CN1837791A - 近场增强拉曼分子指纹谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
近场增强拉曼分子指纹谱分析方法属于生物大分子分析技术领域，特别适用于蛋白质组学分析。其特征是采用超灵敏近场增强拉曼显微分析系统，该系统由近场增强拉曼样品池与倒置或正置显微镜和拉曼谱仪组成，样品池用优化设计，激励光束的偏振有多项考虑，分析方法有五个步骤或根据需要选择其中几个步骤，将生物样品，如蛋白质组样品制备成液态或水溶液直接使用；或将其充分二维凝胶电泳分离简化后使用，在该系统上测出近场增强拉曼分子指纹谱数据后，与数据库比较指认生物样品或蛋白质组样品中蛋白质组份及其结构，本发明的效果和益处是该方法特别适用于活性蛋白质组样品研究，特别适用于药理、病理研究和一些重大疾病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物大分子分析技术领域，尤其涉及一种蛋白质组学近场增强拉曼分子指纹谱分析方法。
背景技术
在光谱分析技术中，分子拉曼散射由于散射截面太小(约10-29cm2)应用受到很大局限。近些年来，表面增强拉曼散射(SERS)技术可使拉曼散射截面有许多数量级的提高，扩大了拉曼分析的应用范围。2002年吴世法和吴冠英申请了“激励和接收均用隐失光的拉曼散射近场增强样品池”发明专利(申请号：CN021544689)，应用该发明专利可极大地增强样品池中“热点”的电场强度和增加拉曼分析域中“热点”的数量，并最有效地收集分子近场增强特征拉曼散射信息，提高拉曼增强因子(即等效于极大地提高表面吸附分子拉曼散射截面)，给生物大分子特别是蛋白质组近场增强拉曼分子指纹分析技术创造了前所未有的超高灵敏检测条件。
蛋白质组学不是研究蛋白质单一组分的结构与功能的蛋白质化学或蛋白质结构生物学，正如(美)D.C.利布莱尔所著《蛋白质组学导论》一书所述：“蛋白质组学研究多蛋白质系统，重点研究作为一个大系统或部分网络组成的多个不同蛋白质及其相互作用。蛋白质组学需要进行复杂有机混合体的分析，它并不需要通过一个个蛋白质完整序列测定和鉴定”。蛋白质组学的内容属于系统生物学，而不是结构生物学。换句话说，蛋白质组学的要点是鉴定系统的组份与行为，而不仅仅是任何单一组分蛋白质的行为。分子拉曼特征指纹谱可表征分子结构和分子间结构的特征信息，因此，利用近场增强拉曼分子指纹谱方法分析生物大分子，尤其是分析蛋白质组，在蛋白质组中指认蛋白质，研究蛋白质分子之间结构关系和功能，是一种较好的新方法和新技术。
21世纪初的今天，基因与基因组学的进展，已经使蛋白质组学的研究成为生命科学中更为重要的新世纪历史任务。开展蛋白质组学研究，其基础是要有相应的好方法和好技术手段。蛋白质组学分析比基因组学分析复杂得多，蛋白质组学的研究方法比基因组学方法困难得多。基因微阵(芯片)技术比较成熟，可提供细胞中大量或全部基因表达的快速检测，然而各种mRNA不同的稳定性和不同的翻译效率能影响新蛋白质的产生，蛋白质的活性和功能常有一些内源翻译后的改变，也还会因环境因素而改变，蛋白质有翻译后的不同修饰，因此一个蛋白质并不一定只有一种分子实体。由于蛋白质没有类似于PCR扩增和专一性的与互补氨基酸序列杂交等技术，而且在一些细胞中有些蛋白质分子的含量又特别少，这些特殊性使蛋白质组学分析方法面临巨大的挑战，蛋白质组学分析方法比基因组学分析方法难度大得多，至今还没有找到很好的和完善的方法。
当前用于单一蛋白质的分析方法主要有：“X射线晶体学方法”、“核磁共振谱学方法”，非单一蛋白质的分析方法有“生物质谱学方法”等几种方法，其中，生物质谱学方法是当前蛋白质组学分析的主要方法。它们都各有特色、优点，但还有一些重要的局限与不足。它们的主要局限大致有：
(1)大与特大分子量的蛋白质分析尚有些困难；
(2)生物质谱学方法对同质异构蛋白质分子无法分辨；
(3)不能保持蛋白质组生物样品活性，更不能在位进行分析，常常需要将样品作解体分析；
(4)不能分析蛋白质组中分子与分子之间的结构关系；
(5)一些细胞中有些蛋白质分子的含量特别少，功能却很特殊，上述方法不能胜任；
(6)蛋白质组学分析要求有极大的数据量与极快的分析速度，现尚难于满足要求；
(7)极高纯度的样品制备技术比较难，生物晶体学方法要制备成较大晶体，难度更大；
(8)设备很贵。
发明内容
本发明的目的是为生物大分子特别是为蛋白质组学分析技术提供一种新的近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，利用一些现有技术的改进和开发一些新的检测方法，组合成一套新的可用于生物大分子，特别是蛋白质组学的分析方法。
根据本发明提出的近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，其特征有五个步骤或根据需要选择其中几个步骤：
第一步，将生物样品制备成液态或水溶液直接使用；或将其充分二维凝胶电泳分离简化后，制成水溶液使用；
第二步，将液态或水溶液生物样品或经充分二维凝胶电泳分离简化后的样品，放在近场增强拉曼显微分析系统的超灵敏样品池中，测出生物样品近场增强拉曼分子指纹谱数据；
第三步，将上一步测得的近场增强拉曼分子指纹谱数据与已建立的有关近场增强拉曼分子指纹谱数据库进行比对或参考蛋白质和基因组序列数据库的分析，根据实测谱与数据库进行匹配比较的结果或根据近场增强拉曼分子指纹谱理论指认的结果，鉴定生物大分子组份和结构；
第四步，有关生物样品近场增强拉曼分子指纹谱数据库的建立方法，用纯化样品，在超灵敏近场增强拉曼显微镜分析系统中测出近场增强拉曼分子指纹谱数据，存入数据库；在创建一些样品早期的数据库时，将生物原样品经充分二维凝胶电泳分离后的样品分成两份，一份做质谱分析鉴定，认定样品中的组份，另一份做近场增强拉曼生物大分子指纹谱分析鉴定，用这两份相关分析鉴定数据，构建与样品相关的数据库；
第五步，根据某些生物大分子近场增强拉曼分子指纹特征谱的峰位、相对强度偏离情况，进一步分析生物大分子中某些组份分子之间的空间结构，相互关系与功能。
本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法中，其中近场增强拉曼显微分析系统的结构特征是由超灵敏近场增强拉曼样品池(3)、倒置或正置显微镜(2)和拉曼谱仪(1)组成，见图1，超灵敏近场增强拉曼样品池中用于产生“热点”的银粒子直径和上、下银膜的厚度采用优化设计，银粒子直径和上、下银膜的厚度优选平均尺度分别在37纳米，65纳米和7纳米附近，当银密度改变时上述尺度需做适量调整。
本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法的近场增强拉曼显微分析系统中，超灵敏近场增强拉曼样品池的激励光束的特征是将特大数值孔径物镜(6)入瞳前的平行光束进行截取或分割：
(1)截取大数值孔径区域中细激光束(11)，以P偏振全内反射产生纵向隐失光激励样品；
(2)或在大数值孔径区域中，分四个象限区，分别插入1/4，1/2或31/4波片，产生放射型偏振光束激励样品；或产生X、Y正交横向二维偏振光束激励样品；或产生X、Y、Z正交三维偏振光束激励样品；或用满数值孔径X方向线偏振光束激励样品。
本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，在近场增强拉曼显微分析系统中，为了使P偏振细激光束满足样品池中下银膜界面产生表面等离子激元共振(SPR)的条件，进一步增强激励拉曼散射的电场强度，截取大数值孔径区域中细激光束的特征是通过平行移动入射细激光束，微调细激光束的入射角，使其满足产生表面等离子激元共振的条件，以增强样品池中热点的电场强度。
本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，在近场增强拉曼显微分析系统中，大数值孔径区域分四个象限区，产生放射型偏振光束的特征是，采用分象限插入波片方法，以原光束偏振方向为第一象限，在第二、第三和第四象限中分别插入1/4，1/2和31/4波片，把原为同一线偏振的四象限光束改造成以原点为中心呈放射型偏振的光束，以增强样品池中纵向偏振的电场强度。
本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，在近场增强拉曼显微分析系统中，大数值孔径区域分四个象限区，产生X、Y正交横向二维偏振光束的特征是，采用分象限插入波片方法，以原光束偏振方向为第一象限，在第二和第四象限中插入1/4波片，把原为X方向一维偏振光束改造成为X、Y正交横向二维偏振光束。
本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，在近场增强拉曼显微分析系统中，大数值孔径区域分四个象限区，产生X、Y、Z正交三维偏振光束的特征是，采用分象限插入波片方法，以原X方向偏振光束为第一象限，在第二、第三和第四象限中分别插入1/4，1/2和31/4波片，把原为X方向偏振光束改造成为X、Y、Z正交三维偏振的光束。
本发明的效果和益处：
1、本发明应用于生物大分子，尤其蛋白质组学；将有可能弥补上述在蛋白质组学分析方法中的不足，有可能发展成为蛋白质分析的主要方法之一。
2、这种新方法对于分析蛋白质组的特色和优点是：
(1)在活性样品中可进行蛋白质检测，可保持生物样品活性；
(2)近场增强拉曼分子指纹谱可以分辨同质异构蛋白质分子，生物质谱学方法不能分辨；
(3)不要求样品超高纯度，近场增强拉曼分子指纹谱峰比荧光谱峰窄很多，检测动态范围大，允许同时检测多种蛋白质和少许其他及他生物大分子的存在；
(4)需要样品量极小，仅需要μm尺度；
(5)无论蛋白质分子大小，特大的分子也能适应；
(6)检测速度快，靠近场增强拉曼分子特征谱指认，精确可靠，可重复多次测定；
(7)设备价格相对便宜，与已有的生物质谱学方法相比约仅1/5-1/3。
本发明专利适用于检测活性蛋白质组样品和研究蛋白质组中分子与分子之间的结构关系，特别适用于药理、病理研究和早期疾病的诊断。这些方面的许多应用其他方法均难于替代，本发明专利还适用于其他生物大分子的分析研究，但重点是为蛋白质组学开发一种新的分子分析方法与技术。
附图说明
图1为本发明的近场增强拉曼显微分析系统示意图。
图2为用近场增强拉曼显微分析系统测得的正常人血清和有乙肝病毒(大三阳)血清的近场增强拉曼分子指纹谱的对比图。
图3为《光谱学与光谱分析》杂志2000，20(16)：844页中的用常规拉曼谱仪测得的正常人血清的拉曼光谱图。
图4为用近场增强拉曼显微分析系统测得的纯核心抗原的近场增强拉曼分子指纹谱图。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。
本发明以人的血清样品为例：
有、无乙肝病毒人的血清的近场增强拉曼分子指纹谱应该不同，发明人曾用常规显微拉曼谱仪，对有、无乙肝病毒人的血清进行实验，没有获得拉曼光谱结果。有、无乙肝病毒人血清中有蛋白质组样品，用本发明具体实施近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，采用了如下步骤：
一、样品的准备，有、无乙肝病毒人的血清是液体，可直接使用。样品标号“A9”血清乙肝五项分析结果为“阴性”，样品标号“B18”血清乙肝五项分析结果为“大三阳”。为了与已有成熟技术比较，用当前最灵敏的时间分辨荧光分析仪(TRFAI)，测出二血清样品的乙肝病毒五项分析结果如下：
| 标号 | HBsAg(ng/ml) | HBsAb(NCU/ml) | HBeAg(mlU/ml) | HBeAb(NCU/ml) | HBcAb(NCU/ml) |
| A9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B18 | 180 | 0 | 0.16 | 0 | 10.2 |
二、将标号“A9阴性”血清样品和标号“B18大三阳”血清样品分别放在近场增强拉曼显微分析系统中检测，拉曼信号很强。随后将样品稀释100倍，标号分别记为“A9/100”和“B18/100”，在近场增强拉曼显微分析系统中检测，获得“A9/100阴性”和“B18/100大三阳”的近场增强拉曼分子指纹谱结果，见图2，“A9/100阴性”为红色曲线，“B18/100大三阳”为兰色曲线。系统参数：激光波长632.8nm，激励功率3.5mW，分辨率2cm-1，曝光10sec。
三、结果分析：
(1)“B18/100”样品为B18样品稀释了100倍，表面抗原(HBsA)的浓度为1.8ng/nl，e抗原(HBeAg)的浓度为0.0016mlU/ml，核心抗体的浓度为0.102NCU/ml，在此浓度下当前最灵敏的时间分辨荧光分析仪(TRFAI)已经难于检测了；但是由图2可明显辨别“B18/100”兰色曲线与“A9/100”红色曲线的很大不同，即近场增强拉曼显微分析系统能检测到血清中极其微量的乙肝病毒；与其比较，当前最灵敏的时间分辨荧光分析仪(TRFAI)尚难于检测，因此说明：本发明近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，近场增强拉曼显微分析系统的检测灵敏度很高，有可能用于早期乙肝病毒感染和其他一些重大疾病的早期快速诊断。
(2)“A9/100阴性”正常人血清的近场增强拉曼分子指纹谱结果，与《光谱学与光谱分析》杂志2000，20(16)：844中的用常规显微拉曼谱仪测得的正常人血清的拉曼光谱图(见图3)比较，后者没有检测到任何特征谱，因此说明：近场增强拉曼显微分析系统的检测灵敏度比常规显微拉曼谱仪灵敏度高很多。
四、有、无乙肝病毒人的血清的近场增强拉曼分子指纹谱数据库尚未建立，用已知纯化样品建数据库方法作了一个演示。将核心抗体纯品，放在超灵敏近场增强拉曼显微镜分析系统中，测出了近场增强拉曼分子指纹谱数据，见图4，此标准谱数据很稳定，可将其存入数据库。由于购买的核心抗体纯品是合成的，其近场增强拉曼分子指纹谱数据与有乙肝病毒人的血清的近场增强拉曼分子指纹谱数据比较、分析尚存在困难。还有进一步的研究工作要做。经初步比较，拉曼频移有五个峰相重：1584，1380，1488，852和714cm-1。
在上述分析方法中，超灵敏近场增强拉曼显微分析系统示意图见图1，该系统由拉曼谱仪1、倒置光学显微镜2和近场增强拉曼散射样品池3组成，引入细激光束11，经二次平面反射镜和陷波滤光片4反射后，进入倒置光学显微镜2中，再经反射镜5反射，在特大数值孔径物镜6的入射光阑孔内控制入射角入射，以隐失光形式激励样品池3中的样品10，样品放在样品池中，样品池下有最佳厚度为7纳米银膜左右的下玻璃基片7，上有最佳厚度为65纳米左右银膜的上玻璃基片，当样品10放在下银膜上以后，加入最佳直径为37纳米左右的银球8，压紧上下玻璃基片，使在其间的银球紧密分布仅一层，密布银球与银膜之间在P偏振细激光束照射下，诱发等离子激元耦合产生许多“热点”(热点数约103/微米2)，在“热点”内的生物样品的拉曼散射将被极大地增强，与拉曼谱仪狭缝对应局域中有许多“热点”，“热点”中的蛋白质分子的近场增强拉曼散射光经倒置光学显微镜物镜6收集和用拉曼谱仪记录下来，即可获得蛋白质近场拉曼分子指纹谱数据。经过全内反射激励后引出的剩余光束12用陷波滤光片4反射出拉曼谱仪光学系统，以提高近场增强拉曼分子指纹谱的信噪比。激励光束引入系统和激励样品后剩余光束引出系统，均用同一块陷波滤光片4的反射完成。
Claims (7)
1.一种近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，其特征有五个步骤：
第一步，将生物样品制备成液态或水溶液直接使用；或将其充分二维凝胶电泳分离简化后，制成水溶液使用；
第二步，将液态或水溶液生物样品或经充分二维凝胶电泳分离简化后的样品，放在近场增强拉曼显微分析系统的超灵敏样品池中，测出生物样品近场增强拉曼分子指纹谱数据；
第三步，将上一步测得的近场增强拉曼分子指纹谱数据与已建立的有关近场增强拉曼分子指纹谱数据库进行比对或参考蛋白质和基因组序列数据库分析，根据实测谱与数据库进行匹配比较的结果或根据近场增强拉曼分子指纹谱理论指认的结果，鉴定生物大分子组份和结构；
第四步，有关生物样品近场增强拉曼分子指纹谱数据库的建立方法，用纯化样品，在超灵敏近场增强拉曼显微镜分析系统中测出近场增强拉曼分子指纹谱数据，存入数据库；在创建一些样品早期的数据库时，将生物原样品经充分二维凝胶电泳分离后的样品分成两份，一份做质谱分析鉴定，认定样品中的组份，另一份做近场增强拉曼生物大分子指纹谱分析鉴定，这两份相关分析鉴定数据，构建与样品相关的数据库；
第五步，根据某些生物大分子近场增强拉曼分子指纹特征谱的峰位、相对强度偏离情况，进一步分析生物大分子中某些组份分子之间的空间结构，相互关系与功能。
2.根据权利要求1所述的一种近场增强拉曼分子指纹谱分析方法，其中近场增强拉曼显微分析系统是由超灵敏近场增强拉曼样品池(3)、倒置或正置显微镜(2)和拉曼谱仪(1)组成，超灵敏近场增强拉曼样品池中用于产生“热点”的银粒子直径和上、下银膜的厚度采用优化设计，银粒子直径和上、下银膜的厚度优选平均尺度分别在37纳米，65纳米和7纳米附近，当银密度改变时上述尺度需做适量调整。
3.根据权利要求2所述的近场增强拉曼显微分析系统，其中超灵敏近场增强拉曼样品池的激励光束的特征是将特大数值孔径物镜(6)入瞳前的平行光束进行截取或分割：
(1)截取大数值孔径区域中细激光束(11)，以P偏振全内反射产生纵向隐失光激励样品；
(2)或在大数值孔径区域中，分四个象限区，分别插入λ/4，λ/2或3λ/4波片，产生放射型偏振光束激励样品；或产生X、Y正交横向二维偏振光束激励样品；或产生X、Y、Z正交三维偏振光束激励样品；或用满数值孔径X方向线偏振光束激励样品。
4.根据权利要求3所述的特大数值孔径物镜入瞳前的平行光束，截取大数值孔径区域中细激光束的特征是通过平行移动入射细激光束，微调细激光束的入射角，使其满足产生表面等离子激元共振的条件。
5.根据权利要求3所述的特大数值孔径物镜入瞳前的平行光束的分割方法，在大数值孔径区域中分四个象限区，产生放射型偏振光束的特征是，采用分象限插入波片方法，以原光束偏振方向为第一象限，在第二、第三和第四象限中分别插入λ/4，λ/2和3λ/4波片，把原为同一线偏振的四象限光束改造成以原点为中心呈放射型偏振的光束。
6.根据权利要求3所述的特大数值孔径物镜入瞳前的平行光束的分割方法，在大数值孔径区域中分四个象限区，产生X、Y正交横向二维偏振光束的特征是，采用分象限插入波片方法，以原光束偏振方向为第一象限，在第二和第四象限中插入λ/4波片，把原为X方向一维偏振光束改造成为X、Y正交横向二维偏振光束。
7.根据权利要求3所述的特大数值孔径物镜入瞳前的平行光束的分割方法，在大数值孔径区域中分四个象限区，产生X、Y、Z正交三维偏振光束的特征是采用分象限插入波片方法，以原X方向偏振光束为第一象限，在第二、第三和第四象限中分别插入λ/4，λ/2和3λ/4波片，把原为X方向偏振光束改造成为X、Y、Z正交三维偏振的光束。
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