CN101887018B - 一种非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法，该方法以傅立叶变换近红外漫反射光谱技术为基础，采用消除固体颗粒不均匀性最好的积分球漫反射方式进行光谱扫描，以多种基因型的花生饱满种子为标准样品集建立多元回归数学模型，通过模型预测未知样品的主要脂肪酸含量。本发明方法是非破坏性的，不需要对样品进行任何预处理，不伤害种子活力和组织结构。本发明的方法操作简单，灵敏度高，扫描速度快，信噪比好，测定速度快，适用于花生高油酸品质育种、种质资源鉴定和遗传规律研究。

Description

一种非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法

技术领域

本发明涉及花生种子品质成分的定量分析技术领域，具体是指一种应用傅立叶变换近红外光谱分析技术、结合现代化学计量方法的非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法。

背景技术

近年来，花生的育种目标已从产量为主转向了以产量和品质并重，特别是注重了对人类心脑血管疾病有防治作用的高油酸含量和高白藜芦醇含量的选育研究。选育高油酸含量(O/L值高)的花生新品种是花生品质育种的最主要目标之一。为改良花生的品质，除要求能简便快捷处理大量样品外，所采用的品质检测技术必须是非破坏性的，常规的化学方法无法满足上述要求。以往花生品种育种的内在品质测试均需常规化学方法，需要磨碎部分样品，因此品质育种早期世代无法进行选择。所以，在育种技术上迫切需要研究出适合早期世代选择的简便经济的品质检测技术。

20世纪90年代后，由于傅立叶近红外光谱技术的应用，使得近红外的应用领域有了很大的扩展。由于傅立叶技术比传统的光栅技术具有灵敏度高、分辨率高、波长准确度和精确度高、扫描速度快、信噪比好等显著优点，已经有使用近红外光谱技术非破坏性测定花生单粒种子品质的报道。

但直接针对决定花生品质的重要指标——脂肪酸的含量进行非破坏性测定的报道尚未见到，由于花生种子颗粒较大且不均匀，使用近红外光谱技术测定脂肪酸的含量需要对现有技术作更多的改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于现有技术中的傅立叶变换近红外漫反射光谱技术的测量方法，该方法采用积分球漫反射方式进行光谱扫描，通过PLS算法的预测数学模型对花生中主要脂肪酸含量进行非破坏性分析。该方法操作简单、灵敏度高、扫描速度快、测定准确性高。

本发明的技术方案为：一种非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：

第一步选择有代表性的花生种子作为建立主要脂肪酸预测数学模型的标准样品集；

第二步采用MPA型傅立叶变换近红外光谱仪，使用漫反射大体积镀金积分球作为光谱采集手段，测定标准样品集中的花生种子的漫反射光谱；

第三步按照常规化学方法，进行标准样品集中的花生种子主要脂肪酸含量的测定，所得值即为与第二步漫反射光谱对应的化学值；

第四步采用偏最小二乘法(PLS)的化学计量学方法建立数学模型，使用内部交叉证实对模型进行验证，比较样品预测值与化学值的决定系数(R²)和均方差(RMSECV)，选取R²尽可能大而RMSECV尽可能小的组合，R²和RMSECV按照以下公式计算：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{M}\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}$ $R^2=(1-\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{\mathrm{\Σ}{(y_i-y_m)}^2})$

其中：Differ_i表示第i个样品的化学值和交叉证实预测值之差，M为样品数，y_i为第i个样品的化学值，y_m为M个样品交叉预测值的平均值；交叉证实预测值是每次交叉剔除1个或几个样品(由实验者确定)，用其他样品建模预测被剔除的样品所获得的值；

第五步按照第二步的方法采集待测样品的近红外光谱信息，将光谱输入预测模型，确定待测样品的主要脂肪酸含量。

所述第一步中选择有代表性的花生种子，其步骤为首先对至少150份以上的不同类型花生品种的饱满种子进行近红外扫描，获得这些种子的近红外光谱，随后采用重心法和网格法选取有代表性的花生种子，作为建立主要脂肪酸预测数学模型的标准样品集。

所述第二步采用MPA型傅立叶变换近红外光谱仪测定漫反射光谱时，花生种子装入光谱仪的石英样品杯中，其体积需大于石英样品杯的四分之三，并混匀样品，使花生种子间空隙尽量小。

所述第二步中测定标准样品集中花生种子的漫反射光谱，扫描谱区范围为4000-12500cm^-1。

所述第四步中建立预测数学模型的最优谱区范围是9997-4242cm^-1。

所述第四步中建立预测数学模型的光谱处理方式是一阶导数加多元散射校正技术。

所述脂肪酸是油酸或亚油酸或棕榈酸或硬脂酸。

在第四步建立预测数学模型中上述的脂肪酸如油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸最佳的主成分维数分别是10，9，6，9。

本发明的原理是，以傅立叶变换近红外漫反射技术为基础，结合现代化学计量方法，采用漫反射测定方式，以多种基因型的花生品种作为样品背景，通过化学计量学方法，采用偏最小二乘法建立数学模型，再由模型测定未知样品的主要脂肪酸的含量。

本发明适用于以提高花生重要脂肪酸含量为目的的品质育种研究，可用于分离早期世代花生种子重要脂肪酸含量的非破坏性检测，也适用于花生种质资源鉴定和遗传规律研究。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果

1、本发明是一种非破坏性的分析方法，是以完整的花生种子为测定对象，样品不需要任何预处理就可以快速检测出其主要脂肪酸的含量，对种子的活力和组织结构无任何损伤。

2、本发明方法操作简单、灵敏度高、扫描速度快、信噪比好、测定成本低、测定速度快，可在短期内处理大量样品，特别适用于花生高油酸育种早期世代的筛选。

3、本发明方法的测定准确性较高，可满足花生高油酸育种的要求。

附图说明

图1是本发明实施例中的花生种子的近红外漫反射光谱图；

图2是本发明实施例中花生种子的油酸含量交叉验证相关图；

图3是本发明实施例中花生种子的亚油酸含量交叉验证相关图；

图4是本发明实施例中花生种子的棕榈酸含量交叉验证相关图；

图5是本发明实施例中花生种子的硬脂酸含量交叉验证相关图。

具体实施方式

本发明的非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法，包括如下步骤：

第一步  选择花生种子的标准样品集

为了建立主要脂肪酸预测数学模型，需要选择花生种子的标准样品集，样品的数量不能少于150份。本实施例中选择具有不同基因型的花生品种作为建模的标准样品集，其中选择了山东省花生研究所保存的地方品种、稳定的突变体及育成的品种共计331份，这些材料都是花生的成熟饱满种子，其中普通型51份，龙生型13份，多粒型19份，珍珠豆型116份，中间型132份。对这331份花生材料进行近红外扫描，获得其近红外光谱，然后采用重心法和网格法选取有代表性的60份材料，作为建立主要脂肪酸预测数学模型的标准样品集。将选定作为标准样品集的花生材料在60-65℃下恒温烘干6个小时，使含水量小于8％，密闭备用。本发明所说的样品代表性是指样品遗传背景的多样化、时间(年份和季节)和空间(产地来源)分布的多样性。样品集代表性的好坏对预测模型的稳定性、适应性有很大影响。

第二步  测定标准样品集中花生种子的近红外漫反射光谱

采用MPA型傅立叶变换近红外光谱仪(德国布鲁克光谱仪器公司制造)，使用漫反射大体积镀金积分球作为光谱采集手段，采样窗口直径2cm，高灵敏度的PbS检测器，扫描谱区范围4000-12500cm^-1，扫描次数为64次，分辨率为8cm^-1。采用旋转样品台以增加采样面积，样品杯为5cm内径，旋转后实际采集光谱的样品面积为18.84cm^-1。将花生种子直接倒入光谱仪的石英样品杯中，装入的体积应不少于样品杯体积的四分之三，约30-50粒，混匀样品，使花生种子间空隙尽量小。测定时样品杯自动旋转，以获得较多种子的近红外光谱信息。积分球直径为10cm，大体积积分球可以对大颗粒样品漫反射谱进行平均，以得到好的光谱重现性。

通常在4000-12500cm^-1谱区内，花生种子的近红外漫反射光谱有独特的吸收特征，见图1。花生种子中丰富的油脂类和蛋白质含有大量的C-H、O-H、N-H基团，在4000-5300cm^-1的合频区形成强烈的吸收；在5300-7000cm^-1的一倍频区也有较为强烈的吸收；在7000-12500cm^-1的高倍频区吸收相对较弱。鲜明的漫反射光谱吸收特征为含油量的定量分析提供了丰富的信息基础。

第三步  标准样品集中花生种子的主要脂肪酸含量化学值的测定

将第一步选取的60份标准样品集中的花生种子按常规化学方法测定其主要的脂肪酸含量，可参照GB10219-88方法来测定，由农业部食品质量监督检验测试中心(济南)完成该步骤的测定。

第四步  花生种子的主要脂肪酸含量预测数学模型的建立和优化

采用偏最小二乘法(PLS)的化学计量学方法建立数学模型，使用内部交叉证实对模型进行验证，即是每次交叉剔除1个或几个样品(由实验者确定)，用其他样品建模预测被剔除的样品，依次进行，并通过比较样品预测值与化学值的决定系数(R²)和均方差(RMSECV)，选取R²尽可能大而RMSECV尽可能小的组合，R²和RMSECV按照以下公式计算：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{M}\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}$ $R^2=(1-\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{\mathrm{\Σ}{(y_i-y_m)}^2})$

其中：Difier_i表示第i个样品的化学值和交叉证实预测值之差，M为样品数，y_i为第i个样品的化学值，y_m为M个样品交叉预测值的平均值。

本实施例采用布鲁克光谱仪器公司OPUS软件的自动优化功能，根据RMSECV最小的原则，选择出最佳的分析谱区，最好的光谱预处理方式，以及最佳的主成分维数的模型参数组合。经反复测试比较，获得脂肪酸的信息广泛分布在9997-4242cm^-1的范围，并且最好的光谱处理方式是一阶导数加多元散射校正技术，对油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸最佳的主成分维数分别是10、9、6、9。

第五步模型预测效果分析

采用内部交叉证实对预测数学模型进行验证。内部交叉证实是指依次剔除建模样品集中一个或多个样品，用剩余样品来建模预测被剔除样品的含量，比较被剔除样品预测值与化学值的差异，由此判断所建模型的预测准确性。图2、3、4、5是四种脂肪酸的交叉验证预测结果。油酸含量交叉验证预测结果的主要参数R²为98.74％，RMSECV为1.87，含量范围为38-84.4％；亚油酸含量交叉验证预测结果的主要参数R²为98.97％，RMSECV为1.5，含量范围为2.3-43.1％；棕榈酸含量交叉验证预测结果的主要参数R²为96.02％，RMSECV为0.52，含量范围为5.3-13.1％；硬脂酸含量交叉验证预测结果的主要参数R²为73.91％，RMSECV为0.37，含量范围为2.1-6.5％。

经效果验证分析后，如果所建模型的预测准确性达到要求，则可进入下一步骤，如果没有达到要求，则继续进行优化调整参数直到达到要求。

第六步应用模型测定未知样品

建立好预测数学模型之后，就可以测定未知样品的主要脂肪酸含量。重复第二步采集未知样品的近红外光谱，将光谱输入预测模型，计算机立即给出未知样品主要脂肪酸的含量。

Claims (1)

1.一种非破坏性测定花生种子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步首先对至少150份以上的不同基因型花生品种的饱满种子进行近红外扫描，获得其近红外光谱，然后采用重心法和网格法选定有代表性的花生材料，作为建立主要脂肪酸预测数学模型的标准样品集，将选定作为标准样品集的花生材料在60-65℃下恒温烘干6个小时，使含水量小于8％，密闭备用；

第二步采用MPA型傅立叶变换近红外光谱仪，使用漫反射大体积镀金积分球作为光谱采集手段，采样窗口直径2cm，高灵敏度的PbS检测器，扫描谱区范围4000-12500cm^-1，扫描次数为64次，分辨率为8cm^-1，采用旋转样品台以增加采样面积，样品杯为5cm内径，旋转后实际采集光谱的样品面积为18.84cm^-1，将花生种子装入光谱仪的石英样品杯中，其体积需大于石英样品杯体积的四分之三，并混合均匀，使花生种子间空隙尽量小；

第三步按照常规化学方法，进行标准样品集的花生种子主要脂肪酸含量的测定，所得值即为第二步中漫反射光谱对应的化学值；

第四步采用偏最小二乘法的化学计量学方法建立主要脂肪酸预测数学模型，使用内部交叉证实对模型进行验证，比较样品预测值与化学值的决定系数R²和均方差RMSECV，选取R²尽可能大而RMSECV尽可能小的组合，R²和RMSECV按照以下公式计算：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{M}\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}$ $R^2=(1-\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{\mathrm{\Σ}{(y_i-y_m)}^2})$

其中：Differ_i表示第i个样品的化学值和交叉证实预测值之差，M为样品数，y_i为第i个样品的化学值，y_m为M个样品交叉预测值的平均值；建立预测数学模型的谱区范围是9997-4242cm^-1，采用一阶导数加多元散射校正技术作为光谱处理方法；

第五步按照第二步的方法采集待测样品的近红外光谱信息，将光谱输入预测模型，确定待测样品的主要脂肪酸含量，所述主要脂肪酸指油酸或亚油酸或棕榈酸或硬脂酸。

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