.23±0.01。

进一步地，所述标准指纹图谱如图2所示。

本发明中，将白术药材水煎后，再应用HPLC指纹图谱技术进行检测，更能够真实反映白术的药材质量，并且，本发明中通过对流动相等色谱条件的特定选择，使得色谱图基线平稳、便于积分，特征峰分离度良好，不同药材间相似度高，表明本发明方法能够有效用于对白术的质量监控，为白术药材的用药安全提供了保障。

附图说明

图1白术内酯Ⅲ参照品溶液HPLC色谱图；

图2白术药材供试品溶液HPLC指纹图谱；

图3不同溶剂洗脱分离图谱，从上至下分别为甲醇（A）：水（B）、甲醇/乙腈（A）：水（B）、乙腈（A）：水（B）；

图4不同检查波长下的分离图谱，从上向下分别为248nm、220nm、280nm

图5不同柱温下的分离谱图，用上向下分别为25℃、30℃、35℃；

图6不同分离柱下的分离谱图，从上向下分别为Comatex RP-18、PhenomenexRP-18、kromasil RP-18；

图7稳定性考察数据；

图8精密度考察数据；

图9重复性考察数据；

图10不同产地白术药材的HPLC指纹图谱；

本发明各色谱图中，纵坐标单位为mv，横坐标单位为min。

具体实施方式

实施例1本发明白术药材的检测方法

（1）精密称取白术药材约2g,加水40ml,用小烧杯煎煮2次，每次1h，过滤后浓缩成10ml左右，转移至蒸发皿中，蒸干，加入甲醇20ml后超声20min,过滤，浓缩，定容为5ml，作为供试品溶液。

（2）精密称取白术内酯Ⅲ约3mg，配成10ug/ml左右的甲醇溶液，作为参照物溶液。

（3）分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入岛津LC-20AT液相色谱仪，以乙腈-水系统为流动相进行洗脱，在紫外下进行检测，其中，供试品溶液进样体积为20μl，其液相条件如下：

色谱柱：Diamonsil钻石C18，250mm ×4.6mm ×5μm；检测波长为248nm；检测温度为30±2℃；流速为1.0ml/min；梯度洗脱条件如下：

白术内酯Ⅲ的色谱图参见图1；白术药材水煎液的供试品参见图2。

实施例2本发明检测方法的考察

1仪器与材料

1.1药材

表1白术药材来源

1.2仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-20AT）,FA2004N电子天平(上海沪粤明科学仪器有限公司),BUG25-12超声清洗器（必能信超声（上海）有限公司），Diamonsil钻石C18（250mm×4.6mm×5μm）色谱柱。

1.3试药

白术内酯Ⅲ（标准品）；所用甲醇、乙腈均为色谱醇，水为双蒸水。

2色谱条件优化

2.1流动相系统的选择

Diamonsil钻石C18（250mm×4.6mm×5μm）色谱柱，DAD检测器，比较下列流动相系统:(1)甲醇（A）：水（B）（2）甲醇/乙腈（A）：水（B）（3）乙腈（A）：水（B）。不同溶剂洗脱见图3。

上述结果显示：甲醇-水系统在梯度洗脱过程中会出现基线漂移，加入乙腈后的三元系统有一定的改善，但信息量减少。以乙腈和水的二元系统，所提供的信息多，色谱的分离度提高。因此确定流动相系统为乙腈与水。

2.2检测波长的选择

分别考察不同检测波长下的分离图谱，如图4。以248nm波长下的信息量较丰富而且色谱峰的表观丰度高，因此以248nm作为白术药材指纹图谱的检查波长。

2.3柱温的选择

比较不同柱温对分离结果的影响，如图5。结果显示柱温对色谱峰的分离影响不大，因此可选择柱温30℃作为白术药材液相指纹图谱的柱温。

2.4色谱适应性

分别对不同品牌的C18色谱柱进行了实验，如图6，色谱条件能在Comatex RP-18、PhenomenexRP-18、kromasil RP-18等品牌色谱柱上重现。

2.5结论

根据以上实验，白术水煎液高效液相的指纹图谱的色谱条件为：色谱柱：Diamonsil钻石C18（250mm×4.6mm×5μm）色谱柱；流动相：乙腈（A相）-水（B相）;梯度洗脱条件：A 0-15min(2%-15%);15-25min（15%-40%）；25-40min(40%-53%）;40-50min(53%-70%);50-70min(70%-70%);70-80min(70%-100%;80-100min(100%-100%);流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：248nm。

3样品的前处理

3.1参照品溶液的制备

精密称取白术内酯Ⅲ约3mg，配成10ug/ml左右的甲醇溶液，4℃保存，备用。

3.2供试品的制备

精密称取白术药材约2g,加水40ml,用小烧杯煎煮2次，每次1h，过滤后浓缩成10ml左右，转移至蒸发皿中，蒸干，加入甲醇20ml后超声20min,过滤，浓缩，定容为5ml，作为供试品溶液。

4方法学考察

4.1样品稳定性考察

取同一份供试品溶液分别在0,2,4,8,10,24h不同时间点进行检测，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD分别为0.10%～0.23%，各特征峰的相对保留时间及相对含量在24小时内均无显著变化，故可在24h完成测定。见图7。

4.2仪器精密度实验

取同一份供试品溶液，连续进样5次，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD分别为0.11%～0.19%，各特征峰保留时间及其相对含量均无明显差异，表明仪器精密度良好。见图8。

4.3重复性实验

取同一批号的供试品5份，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD分别为0.08%～0.26%，各特征峰均能稳定出现，但表观丰度存在差异，可能与取样的不均匀性有关，但该方法具有较好的可重复性。见图9.

4.5样品的测定

取白术药材约2g，按3.2项下方法制备供试品溶液，进样体积为20μl，记录色谱图，见图2。

5实验结果

5.1指纹图谱共有峰的确立

取不同批次的白术药材约2g，按3.2项下方法制备各供试品溶液，按以上色谱条件记录10批供试品的HPLC图谱见图7。根据不同产地样品分析的结果，标定12个峰为共有峰（见图2）所选供有峰可以较全面的反映样品中化学成分的信息，7号为白术内酯Ⅲ，7号峰与其他峰分离良好，峰形稳定，以该峰为参照，在上述条件下以参照物峰的保留时间和峰面积为1，计算其余各峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表2与表3。

表2白术各样品峰的相对保留时间比值

表3白术各样品峰的相对峰面积比值

5.2指纹图谱相似度评价

以平均值法建立共有模式，利用国家药典委员会相似度计算软件，对所得的10个产地白术药材指纹图谱进行相似度计算，具体数据见表4。

表4样品相似度

根据以上试验结果，并结合“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）”的规定，暂定白术药材指纹图谱的相似度值不得低于0.943（以对照谱图为参照）。

小结与讨论

3.1本实验分别考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇/乙腈-水3种不同色谱系统，由于甲醇-水在梯度洗脱的过程中会发生漂移，甲醇/乙腈-水色谱信息会减少，所以选择乙腈-水为流动相。

3.2指纹图谱上能检测的峰较多，其中有12个峰比较稳定，所以选为共有峰，通过对不同产地白术指纹图谱的比较，可以看出不同产地药材虽然有相应的色谱峰，但峰面积有所差异。

3.3本实验建立的白术药材的HPLC指纹图谱，各色谱峰分离度较好，方法简便，可操作性强，可用于白术药材的鉴别和品质评价，且指纹图谱提供的信息较为丰富。

Claims

1.一种白术药材的检测方法，其特征在于：该方法是采用HPLC指纹图谱进行检测，其操作步骤如下：

（2）取白术内酯Ⅲ，制备参照物溶液；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测波长为248nm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测温度为30±2℃；流速为1.0ml/min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：色谱柱为Diamonsil钻石C18，250mm×4.6mm×5μm。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作如下：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：每毫升供试品溶液相当于0.3-0.5g白术药材。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，选用甲醇制备参照物溶液。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述HPLC指纹图谱中，有12个共有特征峰；以白术内酯Ⅲ的色谱峰的保留时间为1计算其他峰的相对保留时间：1号峰的相对保留时间为0.52±0.02；2号峰的相对保留时间为0.63±0.01；3号峰的相对保留时间为0.66±0.01；4号峰的相对保留时间为0.78±0.01；5号峰的相对保留时间为0.80±0.005；6号峰的相对保留时间为0.82±0.01；8号峰的相对保留时间为1.10±0.01；9号峰的相对保留时间为1.125±0.004；10号峰的相对保留时间为1.135±0.004；11号峰的相对保留时间为1.145±0.005；12号峰的相对保留时间为1.23±0.01。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述指纹图谱如图2所示。