CN104132909A - 诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法。本发明是通过采用近红外光谱技术结合偏最小二乘法建立诃子中没食子酸含量近红外预测模型，以该近红外预测模型实现对诃子中没食子酸含量的分析测定，相比于现有没食子酸测定的常规方法，本发明方法是一种快速、无损的测定方法，经分析验证表明，本发明方法获得的近红外预测模型在用于诃子中没食子酸含量的预测，具有稳定性强、准确性高、重现性佳的优点，本发明为诃子品质的测定检验提供了实验基础，同时也为其他一些植物的品质鉴定提供了新思路。

Description

诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法

技术领域

本发明涉及一种近红外测定方法，具体是一种诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法。

背景技术

诃子（Terminalia chebula Retz）是一种非常重要的药用植物，它是一种很常见的藏药，享有“藏药之王”的美誉。诃子经常被传统医学用来治愈多种疾病，如发烧，咳嗽，腹泻，肠胃炎，皮肤病，念珠菌病，尿路感染和伤口感染。诃子中负责药理成分的是一些可水解的单宁酸（个体变化范围为20%-50%）。没食子酸（gallic acid，GA）是诃子中一种重要的单宁酸，没食子酸亦称“五倍子酸”、“棓酸”，学名“3,4,5-三羟基苯甲酸（C₇H₆O₅）”。

目前最常用的对没食子酸的测定方法是高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。如CN201210204156.2公开了一种通过使用焦性没食子酸的主要原料没食子酸作为内标物质，使用高效液相色谱内标定量分析，精准检测焦性没食子酸的方法。 CN201210513809.5提供了一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时制备及高效液相色谱检测方法。这类方法具有实验周期长、操作繁琐、药品消耗大、污染环境等缺点。因此寻找一种新的可以快速、简便、安全环保、无损的检测方法是非常有必要的。

近红外光谱（Near Infrared Reflectance Spectroscopy，NIR）是利用不同化学基团吸收特定的光谱从而形成特异的吸收峰来检测样品中各组分浓度或机构的技术。相较于传统的一些化学检测手段，近红外光谱具有很多优点，比如预测速度快，分析效率高；无损分析，无污染；分析精度好，重现性好；分析成本低等。

现有技术未有采用近红外光谱技术快速测定诃子中没食子酸含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法，该方法相比于现有没食子酸测定的常规方法，本发明方法是一种快速、无损的测定方法，经分析验证表明，本发明方法获得的近红外预测模型在用于诃子中没食子酸含量的预测，具有稳定性强、准确性高、重现性佳的优点，可为诃子成分的快速检测评估及产品质量控制提供理论依据和分析手段。

    本发明的技术方案如下：一种诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法，采用如下步骤：

（1）采集样品近红外光谱：取诃子样品粉末取诃子样品粉末约30g,，放入近红外仪器自带样品杯中，使样品自然填满样品杯，自然摊平，勿震荡勿挤压，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得样品的近红外光谱值；

（2）高效液相色谱法法测定样品中没食子酸含量：另外称取0.8~1.2g诃子样品粉末于50mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声波提取25~35min，然后利用高效液相色谱法测定诃子样品粉末中没食子酸的含量，得到样品中没食子酸含量的化学值；

（3）建立诃子中没食子酸含量近红外校正模型：根据统计学方法结合诃子中没食子酸含量，将样品集中的样品分为校正集和验证集两部分，将步骤（1）采集到的校正集样品的近红外光谱值和步骤（2）高效液相色谱法测定得到的校正集样品的没食子酸含量的化学值导入The Unscrambler 9.8软件中，利用软件对样品光谱进行预处理，采用偏最小二乘法结合交互验证法对校正集样品建立校正模型，同时作交互验证，并用验证集样品对所建模型进行外部验证，再根据近红外定量校正模型的主要参数确定得到最终的诃子中没食子酸含量近红外校正预测模型；

（4）未知诃子样品没食子酸含量的快速测定：将未知诃子样品经过预处理制成样品粉末，取约30g样品粉末，采用步骤（1）的方法采集其近红外光谱，将光谱经过预处理再将近红外光谱值带入步骤（3）建立的近红外预测模型中，经模型运算，即可获得未知诃子样品中的没食子酸含量；

    其中，所述的诃子样品粉末是指将采集到的诃子经烘干后剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目的粉末；

所述近红外光谱条件为：测样方式为漫反射，光斑直径3.5cm，光谱扫描范围为950-1650nm，分辨率5nm，环境温度22-25℃，环境湿度45~55%，对样品集中的每一个样品扫描两次重复装样三次，取平均值作为样品光谱；

所述高效液相色谱法条件为：Hypsile C18 色谱柱，色谱柱尺寸4.5μm×4.6mm×200mm，流动相：甲醇:水= 15:85等梯度洗脱，流速0.9ml/min，流动相使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤；检测波长273 nm，柱温27℃，每次进样10μl；采用峰面积定量，外标法计算，样品集中的每份诃子粉末样品重复测定3次，取平均值作为样品最终的化学值；

所述的流动相中，甲醇中含有3‰体积磷酸，水含有3‰体积磷酸；

所述的外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值经过预处理代入步骤（3）得到的最终的近红外预测模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤（2）高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度；

所述光谱预处理的方法优选标准正态变换法。

步骤（3）所述主要参数是指：校正集相关系数、交互验证集相关系数、交互验证集均方根误差、验证集决定系数、预测均方根误差。

本发明的方法所述样品集中的样品优选为不少于80个。

    进一步优化的技术方案如下：诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法采用如下步骤：

（1）采集样品近红外光谱：

将采集到的诃子经烘干后剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目的粉末；取诃子样品粉末30g放入近红外仪器自带样品杯中，自然摊平，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得样品的近红外光谱值；

所述近红外光谱条件为：测样方式为漫反射，光斑直径3.5cm，光谱扫描范围为950-1650nm，分辨率5nm，环境温度22-25℃，环境湿度45~55%，对样品集中的每一个样品扫描两次重复装样三次，取平均值作为样品光谱；

（2）高效液相色谱法法测定样品中没食子酸含量：

另称取1.0g诃子样品粉末于50mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声波提取30min，然后利用高效液相色谱法测定诃子样品粉末中没食子酸的含量，得到样品中没食子酸含量的化学值；

所述高效液相色谱法条件为：Hypsile C18 色谱柱，色谱柱尺寸4.5μm×4.6mm×200mm，流动相：甲醇:水= 15:85等梯度洗脱，流速0.9ml/min，流动相使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤；检测波长273 nm，柱温27℃，每次进样10μl；采用峰面积定量，外标法计算，对样品集中每份诃子粉末样品重复测定3次，取平均值作为样品最终的化学值；

所述的流动相中，甲醇中含有3‰体积磷酸，水中含有3‰体积磷酸；

所述甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水；

（3）建立诃子中没食子酸含量近红外校正模型：

根据统计学方法结合诃子中没食子酸含量，将样品集中的样品分为校正集和验证集两部分，样品校正集和验证集的选择依据是：校正集的样本性质具有广泛的代表性，尽可能的覆盖待测样品的性质参数或组分范围，并且所选验证集的范围处于校正集样品范围之内；

将步骤（1）采集到的校正集样品的近红外光谱值和步骤（2）高效液相色谱法测定得到的校正集样品的没食子酸含量的化学值导入The Unscrambler 9.8软件中，利用软件对样品光谱采用标准正态变换法进行光谱预处理，采用偏最小二乘法结合交互验证法对校正集样品建立校正模型，同时作交互验证，并用验证集样品对所建模型进行外部验证，再根据近红外定量校正模型的主要参数：校正集相关系数、交互验证集相关系数、交互验证集均方根误差、验证集决定系数、预测均方根误差确定得到最终的诃子中没食子酸含量近红外预测模型；

（4）未知诃子样品没食子酸含量的快速测定：

    将未知诃子样品诃子烘干，剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目的粉末，取约30g样品粉末，采用步骤（1）的近红外测定方法采集其近红外光谱，采用标准正态变换对光谱进行预处理，再将经过预处理后的近红外光谱值带入步骤（3）建立的近红外预测模型中，经模型运算，即可获得未知诃子样品中的没食子酸含量；

所述的外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值代入步骤（3）得到的最终的近红外预测模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤（2）高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度。

本发明是通过采用近红外光谱技术结合偏最小二乘法建立诃子中没食子酸含量近红外预测模型，以该近红外预测模型实现对诃子中没食子酸含量的分析测定。相比于现有没食子酸测定的常规方法，本发明方法是一种快速、无损的测定方法，经分析验证表明，利用近红外结合偏最小二乘法建模直接测定诃子中没食子酸的含量是可行的，本发明方法获得的近红外预测模型在用于诃子中没食子酸含量的预测，具有稳定性强、准确性高、重现性佳的优点。本发明为诃子品质的测定检验提供了实验基础，同时也为其他一些植物的品质鉴定提供了新思路。

附图说明

图1为诃子样品的近红外光谱图。

图2 为诃子中没食子酸含量近红外预测模型。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例 采用以下步骤实现本发明：

1、采集样品近红外光谱：

（1）样品预处理：

将采集到的诃子经烘干后剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目的粉末，制备成含有89个样品的样品集。

（2）样品近红外光谱测定

采用瑞典Perten公司生产DA7200型近红外成分分析仪，配有SimplicityTM光谱采集软件和The Unscrambler 9.8（挪威Camo公司）化学计量学分析软件采集样品近红外光谱：取诃子样品粉末30g放入近红外仪器自带样品杯中，自然摊平，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得样品的近红外光谱值。近红外光谱条件为：测样方式为漫反射，光斑直径3.5cm，光谱扫描范围为950-1650nm，分辨率5nm，环境温度22-25℃，环境湿度45~55%，对样品集中的每一个样品扫描两次重复装样三次，取平均值作为样品光谱。测定得到的诃子样品的近红外光谱图如图1所示。

2、高效液相色谱法法测定样品中没食子酸含量

    另称取1.0g诃子样品粉末于50mL容量瓶中，加入甲醇（色谱纯，下同）定容，超声波提取30min，然后利用高效液相色谱法测定诃子样品粉末中没食子酸的含量，得到样品中没食子酸含量的化学值。

高效液相色谱法条件为：Hypsile C18 色谱柱，色谱柱尺寸4.5μm×4.6mm×200mm，流动相：甲醇（含3‰体积的色谱纯磷酸）:水（含3‰体积的色谱纯磷酸）= 15:85等梯度洗脱，流速0.9ml/min，流动相使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤；检测波长273 nm，柱温27℃，每次进样10μl；采用峰面积定量，外标法计算，对样品集中每份诃子粉末样品重复测定3次，取平均值作为样品最终的化学值。

3、诃子中没食子酸含量近红外校正模型的建立

（1）校正集和验证集的选择

    根据统计学方法结合诃子中没食子酸含量，将样品集中的样品分为校正集和验证集两部分。样品校正集和验证集的选择依据是：校正集的样本性质具有广泛的代表性，尽可能的覆盖待测样品的性质参数或组分范围，并且所选验证集的范围处于校正集样品范围之内；本实施例在样品集的样品中选择校正集样品73个，验证集样品16个，校正集和验证集的样品中没食子酸的含量分布情况如表1所示。

表1  校正集和验证集中没食子酸的含量分布(mg/g)

。

（2）校正模型的建立和验证

A、方法：将采集到的校正集样品的近红外光谱值和高效液相色谱法测定得到的校正集样品的没食子酸含量的化学值导入The Unscrambler 9.8软件中，利用软件对样品光谱采用标准正态变换法进行光谱预处理，采用偏最小二乘法结合交互验证法对校正集样品建立校正模型，同时作交互验证，并用验证集样品对所建模型进行外部验证，再根据近红外定量校正模型的主要参数确定得到最终的诃子中没食子酸含量近红外校正模型。评价模型得主要参数有校正集相关系数（Rc）、交互验证集相关系数（Rv）、交互验证集均方根误差（RMSEV）、验证集决定系数（r²）、预测均方根误差（RMSEP）。较高的Rv和较低的RMSEV能表明模型预测外部样品的准确性能更高，同时校正集与验证集的均方根误差越接近越好。

B、模型的优化和确定：利用标准正态变量变换对光谱进行预处理主要是消除固体颗粒大小、表面散射和光程变化对近红外漫反射光谱的影响。利用利用标准正态变量变换对光谱全波段处理之后所得的校正模型的Rc和RMSEC分别为0.861和2.522，交互验证集的Rv和RMSEV分别为0.793和3.236。根据统计学分析方法，通过分析软件的杠杆值影响图（Influence Plot）和学生化残差（Studentized residuals）结果对异常样品进行剔除，再剔除了7个异常样品后，所得优化模型的Rc和RMSEC分别为0.986和1.072，交互验证集的相关系数升至0.960并且均方根误差降低至1.845。最终建立的优化的校正集模型结果如图2。

C、模型的外部验证：利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值代入近红外校正模型中，获得预测化学值，将预测化学值与高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度。

经软件分析后需调整截距-1.038，调整截距后的具体结果见表2。结果表明所建立的模型的预测值与常规测定值之间的相关系数为0.958，预测均方根误差为2.095，比较接近于校正集交互验证均方根误差1.845。另外对于给定的显著性水平0.05，将16个外部验证集样品的没食子酸含量高效液相色谱测定值与模型的预测值进行成对数据配对T检验，结果表明两者之间的差异不显著（P=0.919＞0.05），说明该模型的预测准确度较高，可以对未知没食子酸含量的诃子样品进行实际预测。

表2 用于模型精确度检验的诃子中没食子酸含量的高效液相色谱测定值和对应的近红外模型测定值（mg/g）

4、未知诃子样品没食子酸含量的快速测定：

将未知诃子样品诃子烘干，剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目的粉末，取约30g样品粉末，采用步骤1近红外测定方法采集其近红外光谱，采用标准正态变换对光谱进行预处理，再将经过预处理后的近红外光谱值带入建立的近红外校正模型中，经模型运算，获得未知诃子样品中的没食子酸含量。

Claims (4)

1.一种诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法，其特征在于：采用如下步骤：

（1）采集样品近红外光谱：取诃子样品粉末约30g,，放入近红外仪器自带样品杯中，使样品自然填满样品杯，自然摊平，勿震荡勿挤压，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得样品的近红外光谱值；

（2）高效液相色谱法法测定样品中没食子酸含量：另外称取0.8~1.2g诃子样品粉末于50mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声波提取25~35min，然后利用高效液相色谱法测定诃子样品粉末中没食子酸的含量，得到样品中没食子酸含量的化学值；

（3）建立诃子中没食子酸含量近红外校正模型：根据统计学方法结合诃子中没食子酸含量，将样品集中的样品分为校正集和验证集两部分，将步骤（1）采集到的校正集样品的近红外光谱值和步骤（2）高效液相色谱法测定得到的校正集样品的没食子酸含量的化学值导入The Unscrambler 9.8软件中，利用软件对样品光谱进行预处理，采用偏最小二乘法结合交互验证法对校正集样品建立校正模型，同时作交互验证，并用验证集样品对所建模型进行外部验证，再根据近红外定量校正模型的主要参数确定得到最终的诃子中没食子酸含量近红外预测模型；

（4）未知诃子样品没食子酸含量的快速测定：将未知诃子样品经过预处理制成样品粉末，取约30g样品粉末，采用步骤（1）的方法采集其近红外光谱，将光谱经过预处理再将近红外光谱值带入步骤（3）建立的近红预测正模型中，经模型运算，即可获得未知诃子样品中的没食子酸含量；

其中，所述的诃子样品粉末是指将采集到的诃子经烘干后剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目数的粉末；

所述近红外光谱条件为：测样方式为漫反射，光斑直径3.5cm，光谱扫描范围为950-1650nm，分辨率5nm，环境温度22-25℃，环境湿度45~55%，对样品集中的每一个样品扫描两次重复装样三次，取平均值作为样品光谱；

    所述高效液相色谱法条件为：Hypsile C18 色谱柱，色谱柱尺寸4.5μm×4.6mm×200mm，流动相：甲醇:水= 15:85等梯度洗脱，流速0.9ml/min，流动相使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤；检测波长273 nm，柱温27℃，每次进样10μl；采用峰面积定量，外标法计算，样品集中的每份诃子粉末样品重复测定3次，取平均值作为样品最终的化学值；

所述的流动相中，甲醇中含有3‰体积磷酸，水含有3‰体积磷酸；

所述的外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值经过预处理代入步骤（3）得到的最终的近红外预测模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤（2）高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度；

所述光谱预处理的方法为标准正态变换法。

2.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法，其特征在于：步

骤（3）所述主要参数是指：校正集相关系数、交互验证集相关系数、交互验证集均方根误差、验证集决定系数、预测均方根误差。

3.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法，其特征在于：所述样品集中的样品不少于80个。

4.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的近红外快速测定方法，其特征在于：采用如下步骤：

（1）采集样品近红外光谱：

将采集到的诃子经烘干后剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目数的粉末；取诃子样品粉末30g放入近红外仪器自带样品杯中，自然摊平，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得样品的近红外光谱值；

所述近红外光谱条件为：测样方式为漫反射，光斑直径3.5cm，光谱扫描范围为950-1650nm，分辨率5nm，环境温度22-25℃，环境湿度45~55%，对样品集中的每一个样品扫描两次重复装样三次，取平均值作为样品光谱；

（2）高效液相色谱法法测定样品中没食子酸含量：

另称取1.0g诃子样品粉末于50mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声波提取30min，然后利用高效液相色谱法测定诃子样品粉末中没食子酸的含量，得到样品中没食子酸含量的化学值；

所述高效液相色谱法条件为：Hypsile C18 色谱柱，色谱柱尺寸4.5μm×4.6mm×200mm，流动相：甲醇:水= 15:85等梯度洗脱，流速0.9ml/min，流动相使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤；检测波长273 nm，柱温27℃，每次进样10μl；采用峰面积定量，外标法计算，对样品集中每份诃子粉末样品重复测定3次，取平均值作为样品最终的化学值；

所述的流动相中，甲醇中含有3‰体积磷酸，水中含有3‰体积磷酸；

所述甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水；

（3）建立诃子中没食子酸含量近红外校正模型：

根据统计学方法结合诃子中没食子酸含量，将样品集中的样品分为校正集和验证集两部分，样品校正集和验证集的选择依据是：校正集的样本性质具有广泛的代表性，尽可能的覆盖待测样品的性质参数或组分范围，并且所选验证集的范围处于校正集样品范围之内；

将步骤（1）采集到的校正集样品的近红外光谱值和步骤（2）高效液相色谱法测定得到的校正集样品的没食子酸含量的化学值导入The Unscrambler 9.8软件中，利用软件对样品光谱采用标准正态变换法进行光谱预处理，采用偏最小二乘法结合交互验证法对校正集样品建立校正模型，同时作交互验证，并用验证集样品对所建模型进行外部验证，再根据近红外定量校正模型的主要参数确定得到最终的诃子中没食子酸含量近红外预测模型；

（4）未知诃子样品没食子酸含量的快速测定：将未知诃子样品诃子烘干，剥离果肉，将果肉研磨成均匀、一致、过40目数的粉末，取约30g样品粉末，采用步骤（1）的近红外测定方法采集其近红外光谱，采用标准正态变换对光谱进行预处理，再将经过预处理后的近红外光谱值带入步骤（3）建立的近红外预测模型中，经模型运算，即可获得未知诃子样品中的没食子酸含量；

所述的外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值代入步骤（3）得到的最终的近红外预测模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤（2）高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度。