CN106596757A - 一种基于p‑香豆酸苄酯含量鉴定蜂胶产地的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于p‑香豆酸苄酯含量鉴定蜂胶产地的方法，所述方法依据待鉴定蜂胶中p‑香豆酸苄酯的含量对所述待鉴定蜂胶的产地进行鉴定。本发明提供的方法可以高效、稳定、准确地鉴定蜂胶的产地，对于加强蜂胶产地鉴别的研究，探索蜂胶溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂胶质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。

Description

一种基于p-香豆酸苄酯含量鉴定蜂胶产地的方法

技术领域

本发明涉及蜂胶鉴定领域，具体涉及一种基于p-香豆酸苄酯含量鉴定蜂胶产地的方法。

背景技术

蜂胶是蜜蜂从植物的芽苞、树皮或茎干伤口采集的树脂等分泌物，与部分蜂蜡和花粉以及蜜蜂上颌腺的分泌物混合而成的芳香黏性固体。蜂胶化学成分复杂，含有丰富的黄酮类、萜烯类、酚酸类等生物活性物质。现代大量的生理药理学研究表明，蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗氧化、防衰老、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫力、降低血糖血脂、镇静、麻醉等多种生物学活性。因此，近十几年来蜂胶成为蜂产品研究开发的热点，越来越受到食品、保健品、医药、日化、农牧业及广大人民群众的关注。

中国地域广阔，气候类型多样，胶源植物种类繁多，目前普遍认为杨树及其杂交属是中国蜂胶最主要的植物来源(周梦遥等2010)，也有研究表明桦树、松树、柳树、桉树、橡胶也是中国蜂胶的植物来源(Darwish et al.,2011；Markham et al.,1996；Teixeira etal.,2005)。

胶源植物不同是造成蜂胶化学组分差异迥异的决定因素，蜂胶化学成分与其胶源植物化学成分具有显著的联系和相关(Christov et al.,2006；Kumazawa et al.,2008)。Burdock(1998)认为蜂胶的地理位置、植物源和化学组成之间有密切关系。

农产品产地溯源技术是建立于农产品生产、加工、贮运、销售和消费过程的信息记录和信息追溯体系，即从农田到餐桌的过程跟踪或从餐桌到农田的源头追溯技术(张晓焱等2010)。农产品产地溯源有利于地理标志产品的保护，保护地方名特优产品，保护消费者合法权益，一旦发生农产品安全问题能保证农产品能被及时召回。此外，有调查显示消费者购买食品时十分关注产地信息，实施农产品产地溯源能保障消费者的知情权。食品产地溯源的整体研究思路是分析不同地域来源产品间多项指标的差异，探寻用于表征不同地域来源产品的特异性指标，结合化学计量学方法，筛选出有效的溯源指标，建立判别模型，并使用盲样进行模型的稳定性验证(魏益民等2012)。产地鉴别分析重点是探寻表征不同地理来源农产品的特异性指标。不同植物来源的蜂胶中生物活性成分的种类和含量差异很大，其生理功效和经济价值也有很大差别。国内外学者主要通过对蜜蜂采胶行为的观察、蜂胶中植物碎片形态学观察、蜂胶和可疑胶源植物提取物化学成分相似度分析、特征标志化合物的发现鉴别蜂胶的植物来源。在实际生产中，蜂胶原料收购商和加工企业直接面对的是大量蜂胶原料，很难观察到蜜蜂的采胶行为，蜂胶中植物碎片的形态学观察和化学成分的分析则需要配备专业的鉴定人员和昂贵的精密分析仪器，鉴定过程繁琐费时，费用昂贵，不适合在生产实践中应用和推广。因此，急需开发一种简单快速判别蜂胶原料植物来源的方法，建立蜂胶的准确、快速、高效的植物源识别与产地溯源技术，建立有效的分析方法对蜂胶植物源或产地识别的可行性和效果进行论证，建立预测模型并验证模型的可靠性，以期为不同植物源、地理源蜂胶的高效利用提供技术支持，为繁荣和丰富蜂胶保健品市场提供技术支持，也为蜂胶国家标准的指标选择和合理修订提供基础。

现可查询的鉴别蜂胶品种的方法有色差检验(ZL201310282033.5)，红外光谱检验(ZL 201410060599.8)，高效液相色谱测定并计算黄酮成分比例关系(王勇,蜂胶植物源和产地识别技术研究,2014)等。色差检验是使用色差仪测定蜂胶液色度值，代入线性判别模型计算Y值，把待测样品判定为Y值最大的胶源类型。该法需要大量样品进行建模工作，还需要专用的检测设备。红外光谱检验是将近红外光谱的指纹特征谱图与化学计量学相结合鉴别蜂胶品种来源，该法同样需要大量的建模工作，且检测设备昂贵，不是基层单位常备检测设备。高效液相色谱仪是基层单位常备的检测设备，建立高效液相色谱法进行蜂胶品种检测是经济高效可行的，当前在蜂胶检测中高效液相色谱技术主要用于蜂胶的质量评价、掺假鉴别(GB/T 19427-2003；GH/T 1081-2012)；在蜂胶研究中高相液相色谱技术主要用于蜂胶中未知化合物的分离定性、不同产地蜂胶成分的比较分析。当前我国评价蜂胶品质的指标主要依据是黄酮类物质含量，国标GB/T 19427-2003中规定了蜂胶中芦丁、杨梅酮、榭皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定方法，该法可对蜂胶中的8种黄酮类化合物进行定性和定量分析，但无法明确不同类型蜂胶样品的黄酮组分特征和差异，无法达到鉴别蜂胶植物来源的目的。王勇(2014年)报道了用高效液相色谱测定并计算黄酮成分比例关系鉴别蜂胶品种的方法，以槲皮素、莰菲醇、芹菜素和松属素、柯因、高良姜素6种黄酮类成分含量及其比例关系鉴别杨树型和桦树型蜂胶，但中国地域广阔，气候类型多样，胶源植物种类繁多，导致蜂胶各成分含量和各成分间比例关系发生变化，致使蜂胶品种鉴别工作难度加大，更不用说人为掺假会改变各成分间比例关系，使鉴别工作复杂化。因此研究、发现、鉴别蜂胶中特征成分并加以定性量化，不失为一个简约可行的蜂胶品种鉴别方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种可以高效、稳定、准确地鉴定蜂胶的产地的方法。该方法通过对蜂胶中特征活性成分进行定性和定量分析，根据蜂胶中特征性成分的含量来准确鉴别蜂胶的产地。

发明人对中国各地数百个蜂胶样品进行HPLC-DAD分析，在320nm发现某些产地蜂胶存在一个峰值很大的色谱峰，遂进行分离、制备，采用MS和NRM方法进行了鉴定，确认其为p-香豆酸苄酯，研究中还发现了p-香豆酸苄酯存在的规律性和检测的适用条件。

所述p-香豆酸苄酯(p-Coumaric acid benzyl ester)是蜂胶中众多化学成分之一，其结构式为：

具体而言，本发明提供了一种基于p-香豆酸苄酯含量鉴定蜂胶的方法，所述方法依据待鉴定蜂胶中p-香豆酸苄酯的含量对所述待鉴定蜂胶的产地进行鉴定。

本发明通过大量实验筛选，选择甲醇为溶剂对蜂胶中p-香豆酸苄酯进行提取，从而富集指标物p-香豆酸苄酯，去除非指标物在检测中的干扰，通过检测待鉴定蜂胶的甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量进而准确获得待鉴定蜂胶中p-香豆酸苄酯的含量。

作为一种优选方案，所述甲醇提取物的制备方法为：将待鉴定蜂胶与甲醇混合，以频率40～100Hz进行超声提取，离心后取上清液，蒸干溶剂，即得。

其中，为了对p-香豆酸苄酯进行富集，从而更加准确地获得待鉴定蜂胶中p-香豆酸苄酯的含量，本发明优选所述超声提取优选为提取2～3次，每次提取50～70min。

为了使上清液与沉淀快速且有效地分离，所述离心的速度优选为3000～5000r/min。

本发明优选在制备甲醇提取物前对所述待鉴定蜂胶进行预处理，从而更加快速、高效地提取出p-香豆酸苄酯，使检测以及鉴定结果更加准确。所述预处理具体为：取待鉴定蜂胶，在-4～-20℃下冷冻6～24小时后，粉碎。

为了使p-香豆酸苄酯得到进一步的富集和纯化，所述方法还包括对甲醇提取物进行以下后处理：将所述甲醇提取物溶于二氯甲烷，上样于SPE固相萃取柱，以二氯甲烷为流动相进行洗脱，收集洗脱液，蒸干溶剂，即可。

本发明采用高效液相色谱法对p-香豆酸苄酯进行检测。

所述高效液相色谱法中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由0.1％甲酸水溶液和甲醇组成。

在实际应用中，所述高效液相色谱法可采用等度洗脱；所述流动相中，甲醇的体积百分比为55～60％，优选为56～58％。

为了提高所述高效液相色谱法检测的准确性，本发明对检测条件进行进一步优选，包括：柱温为25～35℃，优选为28～32℃；和/或，流动相流速为0.5～1.5ml/min，优选为0.8～1.2ml/min；和/或，进样量为5～15μL，优选为8～12μL。

所述高效液相色谱法检测可以对待测蜂胶中p-香豆酸苄酯进行定性和定量检测。

所述定性检测具体为：根据蜂胶试样溶液中p-香豆酸苄酯的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过色谱保留时间定性，样品中p-香豆酸苄酯与标准工作溶液中p-香豆酸苄酯的保留时间相对偏差不大于1％。

所述定量检测具体为：分别取适量蜂胶试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。

本发明所述高效液相色谱法检测采用外标法计算p-香豆酸苄酯的含量。优选地，以甲醇为溶剂，按照以下浓度梯度配制p-香豆酸苄酯的标准工作液：15ug/mL，30ug/mL，60ug/mL，125ug/mL，250ug/mL，500ug/mL和1000ug/mL。

为了获得更加准确的检测结果，本发明优选以甲醇为溶剂，按照与待测蜂胶甲醇提取物重量体积比15～20mg/ml配制待测样品溶液。

作为本发明的一种优选方案，所述方法包括以下步骤：

(1)标准工作液的配制：

精密称定p-香豆酸苄酯标准品，以甲醇为溶剂配制储备液，进一步按照以下浓度梯度配制多组标准工作液：15ug/mL，30ug/mL，60ug/mL，125ug/mL，250ug/mL，500ug/mL和1000ug/mL；

(2)待测样品溶液的制备：

取待鉴定蜂胶，在-4～-20℃下冷冻6～24小时后粉碎，加入相当于其体积8～12倍的甲醇，以40～100Hz超声提取50～70min，以3000～5000r/min的速度离心，分离上清液和沉淀，在所述沉淀加入相当于其体积5～9倍的甲醇，以40～100Hz超声提取50～70min，以3000～5000r/min的速度离心，分离上清液，将两次所得上清液合并后蒸干溶剂，得甲醇提取物；

将所述甲醇提取物用二氯甲烷溶解，上样于已经用二氯甲烷润洗的SPE固相萃取柱，用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，挥干溶剂，按照与所述甲醇提取物重量体积比15～20mg/ml加入甲醇，充分溶解后用0.22μm微孔膜过滤，得待测样品溶液；

(3)采用高效液相色谱法进行检测：

取标准工作液与待测样品溶液，分别以8～12μl进样，流动相以0.8～1.2ml/min进行等度洗脱；其中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温为28～32℃；流动相由0.1％甲酸水溶液和甲醇组成，所述流动相中甲醇的体积百分比为56～58％；

(4)分别获得标准工作液与待测样品溶液的色谱图，分别计算各色谱图中p-香豆酸苄酯对应的峰面积，采用外标法计算所述待测样品溶液中p-香豆酸苄酯的含量。

本发明通过对大量的蜂胶产品进行检测，获得了蜂胶产地的可靠鉴定标准，具体为：

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量≥3.8％，鉴定所述蜂胶产自中国东北的暖温带针阔叶混交林区；

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量＜3.8％且≥1.1％，鉴定所述蜂胶产自中国东北的暖温带落叶阔叶林区；

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量＜1.1％，鉴定所述蜂胶产自中国东北以外的地区。

本发明提供的方法具有以下优势：

第一、本发明的技术关键点之一在于：采用常规溶剂提取蜂胶，根据相似相溶原理富集指标物p-香豆酸苄酯，去除非指标物在检测中的干扰，使得指标物的定性和定量检测更为准确。

第二、蜂胶中的成分复杂，不同的成分具有不同的活性，p-香豆酸苄酯是从东北地区蜂胶中分离纯化出的化合物，经HPLC确认纯度，经MS和NRM确定结构。通过对蜂胶样品进行前处理，保留指标物去除干扰物，利用HPLC分析方法对其进行定性和定量分析，发现含有该成分的蜂胶样品集中于东北地区，而且同一植被区划地域的蜂胶中含量差异较小，不同植被区划地域的蜂胶含量差异很大，且含量范围无任何交集，因此可以作为特征性指标来鉴别不同植被区划地域的蜂胶，即不同品种蜂胶。

第三、本发明所使用的液相色谱技术是以液相色谱作为分离检测系统，经提取和纯化后的样品在液相色谱经过分离，经由检测器得到色谱图。液相色谱法体现了色谱对复杂样品的高分离能力的优点。

第四、本发明提供的方法根据p-香豆酸苄酯的有无可以准确的将东北地区蜂胶与该地区以外的蜂胶加以鉴别，根据p-香豆酸苄酯的含量差异可以将东北地区不同地域的蜂胶按植被区划分布加以鉴别分类。该方法的优点是简单，快速，准确，稳定，完全消除了以往方法中主观性强，易受人为因素影响的缺点。

第五、本发明提供的方法克服了已有的方法中过度的受人为因素影响，主观性强，准确性低等缺点，而且能够对不同地域不同种类蜂胶中特征性活性成分进行定性和定量分析，普通的检测人员也可利用本方法鉴别蜂胶产地和种类。

第六、经过本发明方法的检测，东北三省蜂胶均存在p-香豆酸苄酯，其中黑龙江和吉林地区蜂胶p-香豆酸苄酯的含量具有很高的一致性，为4.0-6.0g/100g醇提物，没有低于4.0g/100g醇提物的样品。辽宁地区p-香豆酸苄酯含量较高的蜂胶都取自辽宁省东北部的本溪，p-香豆酸苄酯含量为3.9-5.7g/100g醇提物，以上地域生产的蜂胶在植被区划分布上属于温带针阔叶混交林区蜂胶；而取自辽宁省的东南部和中部的蜂胶分布于建昌、朝阳、北票、海城、宽甸等地，p-香豆酸苄酯的含量为1.1-2.6g/100g醇提物，该地域蜂胶在植被区划分布上属于暖温带落叶阔叶林区蜂胶，该地域蜂胶中p-香豆酸苄酯含量仅为温带针阔叶混交林区蜂胶的1/3。东北三省以外的其他地区蜂胶不含p-香豆酸苄酯。由于蜂胶中p-香豆酸苄酯的含量差异明显，可以用该指标来鉴别不同地域生产的蜂胶。

综上所述，本发明提供了一种高效、稳定、重复性好，准确的鉴别蜂胶的方法，对于加强蜂胶种类鉴别的研究，探索蜂胶溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂胶质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。

附图说明

图1为不同地域蜂胶样品中p-香豆酸苄酯聚类与判别分析；

图2为蜂胶样品二氯甲烷洗脱物液相色谱图；

图3为蜂胶样品甲醇洗脱物液相色谱图；

图4为p-香豆酸苄酯标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

从不同的产地取15组蜂胶样品(编号为1～15)，分别按照以下方法进行检测和鉴定：

(1)标准工作溶液的配制：准确称取标准物质p-香豆酸苄酯50.0mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成2.0mg/mL的标准贮备液(所述标准贮备液在-20℃密封保存，可以保存6个月)，备用；取适量标准贮备液于10mL容量瓶中，用甲醇依次稀释定容，配制成以下系列标准工作液：1000ug/ml、500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、60ug/ml、30ug/ml和15ug/ml(标准工作液在密封，4℃冰箱中可以保存1个月)，备用；

(2)待鉴定蜂胶的预处理：

取待鉴定蜂胶，冷冻后粉碎，加入相当于其体积10倍的甲醇，超声提取60min，以4000r/min的速度离心，分离上清液和沉淀，在所述沉淀加入相当于其体积7倍的甲醇，超声提取60min，以4000r/min的速度离心，分离上清液，将两次所得上清液合并后蒸干溶剂，得甲醇提取物；

取所述甲醇提取物25mg，用适量二氯甲烷溶解，上样于已经用二氯甲烷润洗的SPE固相萃取柱，用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，挥干溶剂，加入1.5ml甲醇，充分溶解后用0.22μm微孔膜过滤，得待测样品溶液；

(3)采用高效液相色谱法进行检测：

取标准工作液与待测样品溶液，分别以10μl进样，流动相以1ml/min进行等度洗脱；其中，固定相为Agilent C18色谱柱，柱温为30℃；流动相由0.1％甲酸水溶液和甲醇组成，所述流动相中甲醇的体积百分比为57％；

(4)分别获得标准工作液与待测样品溶液的色谱图，分别计算各色谱图中p-香豆酸苄酯对应的峰面积，采用外标法计算所述待测样品溶液中p-香豆酸苄酯的含量。

换算出各蜂胶样品中p-香豆酸苄酯的含量，按照以下标准进行鉴定：

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量≥3.8％，鉴定所述蜂胶产自中国东北的暖温带针阔叶混交林区；

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量＜3.8％且≥1.1％，鉴定所述蜂胶产自中国东北的暖温带落叶阔叶林区；

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量＜1.1％，鉴定所述蜂胶产自中国东北以外的地区。

检测及鉴定结果如表1所示。

表1：蜂胶的甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量(％，即g/100g)

采用聚类分析中最短距离法对上述采集自东北三省不同地区蜂胶中的p-香豆酸苄酯的含量进行聚类分析，结果如图1所示。

如图1所示，黑龙江省(C系列)、吉林省(b系列)和辽宁北部本溪(a-1系列)蜂胶的p-香豆酸苄酯的含量聚合度高，显示为同类型蜂胶，地理区域属于中国植被区划中温带针阔叶混交林区，该地蜂胶定义为温带针阔叶混交林区蜂胶。

取自辽宁省的东南部和中部的建昌、朝阳、北票、海城、宽甸等地(a-2至a-6系列)蜂胶的p-香豆酸苄酯的含量聚合度高，显示为同类型蜂胶，地理区域属于中国植被区划中暖温带落叶阔叶林区，该地蜂胶定义为暖温带落叶阔叶林区蜂胶。

辽宁省除北部地区以外的样品与黑龙江省、吉林省和辽宁北部的聚合程度较低，显示为不同类型蜂胶。

实验例

(1)待测蜂胶甲醇提取物的后处理：SPE固相萃取柱法

本发明通过预实验发现，p-香豆酸苄酯易溶于二氯甲烷溶液，所以SPE固相萃取柱方案采用二氯甲烷富集p-香豆酸苄酯，结果见图2；将干扰物质保留柱中，经甲醇洗脱可见洗脱液中无p-香豆酸苄酯残留，见图3。通过设置不同洗脱体积梯度的实验，得出最佳的洗脱方案---二氯甲烷18ml洗脱，洗脱液脱溶干燥甲醇复溶进行HPLC检测发现，在p-香豆酸苄酯前后没有干扰峰，有效提高了检测的准确度。

(2)检测方法中标准曲线和方法学实验

P-香豆酸苄酯的标准曲线的建立：以标准品质量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得标准曲线如图4所示。P-香豆酸苄酯线性回归方程分别是：y＝4592709.7026x+182411.2699,R²＝0.9997。由相关系数可知，在检测范围内标准品质量与峰面积具有良好的线性关系。

(3)加样回收实验

表1：加样回收实验表

由表1可知，添加15ug的标准品，回收率在83％～87％之间，RSD为2.7％。添加250ug的标准品，回收率在101.6％～108％，RSD为3.3％。添加1000ug的标准品，回收率在117％～122％之间，RSD为2.3％。表示该方法回收率良好。RSD＝2.7％±0.5％。

(4)日内精密度试验

表2：日内精密度实验表

如表2所示，吸取蜂胶样品液，重复进样5次，每次进样10ul，标准品相对峰面积RSD为1.86％，保留时间RSD为0.75％。表示该方法精密度良好。

(5)日间精确度实验

表3：日间精密度实验表

如表3所示，吸取同一样品，连续测定5天，标准品相对峰面积RSD为1.9％，保留时间RSD为0.17％。表示该方法稳定性良好。

(6)稳定性实验

表4：稳定性试验表

如表4所示，吸取同一样品，每隔一周测定一下，连续测定五周。标准品相对峰面积RSD为1.3％，保留时间RSD为0.18％。表示该方法稳定性良好。

本发明提供的检测方法中，标准曲线相关系数大于0.9997，方法学实验结果表明建立的提取方法和仪器分析方法是准确、稳定的，适合蜂胶中p-香豆酸苄酯的定性和定量分析。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于p-香豆酸苄酯含量鉴定蜂胶产地的方法，其特征在于，依据待鉴定蜂胶中p-香豆酸苄酯的含量对所述待鉴定蜂胶的产地进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法检测待鉴定蜂胶的甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量；

优选地，所述甲醇提取物的制备方法为：将待鉴定蜂胶与甲醇混合，以40～100Hz进行超声提取，离心后取上清液，蒸干溶剂，即得；其中，所述超声提取优选为提取2～3次，每次提取50～70min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待鉴定蜂胶在制备甲醇提取物前进行预处理，具体为：取待鉴定蜂胶，在-4～-20下冷冻6～24小时后，粉碎。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述甲醇提取物进行后处理，具体为：将所述甲醇提取物溶于二氯甲烷，上样于SPE固相萃取柱，以二氯甲烷为流动相进行洗脱，收集洗脱液，蒸干溶剂，即可。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述p-香豆酸苄酯的含量采用高效液相色谱法进行检测；其中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由0.1％甲酸水溶液和甲醇组成。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用等度洗脱；所述流动相中，甲醇的体积百分比为55～60％，优选为56～58％。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中：柱温为25～35℃；

和/或，流动相流速为0.5～1.5ml/min；

和/或，进样量为5～15μL。

8.根据权利要求5～7任意一项所述的方法，其特征在于，以甲醇为溶剂，按照以下浓度梯度配制p-香豆酸苄酯的标准工作液：15ug/mL，30ug/mL，60ug/mL，125ug/mL，250ug/mL，500ug/mL和1000ug/mL；

和/或，以甲醇为溶剂，按照与待测蜂胶甲醇提取物重量体积比15～20mg/ml配制待测样品溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)标准工作液的配制：

精密称定p-香豆酸苄酯标准品，以甲醇为溶剂配制储备液，进一步按照以下浓度梯度配制多组标准工作液：15ug/mL，30ug/mL，60ug/mL，125ug/mL，250ug/mL，500ug/mL和1000ug/mL；

(2)待测样品溶液的制备：

取待鉴定蜂胶，在-4～-20℃下冷冻6～24小时后粉碎，加入相当于其体积8～12倍的甲醇，以40～100Hz超声提取50～70min，以3000～5000r/min的速度离心，分离上清液和沉淀，在所述沉淀加入相当于其体积5～9倍的甲醇，以40～100Hz超声提取50～70min，以3000～5000r/min的速度离心，分离上清液，将两次所得上清液合并后蒸干溶剂，得甲醇提取物；

将所述甲醇提取物用二氯甲烷溶解，上样于已经用二氯甲烷润洗的SPE固相萃取柱，用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，挥干溶剂，按照与所述甲醇提取物重量体积比15～20mg/ml加入甲醇，充分溶解后用0.22μm微孔膜过滤，得待测样品溶液；

(3)高效液相色谱法检测：

取标准工作液与待测样品溶液，分别以8～12μl进样，流动相以0.8～1.2ml/min进行等度洗脱；其中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温为28～32℃；流动相由0.1％甲酸水溶液和甲醇组成，所述流动相中甲醇的体积百分比为56～58％；

(4)分别获得标准工作液与待测样品溶液的色谱图，分别计算各色谱图中p-香豆酸苄酯对应的峰面积，采用外标法绘制标准曲线，根据标准曲线计算所述待测样品溶液中p-香豆酸苄酯的含量。

10.根据权利要求2～4或9任意一项所述的方法，其特征在于，所述鉴定的标准为：

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量≥3.8％，鉴定所述蜂胶产自中国东北的暖温带针阔叶混交林区；

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量＜3.8％且≥1.1％，鉴定所述蜂胶产自中国东北的暖温带落叶阔叶林区；

若所述待鉴定蜂胶甲醇提取物中p-香豆酸苄酯的含量＜1.1％，鉴定所述蜂胶产自中国东北以外的地区。