CN110231305A - 一种测定奇亚籽中dpph自由基清除能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定奇亚籽中DPPH自由基清除能力的方法，属于抗氧化能力检测领域。本发明方法以DPPH法测定样品中实际DPPH自由基清除能力作为参考值，同时以特定的光谱采集方法扫描样品，确定主成分数，选择光谱预处理方法，基于偏最小二乘法，构建光谱信息和参考值之间的校正模型。利用已建立的校正模型便可以快速得到各成分的含量信息，且通过内部交叉验证法验证已建立的模型具有较高的预测精确度。本发明方法适用于奇亚籽中DPPH自由基清除能力的定量分析，方法准确，省时高效。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定奇亚籽中DPPH自由基清除能力的方法，属于抗氧化能力检测领域。
背景技术
奇亚籽(Chia seed)原产于墨西哥南部和一些北美洲地区，是薄荷类植物芡欧鼠尾草(Salvia Hispanica L.)的种子，由于芡欧鼠尾草适应在墨西哥及北美洲地区海拔约1200m的高原荒漠地区生长，且国内并没有此物种的繁殖地，目前国内市场上的奇亚籽均依赖于进口，样品收集不易。
人体中的自由基与许多疾病的生成发展有密切关系，人们利用人工合成的抗氧化剂来清除体内的自由基和治疗疾病。而奇亚籽除了普通维生素E、维生素C抗氧化剂以外，还富含具有很强抗氧化能力的酚类和黄酮类物质，如迷迭香酸、原儿茶酸乙酯、杨梅素、槲皮素和山奈酚等。奇亚籽具有高抗氧化作用，如抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、神经保护等多种活性功能，也广泛应用于医药、食品、化妆品等方面。
鉴定天然产物中抗氧化物质含量高低对抗衰老药物的研究开发上具有重要作用。DPPH(2,2.二苯基-1-苦肼基自由基)分析法是一种筛选自由基清除剂的简便方法，用分光光度法对自由基清除程度进行定量分析。是一种较为传统的用以评价实验样品抗氧化能力的方法。该方法费时费力，需注重细节，以保证实验数据的准确性。所以寻求一种快速、有效、无损的检测方法对奇亚籽DPPH自由基清除能力的测定具有重要的现实意义。
近红外光谱(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是基于可见光和中红外光谱之间的一段光谱，波长范围为780nm-2526nm，属于分子振动光谱，是含氢基团(C-H、N-H、O-H)振动的倍频与合频吸收，是获取含氢基团特征信息的一种有效载体。随着化学计量学的加入，近红外光谱技术在农产品等食品检测中有着较多的应用，它的特点是：检测成本低，快速，无损害待检测样品，可实现在线检测，是一种成熟的食品品质分析技术。这为将该技术用于奇亚籽DPPH自由基清除能力实时分析和监控成为一种可能。
目前已有利用近红外光谱检测DPPH自由基清除能力的报道，比如山东大学的李采怿(基于近红外光谱的生药醇提取物抗氧化性预测，光谱学与光谱分析)偏最小二乘算法，计算预测了37种生药药材甲醇提取物的抗氧化活性，并采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)法进行了验证，选择5775-6102cm-1处为建模谱区；然而，该方法虽然可以较为准确的测定茶叶中的DPPH自由基清除能力，但是由于物质环境不同，与DPPH自由基清除能力相关的吸收波段差异较大，利用该方法中的波段数据无法建立准确的线性校正模型。此外，丁晓晓(色谱法和近红外光谱法结合化学计量学用于一些食品及中草药的质量分析，南昌大学)选择了6个特征变量分别为700nm、772nm、912nm、1528nm、1950nm和2400nm建立总抗氧化能力(DPPH法)模型，模型较好，可用于实际样品的粗测；然而，该方法并未明确光谱数据如何构建校正模型，且该方法中的波段同样也无法有效、准确的预测奇亚籽中DPPH自由基清除能力。因此，开发一种快速、有效、无损且准确的奇亚籽DPPH自由基清除能力检测方法是十分重要的。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有奇亚籽中DPPH自由基清除能力在分析过程中费时费力，检测周期长，样品破坏性测试，效果不佳的缺点，提供一种基于近红外光谱的奇亚籽中DPPH自由基清除能力准确的建模方法和简便快速的检测方法，以评价奇亚籽的质量，用于奇亚籽贸易品质的鉴别。
按照近红光谱产生的原理，奇亚籽中富含的抗氧化物质在近红外光谱区有特征的吸收光谱，以表征目标品质浓度特征，预处理后的光谱与实际测得的DPPH自由基清除能力参考值相关联，采用偏最小二乘法建立校正模型，这样就可以通过扫描奇亚籽的近红外光谱图，将相同预处理后的光谱调入校正模型，得到奇亚籽中准确的DPPH自由基清除能力。
本发明的第一个目的是提供一种测定奇亚籽DPPH自由基清除能力的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在4000-10000cm-1全光谱谱区范围内漫反射扫描奇亚籽样品，得到近红外光谱图；
(2)在所得近红外光谱图中选取特定波段范围，对特定波段范围内的光谱信息进行预处理，得到峰强度值；所述预处理的方式包括多元散射校正(MSC)、标准正态变化(SNV)、一阶导数(1st)、二阶导数(2nd)、SG平滑和ND平滑中的一种或者多种；所述特定波段范围包括4000-10000cm-1、4000-6000cm-1、6500-6900cm-1、4000-6900cm-1中的一种或多种。
(3)DPPH法测定奇亚籽样品中DPPH自由基清除能力作为参考值，并利用偏最小二乘法，与步骤(2)得到的峰强度值建立校正模型；
(4)待测样品经步骤(1)、(2)得到峰强度值，根据步骤(3)中的校正模型，计算得到待测样品中的DPPH自由基清除能力。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中特定波段范围优选4000-6900cm-1、4000-6000cm-1、6500-6900cm-1中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中特定波段范围进一步优选4000-6900cm-1，或者4000-6000cm-1、6500-6900cm-1的组合。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中特定波段范围进一步优选4000-6900cm-1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)是将奇亚籽样品置于样品杯中，在谱区范围内漫反射扫描，分辨率4-16cm-1，扫描次数16-64次，增益4-8倍，得到近红外光谱。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)是将奇亚籽样品置于样品杯中，在谱区范围内漫反射扫描，分辨率8cm-1，扫描次数32次，增益8倍，得到近红外光谱。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中预处理的方式优选SG平滑，或者多元散射校正和SG平滑的组合，或者多元散射校正。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中预处理的方式进一步优选SG平滑。
在本发明的一种实施方式中，所述预处理中采用MSC去除近红外漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪声和光谱的不重复性；采用一阶导数和/或二阶导数消除基线和提高分辨率、减少噪声干扰；采用SG平滑和/或ND平滑提高有效信息的信噪比。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中以偏最小二乘法建立校正模型，结合主成分分析对光谱信息进行降维压缩。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中以偏最小二乘法建立校正模型的主成分数为10。
本发明的第二个目的是将上述检测方法应用于检测奇亚籽抗氧化能力能力中。
本发明的第三个目的是将上述检测方法应用于奇亚籽贸易品质监测领域中。
本发明的有益效果是：
本发明首次将近红外光谱结合化学计量学方法引入奇亚籽DPPH自由基清除能力的无损检测，用于奇亚籽中DPPH自由基清除能力的定量分析，方法准确，省时高效，可以为天然产物抗氧化活性的快速评测提供参考。
本发明与传统化学分析方法相比，检测速度快，不损坏样品，全程测定过程无需一分钟，是一种便捷方便、绿色环保的检测方法。
本发明方法将近红外光谱技术引入到奇亚籽数据库模型的搭建可以实现在线实时检测奇亚籽在贸易过程中DPPH自由基清除能力的变化，对确保奇亚籽贸易品质的稳定性是十分有意义的。
本发明以抗氧化性预测为代表，近红外光谱分析技术可以较为准确地预测、评价奇亚籽的相应生物学活性，对进一步的深入研究和推广应用具有重要意义。
附图说明
图1是奇亚籽中DPPH自由基清除能力模型建立的流程图；
图2是奇亚籽的原始近红外光谱图；
图3是RMSECV随主成分数的变化图；
图4是校正集样品的预测值与参考值的相关图；
图5是验证集样品的预测值与参考值的相关图；
图6是样品内部交叉验证的结果图。
具体实施方式
下面以实施例的方式对本发明所述的近红外光谱模型建立及应用过程进一步说明，该实施例不应解释为对本发明的限制。
本发明所述的近红外光谱模型建立及应用过程如图1，具体如下：
1.代表性样品的收集及分类：
根据奇亚籽的生长环境和生长周期特点，分别收集各个奇亚籽主产地的样品，样品量达到103份，包括墨西哥、澳大利亚、阿根廷、玻利维亚、厄瓜多尔、尼加拉瓜、秘鲁等地区，收集周期大于二年(奇亚为薄荷类一年生植物)，多批次采集，收集种类包含黑奇亚籽和白奇亚籽两种类型。将样品分为校正样品集和验证样品集，每集涵盖各个地区、批次和颜色种类的奇亚籽，有效地拓展样品数据的范围。样品进行光谱采集的同时立即测定奇亚籽中DPPH自由基清除能力，建立奇亚籽样品DPPH自由基清除能力数据库。
2.仪器条件及样品光谱的采集：
仪器：近红外光谱由购自Thermo Fisher科技(中国)有限公司的Antaris II近红外分析仪扫描收集，该仪器配有光谱采集软件为RESULT-Integration；建模软件为TQAnalyst，均为Thermo Fisher科技(中国)有限公司开发。同时，配有InGaAs检测器。
样品光谱的采集：在25℃±2℃的条件下对待测奇亚籽样品进行近红外光谱谱图的采集，称取25g籽粒于标准样品杯中，在选取的谱区范围内用漫反射的方式扫描奇亚籽样品的近红外光谱，分辨率8cm-1，扫描次数32次，增益8×，同一样品倒出样品杯，重新装杯，如此扫描三次及以上，取平均光谱作为该样品的标准光谱。
3.参考值数据的测定：
DPPH法：奇亚籽磨粉后过60目筛，加入20倍重量比的75％乙醇振摇120分钟，离心移取上清液，再次重复提取，提取液定容至100mL中。移取稀释后提取液及75％乙醇各0.5mL，加入4mL DPPH甲醇溶液，混匀避光，静置30min，测得此时的吸光值。同时建立水溶性维生素E(Trolox)标准曲线。每个样品检测三次，取平均值。奇亚籽的DPPH自由基清除能力表示为1g奇亚籽样品中所含Trolox的当量微摩尔数(μmol Trolox/g)。
4.样品集划分：
将103个样品分成两组，一组为校正集，用于建立定量模型；另一组作为验证集，用于检验模型的准确性和稳定性。为了避免由于样品分组不合理而导致的偏差，子集选择如下进行：对于每5个样本，随机选择4个作为校正集，而剩余样本用作预测集。因此，本实验应用82个作为校正集，另外21个组成验证集。由表1所示，校正集样品的含量范围涵盖了验证集样品的含量范围，说明该分组结果较好。
表1校正集与验证集的样品数及含量
| 样品集 | 含量单位 | 样品数 | 含量范围 | 平均含量 | 标准偏差 |
| 校正集 | μmol Trolox/g | 82 | 8.35-15.37 | 11.63 | 2.3 |
| 验证集 | μmol Trolox/g | 21 | 8.90-14.34 | 11.72 | 2.2 |
5.建立校正模型：
利用建模软件对光谱进行预处理，提取并放大表达奇亚籽抗氧化物质的特征光谱信息。光谱预处理方法包括：为去除近红外漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪声，消除漫反射的基线及光谱的不重复性采用MSC；为消除基线和提高分辨率采用了一阶导数和二阶导数，为减少噪声干扰；提高有效信息的信噪比采用SG平滑和ND平滑。同时结合主成分分析对光谱信息进行降维压缩，以偏最小二乘法建立校正模型。
6.内部交叉验证：
规定所有样品为校正集样品，采用留一法对模型进行内部交叉验证，即留下一份样品作为待预测样品，其余样品参与建模预测这一份样品的DPPH自由基清除能力，如此循环反复测得103份预测值与实际DPPH自由基清除能力值的关系图，以相关系数RCV和交叉验证均方根误差(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)评估模型。
7.进行样品预测：
在稳定的环境条件下，近红外分析仪中的卤钨灯光源发出光辐射，照射在奇亚籽样品上，漫反射出来的光被积分球收集，通过检测器将近红外光谱转化为数字信号传输到计算机，再用已建立和验证的校正模型对数字信号进行分析，从而得到奇亚籽中DPPH自由基清除能力的数据。
实施例1：奇亚籽DPPH自由基清除能力校正模型的构建
(1)在25℃±2℃的条件下对待测奇亚籽样品(分为校正集与验证集)进行近红外光谱谱图的采集，称取25g籽粒于标准样品杯中，在4000-10000cm-1谱区范围内用漫反射的方式扫描奇亚籽样品的近红外光谱，分辨率8cm-1，扫描次数32次，增益8×，同一样品倒出样品杯，重新装杯，如此扫描三次及以上，取平均光谱作为该样品的标准光谱；
(2)选取对标准光谱中4000-6900cm-1谱区范围内的光谱信息进行预处理，所述预处理方式为SG平滑；
(3)奇亚籽样品测定奇亚籽中的DPPH自由基清除能力，得到样品实际DPPH自由基清除能力值；提取4000-6900cm-1全波区间建立偏最小二乘法建立校正模型，得到预测值与实际DPPH自由基清除能力的线性模型(PLS建模)；PLS建模中R为0.8961，RMSEC和RMSEP分别为0.82、0.77，相对分析误差RPD为3.0，预处理方法较好模型具有较高的预测精确度，可用于实际样品的定量测定。图4和5分别是校正集和验证集样品的预测值与实际DPPH自由基清除能力的相关图，其中，校正集和验证集的相关系数分别为0.8335和0.8961，均方根误差分别为0.82和0.77。
实施例2：奇亚籽DPPH自由基清除能力校正模型的验证
设所有样品为校正集样品，采用留一法对模型进行内部交叉验证，即留下一份样品作为待预测样品，其余样品参与建模预测这一份样品DPPH自由基清除能力，如此循环反复测得103份预测值，以相关系数RCV和RMSECV评估模型。
图6为用上述交叉验证后的校正集参考值(化学法测定样品DPPH自由基清除能力)与NIR预测值相关图，从图中可以很直观的看出，并没有较大偏离拟合直线的点，线性拟合良好。其中，RCV为0.8411，RMSECV为0.79。RMSECV较小，RCV大于0.8，表明应用近红外光谱技术结合偏最小二乘法能够对奇亚籽中DPPH自由基清除能力进行定量分析。
实施例3：光谱预处理方式对PLS建模的影响
参考实施例1，将步骤(2)中的预处理方式替换为如表2所示的预处理方式，其他条件不变，进行PLS建模。
表2选用不同预处理方法的奇亚籽DPPH自由基清除能力PLS建模结果
其中：Raw：原始光谱；1st：一阶导数；2nd：二阶导数；MSC：多元散射校正；SNV：标准正态变化；ND平滑：Norris derivative fiter；SG平滑：Savitzky-Golay filter；主成份因子数均为各预处理方式下匹配的最优参数条件。
通过各种光谱预处理方法对谱图进行优化，分析软件自动选择波数范围和主成分数，结果由相关系数R和均方根误差(RMSEC和RMSEP)来评价模型的优劣，R(Rp大于阈值0.7)越大，RMSEC和RMSEP越小，相对分析误差(RPD)越大，则该预处理方法较好；其中，判断模型是否适用于实际检验，相对分析误差(RPD)是重要的指标：RPD是标准差与均方根误差的比值，用于证明模型的预测能力。RPD数值差异较小，0.1之差可能是因为所收集的样品分布和范围差异的代表性较差，也可能因为模型数据处理方式选择不佳，导致参考值和预测值的线性拟合较差，均方根误差较大，0.1之差表示了完全不同的准确性结果；当RPD≥3时，说明效果良好，所建模型可以用于实际检测；如果RPD<3，说明检测欠佳，精度有待于提高。具体结果如表2所示，最佳预处理方法为SG平滑，PLS建模中R为0.8961，RMSEC和RMSEP分别为0.82、0.77，RPD为3.0，RPD不低于3，说明模型具有一定的预测精确度，可用于实际样品的定量粗测。
实施例4：不同预处理波段对奇亚籽DPPH自由基清除能力PLS建模影响
参考实施例1，选用最佳预处理方式SG平滑，将步骤(2)中的波段替换为如表3所示的波数范围，其他条件不变，进行PLS建模。
表3选用不同波段范围下奇亚籽DPPH自由基清除能力PLS建模结果
选用4000-10000cm-1全波数区间建立偏最小二乘法建立校正模型，得到预测值与实际DPPH自由基清除能力的线性模型；PLS建模中R为0.8783，RPD小于3且大于2.5，表明全波数下模型准确性欠佳，但仍可以用于DPPH自由基清除能力的粗测。综合考虑表2和表3，特定波数4000-6900cm-1下，R为0.8961，RMSEC和RMSEP分别为0.82、0.77，RPD为3.0，而在预处理方法较好模型具有更高的预测精确度，更有助于实际样品的准确定量测定。
此外，在使用PLS建模时，主成分数也是校正模型的评价参数之一，当均方根误差(RMSECV)随着主成分数的增加而减少直至几乎稳定时，得到最佳主成分数为10(见图3)，此时贡献率达97％。
Claims (10)
1.一种测定奇亚籽中DPPH自由基清除能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在4000-10000cm-1全光谱谱区范围内漫反射扫描奇亚籽样品，得到近红外光谱图；
(2)在所得近红外光谱图中选取特定波段范围，对特定波段范围内的光谱信息进行预处理，得到峰强度值；所述预处理的方式包括多元散射校正(MSC)、标准正态变化、一阶导数、二阶导数、SG平滑和ND平滑中的一种或者多种；所述特定波段范围包括4000-10000cm-1、4000-6900cm-1、4000-6000cm-1、6500-6900cm-1中的一种或多种；
(3)DPPH法测定奇亚籽样品中DPPH自由基清除能力作为参考值，并基于偏最小二乘法，与步骤(2)得到的峰强度值建立校正模型；
(4)待测奇亚籽样品经步骤(1)、(2)得到峰强度值，根据步骤(3)中的校正模型，计算得到待测样品样品中的DPPH自由基清除能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中特定波段范围为4000-6900cm-1、4000-6000cm-1、6500-6900cm-1中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中特定波段范围为4000-6900cm-1，或者为4000-6000cm-1、6500-6900cm-1的组合。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中预处理的方式为SG平滑，多元散射校正中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中预处理的方式为SG平滑。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是将奇亚籽样品置于样品杯中，在全光谱谱区范围内漫反射扫描，分辨率4-16cm-1，扫描次数16-64次，增益4-8倍，得到近红外光谱。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是将奇亚籽样品置于样品杯中，在全光谱谱区范围内漫反射扫描，分辨率8cm-1，扫描次数32次，增益8倍，得到近红外光谱。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，采用留一法验证校正模型的稳定性与可靠性。
9.权利要求1-8任一所述的方法在检测奇亚籽抗氧化能力中的应用。
10.权利要求1-8任一所述的方法在奇亚籽贸易品质监测领域中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190913 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |