CN1529162A - 白术药材tlc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白术药材TLC指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。首先，取白术药材粉末，加水超声提取，滤过，滤液加95％乙醇，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，水提醇沉液以乙酸乙酯提取，乙酸乙酯蒸干，定容，作为供试品溶液；吸取供试品溶液，点于硅胶G薄层板上，以环己烷－氯仿－乙酸乙酯(20∶5∶8)为展开剂，预饱和20min，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；再进行荧光扫描，测定波长λ＝330nm；获得白术药材指纹图谱。并通过对11批白术药材的TLC指纹图谱进行比较，确定了其共有指纹特征，得到白术药材的标准指纹图谱。本发明为白术药材质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及白术药材指纹图谱的构建方法，本发明还涉及由此方法所得到的白术药材标准指纹图谱。
背景技术
我国中药材品种繁多，来源复杂，由于地方差异，药材中同名异物、同物异名的现象十分常见。市场上以假乱真、以次充优的情况时有发生，即使对同一种药材，由于各地的生长环境、种植技术等的不同，质量也会有很大的差异。因此，采用什么方法对药材进行合理、有效的评价，是一项重要的任务。
传统的药材评价方法是用单一的化学成分作为评价指标，具有很大的局限性。中药指纹图谱为解决这一问题提供了钥匙。由于中药具有成分复杂、有效成分不完全明确的特点，指纹图谱的整体性和模糊性可以有效地反映同一物种个体的相似性。通过指纹图谱的特征性，能有效地鉴别中药的真伪，通过指纹图谱主要特征峰面积或比例的制定，能有效地控制中药的质量，确保其质量的相对稳定性，对有效地控制中药质量具有重要意义。国外对植物药指纹图谱也有相似的应用，德国银杏提取物制剂就是其中十分突出的一个例子。
白术为菊科(Compositae)植物白术Atractylodes macrocephala Koedz.的干燥根茎，产于浙江、安徽等地，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，在中药领域多有应用。本发明用薄层色谱法构建了白术药材的指纹图谱，为白术药材质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种白术药材指纹图谱的构建方法，以及由此方法所得到的白术药材标准指纹图谱。
本发明的白术药材指纹图谱的构建方法包括下列步骤：
(1).供试品溶液的制备：精密称取白术药材粉末，加水超声提取，滤过，滤液加95％乙醇静置过夜，滤过，回收乙醇，转移至分液漏斗用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯蒸干，转移至刻度试管，定容，作为供试品溶液；
(2).薄层层析：精密吸取供试品溶液，点于硅胶G薄层板上，以体积比为20∶5∶8的环己烷-氯仿-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
(3).薄层扫描测定：对薄层斑点进行扫描测定，计算各峰的比移值Rf，并以面积归一化法计算各峰的相对峰面积，得到白术药材的指纹图谱；扫描测定条件为扫描波长330nm；扫描灯：氘灯；测定模式：荧光。
按照上述本发明的方法，在制备供试品溶液时，加水超声提取时的加水量一般不少于5倍生药重量；提取时间一般不少于10min；滤液中加入95％乙醇的量以与水混合后乙醇浓度以体积计一般不小于50％。
按照上述本发明的方法，可得到白术药材的TLC指纹图谱。通过对多批(10批以上)白术药材的TLC色谱图进行比较，确定其共有特征峰，可得到由其共有特征峰构成的白术药材标准指纹图谱。
本发明通过对11批白术药材的TLC色谱图进行比较，确定其共有特征峰，得到了由其共有特征峰构成的白术药材标准指纹图谱。该标准指纹图谱有10个特征峰，各峰Rf值和相对峰面积范围分别为：峰1：0.10，9.58～26.66％；峰2：0.13、1.00～9.10％；峰3：0.19、4.38～14.90％；峰4：0.33、4.30～12.55％；峰5：0.41、12.13～24.32％；峰6：0.50、3.66～9.44％；峰7：0.56、3.13～9.20％；峰8：0.70、15.18～31.24％；峰9：0.84、2.78～8.45％；峰10：0.93、1.28～3.37％。
本发明的优点如下：由于中药具有成分复杂、有效成分不明确的特点，白术药材其成分的研究方面较少，没有一种能够较好地控制其质量的方法。而本指纹图谱的构建，将白术作为一个整体来对待，通过指纹图谱中主要特征峰面积或比例的制定，能有效地用来检测和控制白术的质量，为白术药材质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。且本发明具有方法简便可行、直观、稳定、重现性好、易于操作等特点。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1是11批白术药材样品的TLC图；
图2是11批白术药材样品薄层扫描三维图谱；
图3是白术药材标准指纹图谱。
具体实施方式
本发明的实施例如下。
1仪器与试药
1.1仪器：CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER薄层自动点样仪；CAMAG TLCSCANNER 3薄层色谱扫描仪；CAMAG REPROSTAR 3薄层成像系统；CAMAG TLCPLATE HEATER III薄层板加热器；CAMAG双槽展开缸(瑞士CAMAG公司)；KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药：白术药材(共11批)由广州中一药业有限公司提供，分别来自于浙江、安徽、江苏等地。经鉴定均系《中国药典》所指定的品种。实验所用试剂均为分析纯。
2白术药材指纹图谱的构建
2.1供试品溶液的制备：分别精密称取每批白术药材粉末(过40目筛)2g，加水20ml，超声提取30min，加95％乙醇34ml，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，至余液约为5ml，移至分液漏斗，用10ml蒸馏水洗涤，洗涤液并入分液漏斗，以乙酸乙酯20ml提取，乙酸乙酯提取液50℃蒸干，乙酸乙酯溶解转移入5ml刻度试管，定容至3ml，作为供试品溶液。
2.2薄层层析：分别精密吸取每批白术药材供试品溶液3μl点于Merck预制板(20cm×20cm)上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯(20∶5∶8)为展开剂，预饱和20min，展开，取出，晾干，喷以以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。
2.3薄层扫描：扫描波长λ＝330nm；扫描灯：氘灯；光束狭缝：5.00mm×0.1mm；扫描速度：25mm/s；测定模式：荧光。得到的11批白术药材样品的TLC图和三维扫描图分别如图1和图2所示。
2.4指纹特征的确定：通过对比11批药材的薄层扫描图，选取1～10号峰作为白术药材的指纹特征峰，构成白术药材的标准指纹图谱(见图3)。
各样品Rf值、相对峰面积见表1～表3。
表1白术样品Rf值
样品 峰1 峰2 峰3 峰4 峰5 峰6 峰7 峰8 峰9 峰10
1 0.10 0.13 0.19 0.32 0.39 0.47 0.55 0.69 0.84 0.94
2 0.10 0.13 0.19 0.32 0.39 0.48 0.54 0.66 0.81 0.93
3 0.10 0.13 0.19 0.32 0.40 0.47 0.55 0.67 0.82 0.93
4 0.10 0.13 0.19 0.32 0.41 0.49 0.55 0.68 0.83 0.93
5 0.09 0.13 0.19 0.32 0.41 0.51 0.56 0.69 0.84 0.93
6 0.09 0.13 0.19 0.33 0.41 0.51 0.56 0.69 0.83 0.93
7 0.10 0.13 0.20 0.32 0.41 0.50 0.57 0.70 0.84 0.93
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9 0.10 0.13 0.19 0.33 0.41 0.51 0.58 0.71 0.85 0.93
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11 0.10 0.14 0.20 0.34 0.44 0.51 0.59 0.74 0.87 0.94
表2白术样品相对峰面积值(％)
样品 峰1 峰2 峰3 峰4 峰5 峰6 峰7 峰8 峰9 峰10
1 14.87 9.10 4.38 12.55 24.32 4.06 4.18 21.08 4.18 1.28
2 26.66 1.00 8.27 4.30 15.20 3.66 3.13 31.24 4.69 1.85
3 23.71 3.89 8.19 8.66 12.13 8.15 6.74 19.74 5.50 3.28
4 13.42 4.89 6.69 6.47 17.44 9.40 7.84 22.03 8.45 3.37
5 9.89 6.48 6.80 11.73 19.67 6.70 4.62 27.46 5.29 1.37
6 9.58 5.75 5.22 8.33 22.99 8.55 6.53 23.60 6.76 2.70
7 15.75 4.64 9.15 7.03 18.00 6.71 6.33 23.47 7.01 1.90
8 15.07 5.05 10.91 9.40 15.20 8.87 5.72 22.35 5.68 1.75
9 19.18 4.41 12.59 7.91 15.39 7.68 9.20 15.64 5.73 2.27
10 14.40 5.04 14.26 8.27 13.93 9.44 6.95 18.27 6.33 3.11
11 22.82 6.37 14.90 9.61 12.75 7.51 6.50 15.18 2.78 1.57
表3特征峰Rf值及相对峰面积范围
特征峰 Rf值 相对峰面积(％)
峰1 0.10 9.58～26.66
峰2 0.13 1.00～9.10
峰3 0.19 4.38～14.90
峰4 0.33 4.30～12.55
峰5 0.41 12.13～24.32
峰6 0.50 3.66～9.44
峰7 0.56 3.13～9.20
峰8 0.70 15.18～31.24
峰9 0.84 2.78～8.45
峰10 0.93 1.28～3.37
Claims (5)
1.一种白术药材TLC指纹图谱的构建方法，依次包括以下步骤：
(1).供试品溶液的制备：精密称取白术药材粉末，加水超声提取，滤过，滤液加95％乙醇静置过夜，滤过，回收乙醇，转移至分液漏斗用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯蒸干，转移至刻度试管，定容，作为供试品溶液；
(2).薄层层析：精密吸取供试品溶液，点于硅胶G薄层板上，以体积比为20∶5∶8的环己烷-氯仿-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
(3).薄层扫描测定：对薄层斑点进行扫描测定，计算各峰的比移值Rf，并以面积归一化法计算各峰的相对峰面积，得到白术药材的指纹图谱；扫描测定条件为扫描波长330nm；扫描灯：氘灯；测定模式：荧光。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是：在制备供试品溶液时，加水超声提取时的加水量不少于5倍生药重量；提取时间不少于10min；滤液中加入95％乙醇的量以与水混合后乙醇浓度以体积计不小于50％。
3.一种按照权利要求1或2所述方法得到的白术药材TLC指纹图谱。
4.按照权利要求3所述的白术药材TLC指纹图谱，其特征是该指纹图谱是通过比较11批白术药材的TLC色谱图，由其共有特征峰构成的白术药材标准指纹图谱。
5.按照权利要求4所述的白术药材TLC指纹图谱，其特征是：该指纹图谱有10个特征峰，各峰Rf值和相对峰面积范围分别为：峰1：0.10，9.58～26.66％；峰2：0.13、1.00～9.10％；峰3：0.19、4.38～14.90％；峰4：0.33、4.30～12.55％；峰5：0.41、12.13～24.32％；峰6：0.50、3.66～9.44％；峰7：0.56、3.13～9.20％；峰8：0.70、15.18～31.24％；峰9：0.84、2.78～8.45％；峰10：0.93、1.28～3.37％。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101078713B (zh) * | 2007-06-28 | 2010-08-11 | 上海现代中医药技术发展有限公司 | 一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱检测方法 |
| CN101474232B (zh) * | 2007-12-18 | 2012-05-30 | 北京康仁堂药业有限公司 | 一种白术配方颗粒及其制备方法和质量控制方法 |
| CN102680631A (zh) * | 2012-05-24 | 2012-09-19 | 成都中医药大学 | 一种白术药材的检测方法 |
| CN107315062A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-11-03 | 安徽九洲方圆制药有限公司 | 一种白术饮片与麸炒白术饮片及其配方颗粒的鉴别方法 |
-
2003
- 2003-10-16 CN CN 200310111788 patent/CN1246694C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101078713B (zh) * | 2007-06-28 | 2010-08-11 | 上海现代中医药技术发展有限公司 | 一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱检测方法 |
| CN101474232B (zh) * | 2007-12-18 | 2012-05-30 | 北京康仁堂药业有限公司 | 一种白术配方颗粒及其制备方法和质量控制方法 |
| CN102680631A (zh) * | 2012-05-24 | 2012-09-19 | 成都中医药大学 | 一种白术药材的检测方法 |
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