CN104020128B - 一种快速鉴别蜂胶胶源的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速鉴别蜂胶胶源的方法，该方法将近红外光谱的指纹特征谱图与化学计量学相结合，从而实现简便快速地鉴别蜂胶品种来源，具有操作简单、快速、环保、低成本等优点。

Description

一种快速鉴别蜂胶胶源的方法

技术领域

本发明涉及一种快速鉴别蜂胶胶源的方法，属于化学检验技术领域，具体来说，属于食品快速检测技术领域。

背景技术

蜂胶（bee propolis）来自于蜂巢和蜂箱内，是蜜蜂从植物幼芽和树干处采集的树胶、并混入自身的分泌物、蜂蜡及花粉加工而成的粘性物质。大量研究表明，蜂胶含有多种黄酮类化合物、有机酸、多种氨基酸、微量元素，具有抗菌、消炎、止痒、镇痛、促进组织再生、降血脂、降胆固醇等作用，是一种天然药物，越来越被人们所认识和利用，蜂胶已经成为养蜂生产的重要产品之一。

我国胶源植物资源较为丰富且分布广泛，各地地理环境、气候条件等条件也各异，各种因素综合作用下，不同胶源品种不同产地的蜂胶都存在一定的差异，以蜂胶色泽为例，其因采集树种、季节和保存年份不同而各异。因此在原料收购时需考虑这些差异因素对蜂胶作出正确质量评价。蜂胶的名称不像花粉、花蜜这样具有很强的植物特征、但也是来源于植物，因此蜂胶的化学成分与植物来源有不可分割的联系。研究蜂胶的植物来源可为蜂胶的化学成分研究，蜂胶的标准化研究提供依据。

据文献报道，目前常用液相色谱法和紫外分光光度法测定蜂胶中黄酮类化合物、酚类化合物含量。现有技术的检测方法中，一般局限于对蜂胶中某一特定成分（例如特定种类黄酮）的检测，且检测过程耗时良久、成本高昂，目前尚无能够简便快速鉴别蜂胶胶源的有效方法。因此，本领域迫切需要提供一种能够简单、快速、有效鉴别蜂胶胶源的方法。

近红外光谱（NIR）技术结合化学计量学是近年来较常用于鉴别天然产物的有效方法，具有快速、无损、灵敏等优点。近红外光谱是波长在780nm～2526nm(波数为4000-12000cm^-1)的电磁波，分子在近红外区域的吸收主要由含氢基团Ｘ－Ｈ（Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ）振动的倍频和合频吸收组成，可以反映出大多数有机物组成和分子结构的大量信息。不同物质有其特异的红外吸收光谱，其谱带的数目、位置、形状和强度均随化合物及其聚集态的不同而不同。

然而，由于近红外区的吸收强度低、谱带复杂、重叠严重，直接用于天然产物鉴别仍存在较大困难，从肉眼上不能有效识别，因此，将近红外光谱用于直接检测仍然存在一定的局限性。

本申请发明人在实践中通过大量研究发现，借助于化学计量学中的多元统计分析、曲线拟合等方法将红外光谱中所包含的信息提取出来，排除各种干扰之后，可以有效地用于鉴别天然产物，而不会具有上述局限。

发明内容

本发明提供了一种快速鉴别蜂胶胶源的有效方法，具体是将近红外光谱的指纹特征谱图与化学计量学相结合，从而实现简便快速地鉴别蜂胶品种来源。

本发明中各胶源蜂胶样品分别来自全国各个不同蜂场，产地差异不可避免，但本发明旨在鉴别胶源品种。本发明中蜂胶根据蜜蜂采集胶源植物的不同，分为四大类:桦树蜂胶（指蜜蜂采集桦树树脂形成的蜂胶）、杨树蜂胶（指蜜蜂采集杨树树脂形成的蜂胶），橡胶蜂胶（指蜜蜂采集橡胶树树脂的蜂胶）、桉树蜂胶（指蜜蜂采集桉树树脂形成的蜂胶）。不同胶源蜂胶中的化学成分不同，其功效也有差异。例如桦树蜂胶中含有与桦树幼芽内一致的黄酮类化合物等，以含有乙酰氧基-α-桦木烯醇为主要特征。杨树蜂胶含有与杨树腋芽树脂内含物一致的黄酮类化合物等，以白杨素、杨芽黄素、高良姜素、乔松素等为主要特征。

本发明提供的鉴别蜂胶胶源的方法包括如下步骤：

（1）建立蜂胶样品库；

（2）建立蜂胶样品光谱数据库；

（3）建立鉴别模型；

（4）预测待测蜂胶胶源品种。

其中，优选地，所述的步骤（1）建立样品库的步骤具体如下：从全国蜂胶主产区的蜂场采集蜂胶产品，胶源分别来自不同品种。每种胶源品种至少采集7个蜂胶样品，将来自不同胶源的蜂胶品种进行标识。

更优选地，所述的步骤（1）建立蜂胶样品库的步骤具体如下：从全国蜂胶主产区的蜂场采集蜂胶产品，胶源分别来自不同胶源品种；每种胶源品种至少采集7个蜂胶样品，每个样品至少0.5kg，塑料袋装，分析前室温放置；将来自不同胶源的蜂胶品种类别以1，2，3….的数字形式进行标识。

其中，所述的步骤（2）建立样品光谱数据库的步骤具体如下：利用近红外光谱仪固体光纤探头对步骤1的蜂胶样品进行光谱扫描：先以空气为背景进行扫描，然后对待测样本进行扫描，每个样本扫描3次，取平均光谱作为单个样品的光谱，建立样品光谱数据库。采集过程中，近红外光谱仪的检测参数为：扫描范围为4000～12500cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次。

其中，所述近红外光谱波长在780nm～2526nm(波数为4000-12000cm^-1)之间。

在本发明的一个实施例中，使用Bruker公司MPA傅立叶变换近红外光谱仪2mm光程固体光纤探头对每个蜂胶样品进行扫描。

其中，所述的步骤（3）建立鉴别模型的步骤具体如下：由于线性判别分析模型只适用于样本数量大于变量数量的情况，如果把原始的光谱矩阵作为模型输入不符合线性判别分析的规则，一般在线性判别分析前，都会对光谱样本做一次主成分算法的降维，消除样本的冗余度。将步骤（2）所得的样品光谱数据导入Matlab7.9.0数据处理软件中，先进行光谱标准化预处理，然后用主成分分析对预处理后的数据进行处理，原光谱有m个数据点（m>2000），经处理后前n维便可包含90%以上的信息（n<10），实现了信息的压缩降维。得到的主成分按方差贡献率由大到小进行排列，取经留一交叉验证法验证最优的前N个主成分得分值进行主成分归一化，随后进行线性判别分析，判别率高达80%时即模型建成。

所述标准化预处理方法为：每条样品光谱每个数据点值减去所有光谱在该数据点的均值，并除以在该数据点的标准差，标准化预处理公式为：

$z_{i,j}=\frac{X_{i,j}-\stackrel{\&OverBar;}{X_j}}{{\mathrm{\&theta;}}_j},i=\mathrm{1,2},...p;j=\mathrm{1,2},...m---\left(1\right)$

其中：p为蜂胶样品个数，m为每条蜂胶样品光谱点数，X为光谱矩阵，为平均光谱，θ为光谱标准差。

本发明方法中，所述留一交叉验证法的具体算法为：基于不同的前N维主成分数据，在p个蜂胶样品光谱中顺次取出第1，2，…，p个蜂胶样品光谱，用剩余p-1个样品光谱建立基本模型，再将取出样品光谱用于检验，p个样品全部被轮流检验完毕后，统计正确分类率（CCR），作为模型性能评价指标。正确分类率CCR的计算公式如下：

${\mathrm{CCR}}_{N=i}=\frac{{\mathrm{Num}}_{\mathrm{true}}}{{\mathrm{Num}}_{\mathrm{all}}}\&times;100\%,i=\mathrm{1,2},...n---\left(2\right)$

其中：Num_true表示类别判断正确的蜂胶样品个数，Num_all表示全部待判别样品数。当CCR最高时N取的i值，作为最优主成分维数。

上述方法中，所述线性判别分析的过程如下：共有p个品种的蜂胶，各有p₁,p₂,p₃,p₄……个样本，经主成分分析提取信息后各样本具有N个主成分。线性判别分析将N维模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，以达到抽取分类信息和压缩特征空间维数的效果，投影后保证模式样本，即p个品种蜂胶在新的子空间有最大的类间距离和最小的类内距离，投影后模式样本的类间散布矩阵最大，并且同时类内散布矩阵最小，即模式在该空间中有最佳的可分离性。

其中，所述的步骤（4）预测待测蜂胶胶源品种的步骤具体如下：用近红外光谱仪对待测蜂胶进行光谱扫描，仪器参数同步骤（2）；然后用步骤（3）的光谱预处理参数和θ按照公式（1）进行预处理，用主成分分析进行压缩降维，用步骤（3）建立的模型预测，预测分析该样品属于哪一类。

优选地，本发明建立的快速鉴别蜂胶胶源品种的方法适用于鉴别蜂胶胶源为桦树、桉树、杨树和/或橡树的蜂胶。

本发明的基于快速鉴别蜂胶品种的方法一个较优选的具体实施方式如下：

（1）样品库建立：从全国蜂胶主产区的蜂场采集蜂胶产品，胶源分别来自桦树，桉树，杨树，橡胶4个品种。每种胶源品种至少采集7个蜂胶样品，每个样品至少0.5kg，塑料袋装，分析前室温放置。将来自不同胶源的蜂胶品种类别以1，2，3….数字形式进行标识。

（2）样品光谱数据库建立：利用近红外光谱仪固体光纤对步骤1的蜂胶样品进行光谱扫描，先以空气为背景进行扫描，然后对待测样本进行扫描，每个样本扫描3次，取平均光谱作为单个样品的光谱，建立样品光谱数据库。采集过程中，近红外光谱仪的检测参数为：扫描范围为4000～12500cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次。

（3）鉴别模型建立：将步骤2所得的样品光谱数据导入Matlab7.9.0或相关数据处理软件中，先按公式（1）进行光谱标准化预处理，然后用主成分分析对预处理后的数据进行处理，得到的主成分按方差贡献率由大到小进行排列，从2203个光谱数据点提取了总信息中贡献达90%以上的小于10维的主成分信息，取经留一交叉验证法验证最优的前N个主成分得分值进行主成分归一化，随后进行线性判别分析，判别率高达80%即模型建成。

线性判别分析过程如下：共有桦树，桉树，杨树，橡胶4个品种蜂胶，各有p₁,p₂,p₃,p₄个样本，经主成分分析提取信息后各样本具有N个主成分。线性判别分析将N维模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，以达到抽取分类信息和压缩特征空间维数的效果，投影后保证模式样本，即桦树，桉树，杨树，橡胶4个品种蜂胶在新的子空间有最大的类间距离和最小的类内距离，投影后模式样本的类间散布矩阵最大，并且同时类内散布矩阵最小，即模式在该空间中有最佳的可分离性。

（4）待测蜂胶胶源品种预测：用近红外光谱仪对待测蜂胶进行光谱扫描，仪器参数同步骤2；然后用步骤3的光谱预处理参数θ按照公式（1）进行预处理，用主成分分析按照步骤3的主成分分析系数进行压缩降维，用步骤3的模型预测，预测分析该样品属于哪一类。

本发明的方法操作简单，快速，绿色环保，成本较低，在保持上述技术效果的能够高效地快速鉴别蜂胶品种(即胶源)。

附图说明

图1是本发明的方法步骤（2）中所得到的蜂胶近红外原始光谱图。

图2是本发明的方法步骤（3）中建立鉴别模型时所得到的不同品种蜂胶的主成分散点图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1快速简便蜂胶胶源品种方法的建立

1、样本采集 从吉林省采集桦树，广西省采集桉树，河南省采集杨树，云南省采集橡胶胶源蜂胶样本，数目分别为7个、9个、11个及12个，共39个。各类胶源蜂胶样本构成胶源品种样本组，将来自桦树，桉树，杨树，橡胶胶源的蜂胶种类分别赋值为1，2，3，4。

2、样本的近红外光谱扫描 用Bruker公司MPA傅立叶变换近红外光谱仪2mm光程固体光纤探头对每个蜂胶样品进行扫描，每个样品扫描3次，取平均值，仪器的检测参数：扫描范围为4000～12500cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次。样本的近红外原始光谱图如图1。

3、光谱数据预处理 对蜂胶样品的近红外光谱数据导入Matlab7.9.0软件中，按公式（1）进行光谱标准化预处理，获得2203个数据点的θ值，

4、光谱数据压缩 本实验中每个样本的近红外光谱数据点为2203，变量数过大不符合线性判别分析模型要求，因此将预处理后的蜂胶近红外光谱数据用Matlab7.9.0软件中主成分分析程序进行降维压缩处理，用主成分分析对预处理后的数据进行处理，原光谱有m个数据点（m>2000），经处理后前n维便可包含90%以上的信息（n<10），实现了信息的压缩降维，得到前两维主成分分布散点图（图2）。

从散点图可以看出各类蜂胶样本基本分布在自己所在类空间附近，各类别之间有相对显著的分类界限。

在进行线性判别分析时，根据留一交叉验证法，以获取最佳正确判别率为准则筛选出最优的前5个主成分得分值，累积贡献率达99.96%，作为模型的输入，留一交叉验证模型，正确分类率（CCR）达92.31%。

留一交叉验证法的具体算法为：基于不同的前N维主成分数据，在p个蜂胶样品光谱中顺次取出第1，2，…，p个蜂胶样品光谱，用剩余p-1个样品光谱建立基本模型，再将取出样品光谱用于检验，p个样品全部被轮流检验完毕后，统计正确分类率（CCR），作为模型性能评价指标。正确分类率CCR的计算公式如下：

${\mathrm{CCR}}_{N=i}=\frac{{\mathrm{Num}}_{\mathrm{true}}}{{\mathrm{Num}}_{\mathrm{all}}}\&times;100\%,i=\mathrm{1,2},...n---\left(2\right)$

其中：Num_true表示类别判断正确的蜂胶样品个数，Num_all表示全部待判别样品数。当CCR最高时N取的i值，作为最优主成分维数。

5、鉴别模型建立

将39个蜂胶样本随机分为校正集和检验集，其中校正集26个样品，检验集13个样品。

本实验在Matlab7.9.0环境下使用线性判别分析程序，共有p个品种的蜂胶，各有p₁,p₂,p₃,p₄……个样本，经主成分分析提取信息后各样本具有N个主成分。线性判别分析将N维模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，以达到抽取分类信息和压缩特征空间维数的效果，投影后保证模式样本，即p个品种蜂胶在新的子空间有最大的类间距离和最小的类内距离，投影后模式样本的类间散布矩阵最大，并且同时类内散布矩阵最小，即模式在该空间中有最佳的可分离性。

基于上述校正样本集的前5个主成分进行主成分归一化至[0，1]区间后的数据建立判别分析校正模型，并对检验集进行外部检验，判别结果见表1，分别对4份桦树胶源、5份桉树胶源、8份杨树胶源、7份橡树胶源的蜂胶按照本发明建立的方法进行了鉴别，结果显示，经过本发明的方法，4份桦树胶源的蜂胶全部鉴别为桦树胶源，正确率达100%；5份桉树胶源的蜂胶有4份鉴定为桉树胶源，1份判为橡树胶源，正确率达80%；8份杨树胶源和7份橡树胶源的蜂胶全部鉴别为桦树胶源和橡树胶源，正确率均达100%。校正集与测试集正确分类率均达92.31%。

由表1可知，若蜂胶品种类别被判为1，则胶源为桦树；若为2，则为桉树；若为3，则为杨树；若为4，则为橡胶；上述数字均与本实施例对四种树胶源编号相对应。若为空，则不属于上述4种胶源的任何品种。

表1不同品种胶源蜂胶校正集和检验集的判别分析结果

实施例2快速简便蜂胶胶源品种方法的应用

1、样本采集

从市场采集未知胶源的蜂胶6个，样品编号为FJ1，FJ2，FJ3，FJ4，FJ5，FJ6。

2、样本的近红外光谱扫描

用Bruker公司MPA傅立叶变换近红外光谱仪2mm光程固体光纤探头对每个蜂胶样品进行扫描，每个样品扫描3次，取平均值，仪器的检测参数：扫描范围为4000～12500cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次。

3、光谱数据预处理

将未知胶源蜂胶样品的近红外光谱数据导入Matlab7.9.0软件中，按照公式（1）进行光谱标准化预处理。

4、光谱数据压缩

用主成分分析法将预处理后的未知蜂胶近红外光谱数据进行信息提取，压缩，取前5个主成分。具体方法参见实施例1的步骤4。

5、对未知胶源蜂胶样品光谱进行预测

将未知胶源蜂胶样品光谱使用实施例1建立的品种判别模型进行预测。预测结果显示，FJ1，FJ4胶均被判为1，则说明该2个样品胶源为桦树；FJ2蜂胶被判为2，则为桉树胶；FJ6被判为3，则为杨树胶；FJ5判为空，则说明该样品不属于上述4种胶源的任何品种，可能为其他胶源品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种鉴别蜂胶胶源的方法，其特征在于，将近红外光谱的指纹特征谱图与化学计量学相结合，从而实现简便快速地鉴别蜂胶品种来源，包括如下步骤：

(1)建立样品库；

(2)建立样品光谱数据库；

(3)建立鉴别模型；

(4)预测待测蜂胶胶源品种；

步骤(1)所述的建立样品库的步骤具体如下：从全国蜂胶主产区的蜂场采集蜂胶产品，胶源分别来自不同品种；每种胶源品种至少采集7个蜂胶样品；将来自不同胶源的蜂胶品种进行编号标识；

步骤(2)所述的建立样品光谱数据库的步骤具体如下：利用近红外光谱仪固体光纤探头对步骤1的蜂胶样品进行光谱扫描，扫描范围为4000～12500cm^-1，分辨率4cm^-1，扫描次数为32次；先以空气为背景进行扫描，然后对待测样本进行扫描，每个样品扫描3～5次，取平均光谱作为单个样品的光谱，建立样品光谱数据库；

步骤(3)所述的建立鉴别模型的步骤具体如下：将步骤(2)所得的样品光谱数据导入数据处理软件中，先进行光谱标准化预处理，对预处理后的数据进行压缩、降维，得到的主成分按方差贡献率由大到小进行排列，取经留一交叉验证法验证最优的前N个主成分得分值进行主成分归一化，随后进行线性判别分析，判别率达80％以上时即模型建成。

2.如权利要求1所述的鉴别蜂胶胶源的方法，其特征在于，光谱标准化预处理方法为：每条样品光谱每个数据点值减去所有光谱在该数据点的均值，并除以在该数据点的标准差。

3.如权利要求1所述的鉴别蜂胶胶源的方法，其特征在于，所述留一交叉验证法的算法为：基于不同的前N维主成分数据，在p个蜂胶样品光谱中顺次取出第1，2，…，p个蜂胶样品光谱，用剩余p-1个样品光谱建立基本模型，再将取出样品光谱用于检验，p个样品全部被轮流检验完毕后，统计正确分类率，作为模型性能评价指标；CCR是类别判断正确的蜂胶样品个数与全部待判别样品数的比值。

4.如权利要求1所述的鉴别蜂胶胶源的方法，其特征在于，所述线性判别分析的过程如下：共有p个品种的蜂胶，各有p₁,p₂,p₃,p₄……个样本，经主成分分析提取信息后各样本具有N个主成分；线性判别分析将N维模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，以达到抽取分类信息和压缩特征空间维数的效果，投影后保证模式样本，即p个品种蜂胶在新的子空间有最大的类间距离和最小的类内距离，投影后模式样本的类间散布矩阵最大，并且同时类内散布矩阵最小，达到模式在该空间中有最佳的可分离性。

5.如权利要求1所述的鉴别蜂胶胶源的方法，其特征在于，步骤(4)所述的预测待测蜂胶胶源品种的步骤具体如下：用近红外光谱仪对待测蜂胶进行光谱扫描；然后用光谱预处理参数进行预处理，用主成分分析进行压缩降维，用步骤(3)建立的预测模型预测分析待测样品的胶源。

6.如权利要求1～5任一所述的鉴别蜂胶胶源的方法，其特征在于，所述蜂胶胶源来自桦树、桉树、杨树和/或橡树。