CN102081076B

CN102081076B - 近红外光谱法检测蜂胶中黄酮类化合物含量的方法

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Publication number: CN102081076B
Application number: CN 201110000616
Authority: CN
Inventors: 蔡蕊; 赵伟杰; 李悦青; 王世盛; 姜博海; 高志刚; 宋其玲
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2011-01-04
Filing date: 2011-01-04
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-01-04
Also published as: CN102081076A

Abstract

近红外光谱法检测蜂胶中黄酮类化合物含量的方法，包括如下步骤①收集蜂胶样品，选择足量有代表性的校正集样本，用HPLC法检测样品中黄酮类化合物含量；②测定校正集样品的近红外光谱谱图，取光谱图的7500～4500cm^-1波段进行光谱预处理后，与HPLC法侧得的该样品的黄酮类化合物含量相关联，采用偏最小二乘法建立校正模型；③测定待测蜂胶样品的近红外光谱谱图，采用与步骤②中相同的预处理方法处理所得谱图中7500～4500cm^-1波段，将预处理后得到的吸光度值代入步骤②的校正模型，得到待测蜂胶样品中黄酮类化合物含量。该方法适用于蜂胶中主要黄酮类化合物的定量分析，方法准确，省时高效。

Description

近红外光谱法检测蜂胶中黄酮类化合物含量的方法

技术领域

本发明涉及蜂胶中黄酮类化合物的含量检测方法，具体地说是利用近红外光谱快速测定蜂胶原料中主要黄酮成分含量的方法。

背景技术

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢和树干处采集树脂混入蜜蜂上颚腺分泌物以及蜂蜡等形成的一种具有芳香味的黏性胶状固形物，其中含有超过200种的活性成分，包括多酚(黄酮苷，酚酸及其酯类)，木脂素类，倍半萜烯类，苯醌类，类固醇类及氨基酸。由于蜂胶具有抗菌、抗滤过性病原体、抗氧化、免疫调节、自由基清除、肝保护、抗炎及抗癌等生物活性，近年来在保健食品和医药领域得到广泛的应用，现已有多种产品被开发，如蜂胶软胶囊、蜂胶粉、蜂胶喷雾剂、蜂胶口服液和蜂胶片等。其优良的自由基清除能力与其黄酮类化合物的含量较高有着密不可分的关系，而蜂胶的抗癌活性则主要来源于咖啡酸苯乙酯(CAPE)和3，5-二异戊二烯基-4-羟基肉桂酸(DHCA)的作用，因此蜂胶中活性成分的含量是鉴定蜂胶质量的重要因素，只有达到《无公害食品-蜂胶质量标准2003年版》中所规定的指标成分的含量要求的蜂胶产品，消费者才可以放心食用。

近年来，对蜂胶中黄酮类化合物含量分析的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)。在现有的文献中，对蜂胶的HPLC含量检测方法并不充分，本发明中在进行近红外研究之前，还改进了HPLC方法，使得各组分峰得到较好的分离，得到尽可能多的峰容量，因为只有建立更可靠的标准参照方法，才能使得蜂胶中各成分被准确的定量。由于蜂胶中成分复杂，在达到较好的分离度的同时，检测时间也就相对加长，每个样品的检测时间要达到60分钟以上，效率低，不利于对蜂胶质量控制的现场检测，且作为流动相使用的溶剂耗费量大，不经济。因此，开发一种准确、快速的检测方法，对于净化蜂胶市场，加强对食品安全的监督和监控，尤为紧要。

近红外光谱分析技术因具有分析时间短、无需样品预处理、非破坏性、无污染以及成本低等特点，已成为一种快速的现代分析技术，广泛应用于农产品/食品领域的品质检测。国内外许多学者对其进行了深入的研究，并且从实验室的静态研究向在线检测研究方向发展。该法在中药材等天然药物含量测定方面已经取得了一定的成果，但是国内外均未见有关应用该技术对蜂胶进行定量分析的研究报道。

天然产物蜂胶，作为健康食品已被广泛的开发和应用，它是一个多组分的复杂体系，保证其产品质量的稳定均一对实现其现代化具有重要意义。因此，发展一种科学、有效、快速的复杂天然产物的质量检测方法就成为急需解决的难题之一。

发明内容

本发明旨在提供一种利用近红外区光谱快速检测蜂胶样品中主要黄酮类化合物含量的方法。本发明所建立的该方法包括如下步骤：

①收集蜂胶样品，选择足量有代表性的校正集样本，用HPLC法检测样品中黄酮类化合物含量；

②测定校正集样品的近红外光谱谱图，取光谱图的7500～4500cm^-1波段进行光谱预处理后，与HPLC法侧得的该样品的黄酮类化合物含量相关联，采用偏最小二乘法建立校正模型；

③测定待测蜂胶样品的近红外光谱谱图，采用与步骤②中相同的预处理方法处理所得谱图中7500～4500cm^-1波段，将预处理后得到的光谱调入步骤②的校正模型，得到待测蜂胶样品中黄酮类化合物含量。

步骤①中所述的蜂胶采集自国内三个主要产地是：辽宁、浙江、河南；为保证建立模型的准确性和抗干扰能力，建立校正模型的样品中目标组分的含量范围应能涵盖以后要分析样品中该组分的含量范围，本发明收集了国内三产地、不同季节的蜂胶原料，能充分的代表预测样品的全部背景信息。

本发明的检测中，所针对的目标产物是蜂胶中的主要黄酮类化合物，槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素。步骤①为了检测这些化合物在蜂胶中的含量而建立的HPLC检测方法包括如下条件：

色谱柱：DAISOPAK SP-120-5 ODS-AP(250mm×4.0mml.D)，

流动相：①体积比20％的甲酸-水溶液，②乙腈，

梯度洗脱：乙腈比例从30％经30min均速升至45％，再经30分钟均速升至75％，再经10分钟均速升至95％，保持10分钟，

检测波长：280nm；

进样量：10μl。

该HPLC检测的检测值即作为检测真值。

上述本发明的方法中，近红外光谱数据以漫透射的方式采集，将蜂胶样品甲醇溶液倒入石英液体池，液体池专用通道测量，进行样品的光谱采集，每个样品的光谱图都是由经32次扫描取平均而得。扫描的波谱范围为12,500cm^-1～4000cm^-1。所述用于近红外扫描的蜂胶样品甲醇溶液浓度为59mg/ml-61mg/ml。若浓度再高，会有不溶现象，若浓度过小模型建立的效果不好。

步骤②在谱图与数据关联前，需要对光谱采用合适的光谱预处理方法，以减轻或消除各种因素的干扰，所述的预处理方法选自下列方法中的一种或几种：多元散射校正(MSC)，减去一条直线(SLS)，最小最大标准化(MMN)，不进行预处理(NSAP)，常量补偿消除(COE)，向量标准化(VN)，一阶导数(FD)，二阶导数(SD)，一阶导数加减去一条直线(FD+SLS)，一阶导数加向量标准化(FD+VN)和一阶导数加多元散射校正(FD+MSC)。步骤③对待测蜂胶样品的近红外光谱谱图的预处理方法与步骤②中相同。

上述方法中的步骤②在进行光谱预处理之后，以交叉验证均方根差(RMSECV)和相关系数(R²)为指标，确定最佳PLS主成分数，选择最佳波段，最佳主成分数，平滑点数，运用化学计量学中的偏最小二乘法(PLS)建立近红外光谱多元校正模型；

本发明中步骤③所述测定的光谱和校正模型的适用性判据是：对预示集样品所建立的定量模型，进行内部交叉验证，以交叉验证误差均方根(RMSECV)为指标，确定最佳PLS主成分数，再以最佳主成分数及先前选取的最佳波段为参数建立最终模型；对验证集样品进行含量测定，由预测均方根误差(RMSEP)和相关系数平方(R²)来评价最终模型的优劣。针对同一组样品、同一组分，R²(应大于阈值70)越大，RMSECV越小，RMSECV决定预测样品的误差大小最为重要。运用Bruker OPUS/QUANT2定量分析软件中PLS法进行数据处理，其中50份样品作为预测样品机，用校正样品集进行内部交叉验证，槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素的RMSECV为0.0121，0.0417，0.913，0.236，1.12，0.214，R²为79.88，93.81，88.36，97.81，88.44，80.8；当由验证集样品评价PLS模型的检测能力时，RMSEP为0.0115，0.0378，0.819，0.217，1.01，0.914，R²为75.67，95.63，91.95，98.41，85.69，86.39。

本研究选取作为蜂胶质量评价标准的最有代表性的几种黄酮类化合物槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素为目标，分别建立定量模型，RMSECV较小，R²均大于阈值70，相关性良好。并对未知验证集样品进行预测，所得结果令人满意。说明应用近红外光谱技术结合适当的多元校正法(偏最小二乘法)可以同时对蜂胶中黄酮类化合物槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素进行定量分析，方法准确，比标准含量检测方法节省大量时间，可显著提高质量控制效率，缩短检测周期，为发展中药等天然药物实时分析技术开辟了一个新途径。

附图说明

本发明附图4幅：

图1是近红外光谱模型建立及应用过程；

图2是三产地蜂胶原料及标准品高效液相色谱图，

图2(A)是浙江蜂胶原料高效液相色谱图，

图2(B)是荆条蜂胶原料高效液相色谱图，

图2(C)是河南蜂胶原料高效液相色谱图，

图2(D)是几种主要黄酮类化合物标准品的高效液相色谱图，图中槲皮素、莰菲醇、乔松素、白杨素、高良姜素和球松素的出峰时间分别为：7.43min、11.27min、14.44min、27.48min、28.75min、55.04min；

图3是蜂胶原料的原始近红外光谱图；

图4是训练集样品的预测值与真值相关图。

具体实施方式

下面以实施例的方式对本发明所述的近红外光谱模型建立及应用过程作进一步说明，该实施例不应解释为对本发明的限制。

本发明所述的近红外光谱模型建立及应用过程如附图1，具体如下：

1、仪器条件和蜂胶样品的处理：

仪器：近红外光谱由德国Bruker公司MPA型近红外光谱仪采集，该仪器配有OPUS数据处理软件，样品转轮，透过单元，石英液体吸收池和光纤探头测样器-铟镓砷(InGaAs)检测器。每个样品的光谱图都是由经32次扫描取平均而得。扫描的波谱范围为12,500cm^-1～4000cm^-1。

样品：实验中所用的样品为直接于产地收集的蜂胶原料，考虑到蜂胶样品不同部位的成分差异性，在配制成溶液以前，来自同一区域的蜂胶样品被充分的粉碎，用甲醇溶解，0.45μm的滤膜(walkman，USA)过滤，制成浓度为60mg/ml的蜂胶甲醇溶液用于进红外光谱的扫描；将进行了用于扫描的蜂胶样品溶液甲醇稀释100倍进行HPLC分析。

2、HPLC检测方法包括如下条件：

色谱柱：DAISOPAK SP-120-5 ODS-AP(250mm×4.0mml.D)，

流动相：①体积比20％的甲酸-水溶液，②乙腈，

检测波长：280nm；

进样量：10μl。

该HPLC检测的检测值即作为检测真值。

对三产地蜂胶原料及标准品按照如上HPLC条件检测得到高效液相色谱图如图2，其中：

图2(A)是浙江蜂胶原料高效液相色谱图，

图2(B)是荆条蜂胶原料高效液相色谱图，

图2(C)是河南蜂胶原料高效液相色谱图，

图2(D)是几种主要黄酮类化合物标准品的高效液相色谱图，图中槲皮素、莰菲醇、乔松素、白杨素、高良姜素和球松素的出峰时间分别为：7.43min、11.27min、14.44min、27.48min、28.75min、55.04min。

3、测量：本实验使用的是石英液体吸收池，采用漫透射方式，将60±0.1mg/ml蜂胶样品甲醇溶液倒入液体池，进行样品的光谱采集，同一样品被扫描32次，据平均后得到最终的光谱图，如图3。

4、预测：图3所示为光谱的原始数据，从中可以看出，强度较大的吸收峰集中在4000cm^-1-7500cm^-1光谱范围内，但是实际上光谱中的吸收峰均为甲醇的贡献，因此在选择波数范围时要首先摒弃大于9000cm^-1无吸收的波段，去掉近端溶剂的强吸收波段4000cm^-1-4500cm^-1，然后再进一步通过各种光谱预处理方法对谱图进行优化，得到最佳吸收波段范围。偏最小二乘法(PLS)分别求出样品集光谱矩阵和样品组分矩阵的主成分矩阵，将这两个矩阵相关联，求其线形关系，用所建立的线形函数来预测未知样品，其中的最佳主成分数采用内部交叉检验来得出。在使用PLS法时，主成分数是预示集的评价参数，当RMSECV最小时，主成分数最佳。本研究中，所建立的槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素定量模型的最佳主成分数见表1。

表1 6个PLS定量模型各最佳建模参

其中：MSC：多元散射校正；SLS：减去一条直线；MMN：最小-最大归一化

5、分析：将70个样品分成两组，一组作为预示集，用于建立定量模型；另一组作为验证集，用于测试所建模型的适用性。为了避免由于样品分组不合理而导致的偏差，分组应遵循以下原则：所有样品将按照其各自的y值(即，由标准法测得的每个样品中各的黄酮含量)选取，使每个集合中尽量均匀的包含高、中、低y值的样品，并且预示集样品数与验证集样品数的比例应至少为3∶2，所选建模样品的含量范围要大于以后分析的范围，因此，本实验应用50个样品作为预示集，另外20个样品组成验证集。由表2所示，预示集样品的含量范围覆盖了验证集样品的含量范围，该分组结果较好。

表2标准品含量测定和校正集、验证集样品数

对预示集样品所建立的定量模型，进行内部交叉验证，以交叉验证误差均方根(RMSECV)为指标，确定最佳PLS主成分数，再以最佳主成分数及先前选取的最佳波段为参数建立最终模型，对验证集样品进行含量，由预测均方根误差(RMSEP)和相关系数平方(R²)来评价最终模型的优劣。针对同一组样品、同一组分，R²(应大于阈值70)越大，RMSECV越小，RMSECV决定预测样品的误差大小最为重要。交叉验证的过程如下，先除去预示集中一个样品，余下的样品组成预示集，再对先前除去的样品进行预测，重复此步骤，直至每一个样品都被检验分析。

图4为经PLS法交叉验证后预示集真值与NIR预测值相关图，从图中可以很直观的看出，并没有偏差较大的点出现，线性拟合良好。其中，槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素的RMSECV为0.0121，0.0417，0.913，0.236，1.12，0.214，R²为79.88，93.81，88.36，97.81，88.44，80.8；当由验证集样品评价PLS模型的检测能力时，RMSEP为0.0115，0.0378，0.819，0.217，1.01，0.914，R2为75.67，95.63，91.95，98.41，85.69，86.39。RMSECV较小，R²均大于阈值70，结果令人满意，表明应用近红外光谱技术结合偏最小二乘法能够对蜂胶中的此6种黄酮成分进行定量分析。

Claims

1.近红外光谱法检测蜂胶中黄酮类化合物含量的方法，包括如下步骤：

①收集蜂胶样品，选择足量有代表性的校正集样本，用HPLC法检测样品中黄酮类化合物含量；其中：

所述的黄酮类化合物是槲皮素、乔松素、球松素、白杨素、莰菲醇和高良姜素；

所述的HPLC检测条件为：

色谱柱：DAISOPAK SP-120-5ODS-AP，250mm×4.0mml.D，

流动相：①体积比20%的甲酸-水溶液，②乙腈，

梯度洗脱：乙腈比例从30%经30min均速升至45%，再经30分钟均速升至75%，再经10分钟均速升至95%，保持10分钟，

检测波长：280nm；

进样量：10μl；

②测定校正集样品的近红外光谱谱图，取光谱图的12500～4000cm^-1波段进行光谱预处理后，与HPLC法侧得的该样品的黄酮类化合物含量相关联，采用偏最小二乘法建立校正模型；

③测定待测蜂胶样品的近红外光谱谱图，采用与步骤②中相同的预处理方法处理所得谱图中12500～4000cm^-1波段，将预处理后得到的光谱调入步骤②的校正模型，得到待测蜂胶样品中黄酮类化合物含量；

其中所述待测蜂胶样品以甲醇为溶剂配制成浓度为59～61mg/ml的溶液后用于近红外扫描；

所述的近红外光谱谱图的测定方法是使用Bruker公司MPA型傅立叶变换近红外光谱仪，采用漫反射方式，液体池专用通道测量，每个样品经32次扫描取平均而得。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的近红外光谱谱图的预处理方法选自下列方法中的一种或几种：多元散射校正，减去一条直线，最小最大标准化，不进行预处理，常量补偿消除，向量标准化，一阶导数，二阶导数，一阶导数加减去一条直线，一阶导数加向量标准化和一阶导数加多元散射校正。