CN102175620A

CN102175620A - 近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法

Info

Publication number: CN102175620A
Application number: CN 201010605718
Authority: CN
Inventors: 铁双贵; 岳润清; 齐建双; 王延召; 朱卫红; 卢彩霞
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2010-12-27
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明涉及一种近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法。该方法包括光谱测试、异常值的剔除和分析模型的建立等步骤。本发明方法不需要预处理便可以快速、无破损的测定赖氨酸含量，特别适用于优质蛋白玉米育种过程中低世代材料赖氨酸含量的测定；本发明方法与染料结合法(DBL法)、茚三酮显色法和氨基酸分析仪法测定的赖氨酸含量测定结果对进行比较，验证了近红外光谱测定玉米，特别适用于优质蛋白玉米育种过程中低世代材料中赖氨酸的方法的可行性，该方法快速、可靠及实用，对以后的优质蛋白玉米育种过程中赖氨酸含量的测定方法选择有一定的参考价值。

Description

近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种分析测试方法，具体涉及一种采用近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法。

背景技术

赖氨酸是人和动物体内需要而自身不能合成的的8种必需氨基酸中的1种，缺乏这种氨基酸就会造成机体代谢紊乱，引发某些生理机能性疾病。赖氨酸在大多数谷物中含量不高或缺乏，被称为第一限制性氨基酸。提高谷物籽粒中赖氨酸含量成为育种的主要方向之一。因此谷物籽粒中赖氨酸含量的测定就需要有快速、简便、准确的适合低世代材料筛选的测定方法。优质蛋白玉米自1963年，美国Mertz等人发现o₂基因可以显著提高玉米籽粒的赖氨酸含量；1969年，Paze等发现胚乳修饰基因可以把o₂玉米的软质胚乳变成不同程度的硬质胚乳，赖氨酸含量几乎不变，这两大发现以来就掀起了育种的研究热潮。但是30多年来，玉米籽粒中赖氨酸含量的测定费用昂贵、技术繁琐且适应不了低世代材料的筛选一直是限制优质蛋白玉米育种的一个重要因素。

在优质蛋白玉米育种过程中，需要对亲代和子代的材料进行赖氨酸分析，对一些种子少的低世代材料，赖氨酸的分析所用种子量当然是越少越好。因此，选用哪种赖氨酸测定方法，能够用较少样品对大批量的玉米材料进行简便、快速、经济、准确的籽粒赖氨酸含量测定是一个急需解决的问题。目前，我国的育种单位对优质蛋白玉米籽粒中赖氨酸的测定方法主要有4种：染料结合法(DBL法)、茚三酮显色法、近红外光谱分析法(NILS)和氨基酸分析仪法，其中前两种是化学分析法，后两种是仪器分析法。其中，化学分析法测定过程复杂、费用很高且非常费时；氨基酸分析仪法，由于氨基酸分析仪国内不能生产，进口仪器昂贵，仅有少数专门的品质分析单位才有，所以这种方法测量赖氨酸含量在优质蛋白玉米育种中并没有广泛应用；而近红外光谱分析法可进行不需要预处理便可以快速、无破损的测定赖氨酸含量，但是要想准确快速的进行测定，需要建立起准确可靠的近红外分析模型。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种采用近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法，该方法可快速、准确的对玉米中赖氨酸进行无损测定。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

首先需要选择一批具有代表性的样品，用该批样品建立样品近红外光谱与化学值之间的定标模型，然后用该定标模型去预测得到未知样品的组分含量。

一种近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)样品化学值测定、光谱采集：选择一批具有代表性的玉米样品，分析各样品的赖氨酸含量的化学值，并扫描采集各样品的近红外光谱；

(2)异常值的剔除：光谱和化学值异常值(outlier)检验分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这两个统计量，影响值的计算公式为：

Leverage＝z_i ^T(Z^T Z)^-1

其中Z为主成分分析的得分阵，z_i为第i样本的得分值，影响值的阈值设为样本平均影响值的2倍，大于阈值意味着该光谱异常，化学值绝对误差的阈值设为样本集平均误差的3倍，大于该值意味着该样本化学值异常；用PCR算法和全交叉证实法对光谱进行计算，检验剔除异常值结果；

(3)定标模型的建立：用PLS1算法建立赖氨酸含量的近红外分析模型，分析波长范围为7430～7416、6840～5385和4936～4476cm^-1；预处理方法为13点平滑、一阶导数和SNV+Detrend；校正集用交叉—证实方法确定主成分的维数为4。

影响建立定标模型合理性的主要因素有：①参与定标样品的代表性，定标集样品应尽量覆盖待分析样品的变化范围，分布应尽量均匀，因此，需要收集足够多的样品；②化学分析数据的准确性在很大程度上决定了近红外分析的准确性，因此参与定标样品的比学分析方法必须是权威和标准的，以保证结果的准确性；③近红外光谱的处理方式和定标技术要合适和最佳化。

在所述步骤(1)中，扫描采集各样品的近红外光谱时，采用漫反射积分球附件，扫描范围为10000～4000cm^-1，扫描次数为33次，分辨率为8cm^-1，标准陶瓷片作为参比。

在所述步骤(2)中，Leverage的阈值设定为3.56，化学值误差的阈值设定为0.285。

本发明具有积极有益的效果：

1.本发明方法不需要预处理便可以快速、无破损的测定赖氨酸含量，特别适用于优质蛋白玉米育种过程中低世代材料赖氨酸含量的测定。

2.以本发明建立起的近红外定标模型快速测定玉米中赖氨酸的含量是可行的。

附图说明

图1为玉米样品的近红外漫反射光谱；

图2为赖氨酸含量的化学值与预测值的相关关系图，(●)校正集，(▲)检验集。

具体实施方式

实施例1 一种近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)样品化学值测定、光谱采集：选择38个具有代表性的玉米样品，分析各样品的赖氨酸含量的化学值，并扫描采集各样品的近红外光谱，采用漫反射积分球附件，扫描范围为10000～4000cm^-1，扫描次数为33次，分辨率为8cm^-1，标准陶瓷片作为参比；测定的近红外漫反射光谱，如图1所示；

Leverage＝z_i ^T(Z^T Z)^-1

其中z为主成分分析的得分阵，z_i为第i样本的得分值，影响值的阈值设为样本平均影响值的2倍，大于阈值意味着该光谱异常，化学值绝对误差的阈值设为样本集平均误差的3倍，大于该值意味着该样本化学值异常，Leverage的阈值设定为3.56，化学值误差的阈值设定为0.285，用PCR算法和全交叉证实法对光谱进行计算，检验剔除异常值结果；22、31号样品为光谱异常，这2个样品不适合用来建模，因此予以剔除，在本模型中实际采用的样品只有36个。

(3)定标模型的建立：用PLS1算法建立赖氨酸含量的近红外分析模型，分析波长范围为7430～7416、6840～5385和4936～4476cm^-1；预处理方法为13点平滑、一阶导数和SNV+Detrend；校正集用交叉一证实方法确定主成分的最佳维数为4；校正集的赖氨酸含量NIR分析模型测定系数R为0.977，RSD＝2.2％；检验集R为0.842，RSD＝5.4％，校正集和检验集样品中赖氨酸含量的预测值与化学值间的相关关系如图2所示。

实施例2 分析模型验证

(1)样品处理

试验一：将郑单2501和郑单2503样品分别混合均匀，随机取出4份，900g/份，分别用4种方法测定赖氨酸含量。

试验二：将工业L-Lysine按照郑单2503样品(过100目筛)质量的0.1％和0.2％添加，充分混匀，以不添加L-Lysine的郑单2503样品为对照，共计3个处理，每个处理设置3次重复。分别用茚三酮显色法和染料结合法测定赖氨酸含量。

(2)赖氨酸测定方法

染料结合法：在农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)进行。其中试验一由检验测试中心的工作人员完成；试验二添加工业L-Lysine试验由本研究室的实验人员与检验测试中心的工作人员共同完成。

茚三酮显色法：按照李合生主编的《植物生理生化试验原理与技术》操作步骤进行，试验在河南农科院油料作物实验室由本研究室的实验人员完成。

近红外光谱分析法：在国家玉米改良中心郑州分中心实验室进行，使用德国Bruker公司生产的MATRIX-I型近红外光谱分析按实施例1中建立的模型方法进行。

氨基酸分析仪法：由农业部谷物品质监督检验测试中心(北京)，使用Biochrom20氨基酸分析仪进行测定。

四种方法测定赖氨酸含量测定结果见表1。

表1 四种方法测定赖氨酸含量测定结果

在4种赖氨酸含量测定方法中，茚三酮显色法测得得赖氨酸含量最高。原因是茚三酮不但能与赖氨酸生成紫红色物质，而且可以与其它游离氨基酸生成二酮茚氨取代盐等蓝紫色化合物，赖氨酸含量的计算是通过比色测得的吸光度与亮氨酸的标准曲线作比较得到的，所以测得的赖氨酸含量中还包括了少量其它游离氨基酸，较实际赖氨酸含量偏高。但是由试验二可以看出，茚三酮显色法测定赖氨酸含量的趋势还是比较准确的，添加工业赖氨酸的混合样品，赖氨酸含量的增加值基本与添加量相当。并且茚三酮显色法操作相对比较简单，常用做学生实验测量谷物种子的赖氨酸含量。

染料结合法是国家规定的赖氨酸含量测定方法，其原理是在pH＝2左右缓冲体系中，样品蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、组氨酸、精氨酸)可与偶氮磺酸染料酸性橙12等摩尔结合，生成不溶性络合物，其染料结合量(摩尔数)相当于此三种碱性氨基酸的总和。另取一份样品，先用丙酰酐将蛋白质中赖氨酸的ε-氨基掩蔽(丙酰化作用)，使之失去与染料结合的能力，然后再与染料反应，所得染料结合量只是组氨酸和精氨酸之和。根据染料结合量的差值，便可计算出该样品中的赖氨酸含量。因此在试验二的3个处理中，赖氨酸含量几乎没有差异，有两种可能情况：(1)在第一份样品中工业L-Lysine不与染料结合；(2)在第二份样品中丙酰化作用不能将工业赖氨酸的ε-氨基掩蔽。另外，两个试验中对于同一个样品郑单2503组合，在不同的时间、同样的环境中由同一个技术人员同样采用染料结合法，测得的赖氨酸含量有较大差异，分别是0.38％和0.34％。

氨基酸分析仪法，由于氨基酸分析仪国内不能生产，进口仪器昂贵，仅有少数专门的品质分析单位才有，所以这种方法测量赖氨酸含量在优质蛋白玉米育种中并没有广泛应用。

近红外光谱分析仪法，这种分析技术是20世纪80年代后期发展起来的一项新兴的测试技术，在欧美等国，这种分析技术已成为谷物品质分析的重要手段。其最大优点是不需要预处理便可以快速、无破损的测定赖氨酸含量。特别适用于优质蛋白玉米育种过程中低世代材料赖氨酸含量的测定。经过20年来大量的研究，近红外光谱分析技术发展很快，虽然目前还存在各种不足，但随着研究的不断深入，模型的进一步校正，存在的问题都将会得到解决。而以上其它3种方法，均需要一系列的预处理，更遗憾的是将样品破坏，被测定的样品已经不能被利用。因此，严重影响优质蛋白玉米育种效率。所以可以快速、无破损测定赖氨酸含量的近红外光谱分析仪法在以后的优质蛋白玉米育种中必将有广阔的应用前景。

Claims

1.一种近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法，包括以下步骤：

(2)异常值剔除：光谱和化学值异常值检验分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这两个统计量，光谱影响值的计算公式为：

Leverage＝z_i ^T(Z^T Z)^-1

式中Z为主成分分析的得分阵，z_i为第i个样本的得分值，影响值的阈值设为样本平均影响值的2倍，大于阈值意味着该光谱异常，化学值绝对误差的阈值设为样本集平均误差的3倍，大于该值意味着该样本化学值异常；用PCR算法和全交叉证实法对光谱进行计算，检验剔除异常值；

2.根据权利要求1所述近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，扫描采集各样品的近红外光谱时，采用漫反射积分球附件，扫描范围为10000～4000cm^-1，扫描次数为33次，分辨率为8cm^-1，标准陶瓷片作为参比。

3.根据权利要求1所述近红外光谱测定玉米中赖氨酸的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，Leverage的阈值设定为3.56，化学值误差的阈值设定为0.285。