CN104849232B - 一种快速检测蜂王浆水分和蛋白质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测蜂王浆水分和蛋白质含量的方法，1)用现有方法测定蜂王浆样品水分和蛋白质含量；2)建立蜂王浆样品的中红外光谱数据库：用傅里叶变换中红外光谱仪对蜂王浆样品进行扫描，每个样品扫描3次，取平均值；3)光谱预处理方法以及最优建模波段的选择；4)通过最优参数建立水分和蛋白质的定量模型。本发明提供的方法操作简单、成本较低，在保证鉴别准确率的前提下，可以快速的对蜂王浆中水分和蛋白质的含量进行可靠的预测。

Description

一种快速检测蜂王浆水分和蛋白质含量的方法

技术领域

本发明涉及蜂王浆品质的快速检测方法，具体地，是利用蜂王浆中红外光谱与蜂王浆水分和蛋白质之间的数学模型对水分和蛋白质的含量进行测定的方法。

背景技术

蜂王浆(Royal Jelly)又名蜂皇浆，蜂皇乳等，是蜂群中工蜂的舌腺以及上颚腺等腺体分泌的具有复杂化学成分的乳状物质，是供给将要变成蜂王的幼虫的食物，也是蜂王终身的食物。国内外大量的研究表明，蜂王浆中含有丰富的活性物质，是适宜人类的天然保健食品，具有抗菌消炎、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、调节血压血脂等作用。

蜂王浆中水分和蛋白质的含量都是评价其品质的重要指标，蛋白质又是影响蜂王浆生物活性的主要物质之一。经研究表明，蜂王浆中水分的含量大约占60％～70％，蛋白质的含量大约在10％～18％。由于蛋白质很容易受到环境的影响而变性降解，因此也可以根据蜂王浆中蛋白质含量的变化对蜂王浆的新鲜度进行评价监控。

目前，测定蜂王浆中水分的方法主要采用的是传统的减压干燥法如中华人民共和国国家标准GB9697-2008。

测定蜂王浆中蛋白质的测量方法主要是中华人民共和国国家标准GB9697-2008的凯氏定氮法，在进行蛋白质含量的测定时使用的是全自动凯氏定氮仪。

上述方法在测定蛋白质含量前需要使用高浓度的酸和高温对样品进行消化，并需要配置大量的溶液，复杂的操作过程不仅会增加了检测人员的工作量还会降低了实验结果的准确性。

到目前为止，还尚未找到一种能够快速测定蜂王浆中水分和蛋白质含量的方法。因此，本领域迫切需要提供一种能够简单、快速、有效测定蜂王浆中水分和蛋白质含量的新方法。

中红外光谱(mid-infrared spectroscopy)与近红外光谱一样，都是近些年快速发展起来的一种光谱技术，可以提供有机分子的分子振动信息。中红外光谱的波长范围是600～4000cm^-1，所检测到的主要是含氢基团X-H振动强烈基频吸收，比近红外的检测限的要好1～2个数量级，同时信息量相对较大并且谱峰重叠没有近红外区严重，所以能表达样品更加丰富的信息，更适合做物质的定量分析。目前，中红外光谱技术已经广泛应用到了各个领域，其中包括药物、医学、食品等进行物质成分含量测定。但是，在蜂王浆的品质测定中，还尚未得到有效的应用。水分和蛋白质的物质结构主要包括O-H、N-H和C-H，因此从理论上讲，中红外光谱技术也可以用于蜂王浆中水分和蛋白质含量的分析。

目前还没有将中红外光谱技术应用于蜂王浆水分和蛋白质含量的检测的文献，本方法是蜂王浆水分和蛋白质含量的预测中的首次应用。

发明内容

为了解决蜂王浆水分和蛋白质含量检测方法操作复杂、耗时、耗力的缺点，本发明提供了一种利用中红外光谱技术与偏最小二乘原理相结合的快速测定蜂王浆水分和蛋白质含量方法。

本发明的第一目的是提供一种建立蜂王浆水分和蛋白质定量模型的方法，该方法包括以下步骤：

1)用现有方法测定蜂王浆样品水分和蛋白质含量；

2)建立蜂王浆样品的中红外光谱数据库：用傅里叶变换中红外光谱仪对蜂王浆样品进行扫描，每个样品扫描3次，取平均值；

3)光谱预处理方法以及最优建模波段的选择；

4)通过最优参数建立水分和蛋白质的定量模型。

上述方法中：

所述步骤1)中：

现有方法为国家标准GB9697-2008的减压干燥法和凯氏定氮法测定水分和蛋白质含量。

步骤2)中红外光谱数据库的建立方法中：中红外光谱的扫描范围是600～4000cm^-1，分辨率为4cm^-1，扫描次数为32次。

所述步骤3)的具体步骤为：将蜂王浆的中红外光谱图和水分、蛋白质含量导入光谱处理软件中，利用偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法建立水分和蛋白质含量的预测模型，根据模型的性能指数选择出最佳的光谱预处理方法和最佳的光谱建模波段。

优选地，该方法包括以下步骤：

1)样品水分和蛋白质含量测定：蜂王浆的样品直接从蜂场采集而来，放在冰箱中进行保存，实验前将蜂王浆解冻并回复至室温，搅拌均匀后，根据国家标准GB9697-2008进行蜂王浆水分和蛋白质含量的测定；

2)样品光谱数据库建立：设置中红外光谱仪的检测参数，扫描范围为600～4000cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次，对步骤1)解冻并回复至室温的蜂王浆样品进行光谱扫描，每个样本进行多次光谱采集，取平均光谱作为单个样品的光谱，建立样品光谱数据库；

3)鉴别模型建立：将步骤1)所得的样品的水分和蛋白质含量以及步骤2)所得的光谱数据导入OPUS 6.5数据处理软件中，利用偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法建立水分和蛋白质含量的预测模型，根据模型的性能指数选择出最佳的光谱预处理方法和最佳的光谱建模波段；

4)模型性能的检验：将样本随机分成校正集和检验集，使用最佳的光谱预处理方法和最佳的光谱波段对校正集和检验集分别进行模型的建立与预测，检验模型的性能。

上述方法：

步骤2)中：

在光谱采集前，将样品搅拌均匀，首先进行以空气为背景的背景扫描，降低环境因素对样品采集的影响，背景扫描一般间隔30min一次；

步骤3)中的模型如下：

Y＝X〃b

其依据的是偏最小二乘原理和留一法交叉检验法，模型的原理如下：

偏最小二乘法是根据m个(x₁，x₂，x₃，….x_m)自变量与p个(y₁，y₂，y₃….y_p)因变量的关系所建立的，这里X和Y关于检验函数b相关；

其中Y是蜂王浆的水分和蛋白质含量值为Y；

矩阵X是指为蜂王浆样品的中红外光谱图；

b的确定，首先在自变量中集中提取第一成分t₁(x₁，x₂，x₃….x_m)的线性组合，且尽可能多地提取原自变量集中的变异信息，在偏最小二乘法进行主成分提取时，由计算机自动提取所有建模集样本中对回归模型贡献最大的一部分进行降维压缩，作为其建模的第一主成分。

同时，在因变量集中也提取第一成分u₁，并且要求t₁与u₁的相关程度达到最大，然后建立因变量y₁，….y_p与t₁的回归，如果方程已经达到满意的精度，则运算停止。

否则继续进行第二成分的提取，知道达到满意的精度为止。若最终对自变量集提取了r个成分t₁，t₂，…t_r，偏最小二乘回归将通过建立y₁，…，y_p与t₁，…，t_r的回归式，然后在表示为y₁，…，y_p与原自变量的回归方程式：

软件通过计算出未知值b，来建立定量模型。

步骤4)模型性能的检验原理如下：

先利用校正集的样品建立回归分析模型，得到偏最小二乘回归系数r,RMSEE和RPD，然后再把所得到的方程用于检验集样本，得到回归方程在检验集样本点集合的相关系数r，RMSEP和RPD。模型的性能由相关系数r，RMSEP和RPD决定，r值越接近1，RMSEP的值越小，RPD的值大于2.5，模型的准确度就会越高。

在模型建立的过程中还采用留一法交叉检验对自身的进行准确率的检验，其原理如下：

留一交叉检验：在模型建立之前从这n样品中取出一个样品，利用剩下的n-1个样品进行建模，用这一个样品进行进行模型的检验。之后分别取出第2，3，4，5，……，n个样品，重复此操作，用于计算模型的准确率。

本发明采用的偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法的光谱预处理方法分别为：减去一条直线，一阶导数，二阶导数，多元散射矫正和消除常数偏移量中的一种或两种组合。

本发明提供的蜂王浆水分和含量快速的测定方法，优点如下：

1、本发明建立的模型：蜂王浆水分和蛋白质含量的测定方法主要是传统的方法，不仅操作步骤复杂，耗时较长，因此影响实验的准确率的因素比较多，有些步骤还具有一定的危险性。因此，需要发明一种可以对蜂王浆中水分和蛋白质含量进行快速测定的方法。中红外光谱灵敏度较高，无需任何样品前处理，是近年来发展十分快速的一种检测技术。在进行光谱测量时，每个实验样品进行多次扫描，而且30min进行一次背景光谱的扫描，可以有效的减小实验的随机误差；在光谱的扫描过程中将光谱图中峰形有明显差异的剔除掉，将每个样品的平均化光谱图作为原始光谱。

2、对步骤的分解：

检测原理是当红外光照射到有机分子时，分子的化学键或官能团可以发生振动吸收，不同的化学键或官能团吸收的红外光的频率不同，在红外光谱上将体现出吸收峰的位置和强度不同。在选择建模的最优光谱范围时，要根据物质结构对光谱波段进行有针对性的筛选。水分和蛋白质的物质主要的基团是CH，NH和HO，根据这些基团中红外光谱的特征进行光谱范围的选择。对步骤分解如下：

对采集的中红外光谱进行预处理：中红外光谱可以反映物质的化学组成与浓度，同时也受到物质的粘度、粒度、表面纹理、密度等物理性质的影响。因此，在建立定量模型需要消除这些特性对结果的影响。

本实验主要采用4种光谱预处理方法，分别是减去一条直线，一阶导数，二阶导数，多元散射矫正和消除常数偏移量中的一种或两种组合。其作用是可以有效的消除光谱的基线的平移和漂移，分辨重叠峰，滤除光谱中受粒度影响的信号，有效的消除背景噪声及特定的物理因素的干扰；

最后，对模型进行了光谱波段的选择，因为水分和蛋白质的物质结构存在很大差异所以在进行波段的选择时，根据基团的特征振动进行波段的筛选，去除一些信息量小、噪声影响较大的谱区，达到压缩光谱的信息量，提高模型的预测准确性的目的。最终根据模型一系列的性能指数，优化出最佳的光谱建模波段。

3、本发明提供的方法中：

1)无需样品前处理，操作简单：对于生产厂商，无需任何样品前处理可以再包装之前直接进行中红外光谱的采集，只需要一滴样品即可。随着便携式中红外光谱仪的研制，可以实现对蜂王浆进行原产地的品质监测，不受环境限制。

2)快速无损：中红外光谱的采集时间和模型的计算时间非常短，可以随即测定随即收到结果；无需前处理，可以实现对样品的无损检测。

3)多种组分同时测定分析。只进行一次中红外光谱的采集就可以同时对蜂王浆中水分和蛋白质含量进行预测。

4)本发明为实现蜂王浆新鲜度的实时监测提供了快速、简捷、廉价的技术基础。

4、本发明提供的方法操作简单、成本较低，在保证鉴别准确率的前提下，可以快速的对蜂王浆中水分和蛋白质的含量进行可靠的预测。

附图说明

图1是本发明的方法步骤(2)中所得到的蜂王浆中红外原始光谱图。

图2-A、2-B、2-C、2-D是本发明的方法步骤(4)中建立鉴别模型时所得到的蜂王浆中红外光谱与水分和蛋白质含量校正集和检验集的相关曲线图，其中图2-A为校正集中蜂王浆中红外光谱对水分含量的拟合值和真值相关性的曲线图，图2-B为校正集所建立的模型对检验集中蜂王浆水分含量预测值和真值的相关性的曲线图，图2-C校正集中蜂王浆中红外光谱对蛋白质含量的拟合值和真值的相关性曲线图，图2-D为校正集所建立的模型对检验集中蜂王浆的蛋白质含量的预测值和真值的相关性曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：蜂王浆水分和蛋白质含量快速测定方法的建立

1、样品水分和蛋白质含量的测定从蜂场直接采集的蜂胶样品共51个。蜂王浆中水分和蛋白质含量的测定按照国家标准GB9697-2008(蜂王浆中水分含量的测定方法-减压干燥法；蛋白质含量的测定-凯氏定氮法)的方法进行。其中：

蜂王浆中水分含量的测定方法为：

取蜂王浆试样越0.5g，置于已经干燥至恒量的称量瓶中，精密称定，摊平，放入加压干燥箱，在温度75℃，压力-0.095MPa～-0.10MPa(-730mmHg～-760mmHg)下干燥4h后取出称量瓶，置干燥器中，冷却30min后称量，反复干燥直至前后两次质量差不超过2mg，为恒量，此法要求低压、恒温，耗时较长并且需要反复称量直至恒重；

蜂王浆中蛋白质含量的测定为：

1)消化：取蜂王浆试样约0.05置已称定的滤纸上，精密称定后包好，放入消解管中，加入硫酸铜与硫酸钾混合试剂0.5(硫酸铜与硫酸钾的重量比为1:3)，再沿瓶壁缓缓加入浓硫酸(浓度为95～98％)3.5mL，充分混合，在瓶口放一小漏斗，使烧瓶成45°斜置，放在消化仪上，420℃高温消化4h。

将消化管自然冷却至室温，然后放置到全自动凯氏定氮仪进行蛋白质含量的测定。

2)全自动凯氏定氮仪的溶液配制：

氢氧化钠水溶液：称取氢氧化钠40g，加入蒸馏水稀释至100mL；

硼酸缓冲液：称取硼酸10g，加入蒸馏水1000mL；将7mL的甲基红与10mL的溴甲酚绿混匀，加入到硼酸溶液中。

盐酸溶液：准确称取浓盐酸9mL,加入蒸馏水稀释至1000mL，摇匀备用。使用前，再将盐酸溶液准确稀释10倍。

3)计算：蜂王浆中蛋白质含量按下式计算：

其中：

X₃蜂王浆中蛋白质的含量，以质量分数表示，％；

V₁为滴定试样时，0.01mol/L盐酸标准溶液消耗的体积，单位为毫升(mL)；

V₀为滴定空白时，0.01mol/L盐酸标准溶液消耗的体积，单位为毫升(mL)；

C₁为盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；

0.014为氮的毫摩尔质量，单位为克(g)；

m₄为样品的质量，单位为克(g)；

6.25为氮换算为蛋白质的系数。

2、样本的中红外光谱的采集在光谱采集前，将样品搅拌均匀，首先进行以空气为背景的背景扫描，降低环境因素对样品采集的影响，背景扫描一般间隔30min一次；

然后用傅里叶变换中红外光谱仪对每个蜂王浆样品进行扫描，每个样品扫描3次，取平均值。仪器的检测参数：扫描范围为600～4000cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次。样本的中红外原始光谱图如图1。

3、光谱预处理和光谱波段的选择将通过上面方法得到的蜂王浆的中红外光谱图和水分、蛋白质含量导入光谱处理软件即OPUS 6.5数据处理软件中，采用偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法对光谱进行预处理，即采用如下方法：减去一条直线，一阶导数，二阶导数，多元散射矫正和消除常数偏移量中的一种或两种组合，最后进行光谱波段的选择，根据性能指数，筛选出最佳的光谱波段。

4、最优模型的建立与检验

模型性能的检验原理如下：

先利用校正集的样品建立回归分析模型，得到偏最小二乘回归模型的性能参数r(相关系数)、RMSEE(校正集的标准误差)和RPD_c(校正集标准差均值之比)，然后再把所得到的方程用于检验集样本，得到回归方程在检验集样本点集合的性能指数r(相关系数)，RMSEP(检验集的标准误差)和RPD_v(检验集标准差均值之比)。模型的性能由相关系数r、RMSEE、RMSEP,和RPD决定，r值越接近1，RMSEE和RMSEP的值越小，RPD的值大于2.5，模型的准确度就会越高。

在模型建立的过程中还采用留一法交叉检验对自身的进行准确率的检验，其原理如下：

留一交叉检验：在模型建立之前从这n样品中取出一个样品，利用剩下的n-1个样品进行建模，用这一个样品进行进行模型的检验。之后分别取出第2，3，4，5，……，n个样品，重复此操作，用于计算模型的准确率。

将51个蜂胶样本随机分为校正集和检验集，其中校正集36个样品，检验集15个样品。

下表中为水分和蛋白质模型的主要的性能指标：r为模型的相关系数，r越接近1，表示模型的准确度越高；RMSEE和RMSEP为模型的校正集和检验集的样品标准差，RPD_c和RPD_v分别为检验集和预测集的标准差均值之比，一般大于2.5即可作为标准预测。

表1蜂王浆水分和蛋白质含量的最佳建模结果

所建立的最佳模型结果如表1所示，水分和蛋白质校正集相关系数R分别为0.9901和0.9613；RMSEE分别为0.224和0.171；RPD分别为7.14和3.63；由校正集模型的性能参数可以看出，中红外光谱与蜂王浆中的水分和蛋白质含量有很高的相关性。将检验集的样品参数分别带入到模型对模型的准确性进行检测，水分和蛋白质检验集的相关系数r分别为0.9787和0.9552；RMSEP分别为0.275和0.181；RPD分别为7.27和3.37；水分和蛋白质校正集与检验集之间的准偏差分别为-0.092和-0.0216，非常接近于0。

结果说明：本发明所建立的模型能够准确的预测蜂王浆中水分和蛋白质的含量。

图2A-2D为校正集与检验集的蜂王浆中红外光谱与水分和蛋白质含量校正集和检验集的相关曲线图，由图可以直观看出蜂王浆水分和蛋白质的含量均匀的分布在直线两侧，相关性良好。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种快速检测蜂王浆水分和蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：

1)样品水分和蛋白质含量测定：蜂王浆的样品直接从蜂场采集而来，放在冰箱中进行保存，实验前将蜂王浆解冻并回复至室温，搅拌均匀后，根据国家标准GB9697-2008进行蜂王浆水分和蛋白质含量的测定；

2)样品光谱数据库建立：设置中红外光谱仪的检测参数，扫描范围为600～4000cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次，对步骤1)解冻并回复至室温的蜂王浆样品进行光谱扫描，每个样本进行3次光谱采集，取平均光谱作为单个样品的光谱，建立样品光谱数据库；

3)鉴别模型建立：将步骤1)所得的样品的水分和蛋白质含量以及步骤2)所得的光谱数据导入OPUS 6.5数据处理软件中，利用偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法建立水分和蛋白质含量的预测模型，根据模型的性能指数选择出最佳的光谱预处理方法和最佳的光谱建模波段；

其中，水分含量测定选择矢量归一化法结合3992cm^-1-3652cm^-1、2974cm^-1-2295cm^-1、1616cm^-1-1276cm^-1三种波段建立的模型；

蛋白质测定选用剪去一条直线预处理结合3992cm^-1-3652cm^-1、3313cm^-1-2974cm^-1、1955cm^-1-937cm^-1三种波段建立的模型；

4)模型性能的检验：将样本随机分成校正集和检验集，使用最佳的光谱预处理方法和最佳的光谱波段对校正集和检验集分别进行模型的建立与预测，检验模型的性能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中：在光谱采集前，将样品搅拌均匀，首先进行以空气为背景的背景扫描，降低环境因素对样品采集的影响，背景扫描间隔30min一次。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中的模型如下：

Y＝X·b，

其中：

Y是蜂王浆的水分和蛋白质含量值为Y；

矩阵X是指为蜂王浆样品的中红外光谱图；

b的确定，首先在自变量中集中提取第一成分t₁(x₁，x₂，x₃….x_m)的线性组合，且尽可能多地提取原自变量集中的变异信息，在偏最小二乘法进行主成分提取时，由计算机自动提取所有建模集样本中对回归模型贡献最大的一部分进行降维压缩，作为其建模的第一主成分。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，先利用校正集的样品建立回归分析模型，得到偏最小二乘回归系数r，RMSEE和RPD，然后再把所得到的方程用于检验集样本，得到回归方程在检验集样本点集合的相关系数r，RMSEP和RPD，模型的性能由相关系数r，RMSEP和RPD决定，r值越接近1，RMSEP的值越小，RPD的值大于2.5，模型的准确度就会越高。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，先利用校正集的样品建立回归分析模型，得到偏最小二乘回归系数r，RMSEE和RPD，然后再把所得到的方程用于检验集样本，得到回归方程在检验集样本点集合的相关系数r，RMSEP和RPD，模型的性能由相关系数r，RMSEP和RPD决定，r值越接近1，RMSEP的值越小，RPD的值大于2.5，模型的准确度就会越高。

6.根据权利要求1、2或5所述的方法，其特征在于，偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法的光谱预处理方法分别采用：减去一条直线，一阶导数，二阶导数，多元散射矫正和消除常数偏移量中的一种或两种组合。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法的光谱预处理方法分别采用：减去一条直线，一阶导数，二阶导数，多元散射矫正和消除常数偏移量中的一种或两种组合。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，偏最小二乘回归分析原理和留一交叉检验法的光谱预处理方法分别采用：减去一条直线，一阶导数，二阶导数，多元散射矫正和消除常数偏移量中的一种或两种组合。