CN103278575A - 一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法,采用高效液相色谱方法检测蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅酮、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE。本发明以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅酮、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和咖啡酸苯乙酯混合标准品为参照指标,以肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE的有无来界定是否为杨属来源物质,以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸的有无区分蜂胶与杨树胶,以芦丁或杨酶酮为参照确定是否掺入芦丁或杨梅酮,建立区分杨属型蜂胶与杨树胶,以及蜂胶中是否掺入芦丁或杨梅酮的检测方法,评价样品是否来源于杨属植物,真正实现杨属型蜂胶的保真去伪。
Description
技术领域
本发明属蜂产品质量控制领域,涉及一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法。
背景技术
蜂胶自古就被用于天然药物,在古代阿拉伯医书《医典》上被称为“黑蜡”,也是最早收载于《神农本草经》中的露蜂房的主要成分之一。蜂胶本身属于药品,已载于《中华本草》第九卷,并且已被收录到《中华人民共和国药典》(2005,2010年版,一部)。由于蜂胶具有多重药理活性,加之人们保健意识的增强,蜂胶产品越来越受到广大消费者的青睐,现已广泛应用于医药、保健食品、日化等行业,市场需求量很大。
蜂胶的药效取决于所含的化学物质,不同地理来源、植物来源的蜂胶,其化学成分可能有差别或完全不同,从而导致药理作用和临床疗效也不尽一致。以总黄酮含量高低为指标的蜂胶质量控制标准的模式过于片面,难以体现不同地理来源蜂胶化学组成的多变性,不能全面反映蜂胶的内在品质,造成蜂胶制成品药效不稳定,甚至有的产品为了达到总黄酮的含量标准,以杨树胶(杨树芽提取物)冒充蜂胶再人为地加入芦丁等黄酮类化合物以提高“总黄酮”的含量。
温带地区公认的蜂胶植物来源是杨属(Populus)及其杂交属的芽苞分泌物。因杨树芽提取物与杨树型蜂胶提取物在成分、颜色、气味上极其相似,近年来在蜂胶中掺入杨树胶的现象屡屡发生。申请人前期研究建立了以水杨苷为参照的区分蜂胶与杨树胶的方法,解决了待测样本中是否含有杨树胶的问题,但由于该方法是以杨树胶特有而蜂胶不含有的水杨苷为参照,对以非杨树胶的物质冒充或掺假蜂胶,再人为加入芦丁等黄酮类化合物以达到“总黄酮”含量要求的现象无法避免,亟需建立蜂胶真实性评价体系促进蜂胶行业的健康发展。
尽管中国蜂胶地理来源广泛,但主要植物来源为杨属,胶源植物的相对专一性为蜂胶化学成分的标准化提供了可能。现已明确杨属型蜂胶的化学成分特征是不含有B-环取代基的类黄酮,如松属素、高良姜素、白杨素、短叶松素,以及苯丙酸及其酯类,如咖啡酸、阿魏酸及咖啡酸苯乙酯等。建立蜂胶中黄酮类化合物和酚酸类化合物检测方法,找出蜂胶与杨树胶化学成分的异同,既可以确定待测物质是否为杨属来源的,又能区分杨树胶与蜂胶。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法,是采用高效液相色谱方法检测蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅酮、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE的方法,以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、高良姜素、白杨素和CAPE的有无来确定是否为杨属源物质,以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸有无区分开蜂胶与杨树胶,以芦丁和杨梅酮有无界定是否掺入了这两种物质,真正解决了杨属型蜂胶真伪鉴别及质量控制中的重要的技术难题。该方法鉴别杨属型蜂胶的真实性具有准确度高,灵敏度强、相对时间短以及成本低等优点。
本发明的目的是通过以下方案实现:
(1)分别称取咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、肉桂酸、芦丁、杨梅酮、芹菜素、高良姜素、白杨素、咖啡酸苯乙酯和松属素对照品10、10、10、10、40、40、10、10、40、20、10 mg,用甲醇定容为10 mL,然后分别取0.5、0.4、0.3、0.3、0.5、0.5、2、2、0.5、1.0、2.0 mL作为标准混合液,用高效液相色谱法分析,获得混合标准品色谱图;
(2)取供试样品进行冷冻粉碎混匀,用100%的乙醇超声提取,料液比1∶30,超声45 分钟,提取2次,过滤、旋转蒸发制得浸膏,然后用甲醇超声溶解定容,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱法进行测定,获得样品色谱图;
(3)将样品色谱图与咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、肉桂酸、芦丁、杨梅酮、芹菜素、高良姜素、白杨素、咖啡酸苯乙酯和松属素混合标准品色谱图比较以鉴别出蜂胶的真实性。
本发明所述的高效液相色谱仪的条件为:Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm);流速1 mL/min;检测波长280 nm;柱温30℃;进样量:2 μL。
本发明所述的流动相为:纯甲醇和体积比为0.5%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱,洗脱程序为:0~25 min,甲醇20~40%;25~55 min,甲醇40~55%;55~65 min,甲醇55%;65~80 min,甲醇55~75%;80~90 min,甲醇75~20%。
本发明的另一个目的是提供上述方法在评价杨属型蜂胶真实性中应用。
本发明所述的杨属型蜂胶样本中含有咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE,而杨树胶中含有肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE。通过与咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅酮、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE混合标准品对照,如果HPLC谱图中检测到咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE色谱峰,则表明为杨属型蜂胶;如果HPLC谱图中检测到肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE色谱峰而未检测到咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸色谱峰,则表明为杨树胶;如果HPLC谱图中检测到芦丁或杨梅酮,则表时是添加了芦丁或杨梅酮;如果HPLC谱图中检测不到肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE色谱峰,则表明是非杨属来源的物质。
本发明经采自不同地理来源的中国蜂胶样本、不同来源的杨树胶进行反复验证,证明该方法分离效果好、灵敏度高,可行性强,因此,该方法可以定性区分杨属型蜂胶与杨树胶,而且可以有效辩论出中国杨属型蜂胶,是有效的杨属型蜂胶保真去伪评价方法。
尽管蜂胶中黄酮类和酚酸类化合物检测方法的报道较多,但大多是蜂胶中黄酮类和酚酸类化合物含量的测定,国家标准GB/T 19427-2003 还以芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的总和来评价蜂胶中总黄酮含量,但申请人大量研究发现,蜂胶中不含有芦丁和杨梅酮,但这两个物质出峰位置附近均有干扰素存在,可能是错把干扰峰当成了芦丁和杨梅酮。研究同时发现,蜂胶中含有咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸,而杨树胶中不含有这三个物质。因此,本发明提出,以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅酮、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE混合标准品为对照,如果HPLC谱图中检测到咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE色谱峰,则表明为杨属型蜂胶;如果HPLC谱图中检测到高良姜素、白杨素、松属素和CAPE色谱峰而未检测到咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸色谱峰,则表明为杨树胶;如果HPLC谱图中检测到芦丁或杨梅酮,则表明是添加了芦丁或杨梅酮;如果HPLC谱图中检测不到高良姜素、白杨素、松属素和CAPE色谱峰,则表明是非杨属来源的物质。本发明首次建立区分即可区分蜂胶与杨树胶,以及蜂胶中是否掺入芦丁或杨梅酮,还能证实是否是来源于杨属植物的检测方法,真正实现杨属型蜂胶的保真去伪。
本发明以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅酮、肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和咖啡酸苯乙酯(CAPE)混合标准品为参照指标,以肉桂酸、高良姜素、白杨素、松属素和CAPE的有无来界定是否为杨属来源物质,以咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸的有无区分蜂胶与杨树胶,以芦丁或杨酶酮为参照确定是否掺入芦丁或杨梅酮,建立区分杨属型蜂胶与杨树胶,以及蜂胶中是否掺入芦丁或杨梅酮的检测方法,评价样品是否来源于杨属植物,真正实现杨属型蜂胶的保真去伪。
附图说明
图1a为实施例1中杨属型蜂胶的色谱图。
图1b为实施例1中对照品的色谱图。
图2a为实施例2中对照品的色谱图。
图2b 为实施例2中杨树胶的色谱图。
图3为实施例3不同地理来源杨树型蜂胶的色谱图。
图4为实施例4不同来源杨树胶的色谱图。
具体实施方案
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
分别称取咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、肉桂酸、芦丁、杨梅酮、芹菜素、高良姜素、白杨素、CAPE、松属素对照品10、10、10、10、40、40、10、10、40、20、10 mg,用甲醇定容为10 mL。然后分别取0.5、0.4、0.3、0.3、0.5、0.5、2、2、0.5、1.0、2.0 mL作为标准混合液,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱测定方法进行测定。结果参见图1b,图中1、咖啡酸;2、p-香豆酸;3、阿魏酸;4、芦丁;5、杨梅酮;6、肉桂酸;7、松属素;8、CAPE;9、白杨素;10、高良姜素。
取10 g蜂胶,进行冷冻粉碎混匀,用无水乙醇超声提取,料液比1∶30,超声45 min,提取2次,过滤、旋转蒸发制得浸膏。分别取10 mg蜂胶浸膏,用甲醇超声溶解定容,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱测定方法进行测定。结果参见图1a,图中1、咖啡酸;2、p-香豆酸;3、阿魏酸;4、芦丁;5、杨梅酮;6、肉桂酸;7、松属素;8、CAPE;9、白杨素;10、高良姜素。
液相色谱仪的条件为:Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm);流速1.0 mL/min;检测波长280 nm;柱温30℃;进样量:2 μL。流动相为纯甲醇和体积比为0.5%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱,洗脱程序为:0~25 min,甲醇20~40%;25~55 min,甲醇40~55%;55~65 min,甲醇55%;65~80 min,甲醇55~75%;80~90 min,甲醇75~20%。
实施例2
分别称取咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、肉桂酸、芦丁、杨梅酮、芹菜素、高良姜素、白杨素、CAPE、松属素对照品10、10、10、10、40、40、10、10、40、20、10 mg,用甲醇定容为10 mL。然后分别取0.5、0.4、0.3、0.3、0.5、0.5、2、2、0.5、1.0、2.0 mL作为标准混合液,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱测定方法进行测定。结果参见图2b,图中1、咖啡酸;2、p-香豆酸;3、阿魏酸;4、芦丁;5、杨梅酮;6、肉桂酸;7、松属素;8、CAPE;9、白杨素;10、高良姜素。
取10 g杨树胶,进行冷冻粉碎混匀,用无水乙醇超声提取,料液比1∶30,超声45 min,提取2次,过滤、旋转蒸发制得浸膏。分别取10 mg杨树胶浸膏,用甲醇超声溶解定容,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱测定方法进行测定。结果参见图2a,图中1、咖啡酸;2、p-香豆酸;3、阿魏酸;4、芦丁;5、杨梅酮;6、肉桂酸;7、松属素;8、CAPE;9、白杨素;10、高良姜素。
液相色谱仪的条件为:Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm);流速1.0 mL/min;检测波长280 nm;柱温30℃;进样量:2 μL。流动相为纯甲醇和体积比为0.5%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱,洗脱程序为:0~25 min,甲醇20~40%;25~55 min,甲醇40~55%;55~65 min,甲醇55%;65~80 min,甲醇55~75%;80~90 min,甲醇75~20%。
实施例3
分别取10 g不同来源的杨树型蜂胶,进行冷冻粉碎混匀,用无水乙醇超声提取,料液比1∶30,超声45 min,提取2次,过滤、旋转蒸发制得浸膏。分别取10 mg不同来源蜂胶浸膏,用甲醇超声溶解定容,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱测定方法进行测定。参见图3,图中a、辽宁;b、四川;c、山东;d、陕西;e、安徽。
液相色谱仪的条件为:Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm);流速1.0 mL/min;检测波长280 nm;柱温30℃;进样量:2 μL。流动相为纯甲醇和体积比为0.5%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱,洗脱程序为:0~25 min,甲醇20~40%;25~55 min,甲醇40~55%;55~65 min,甲醇55%;65~80 min,甲醇55~75%;80~90 min,甲醇75~20%。
实施例4
分别取10 g不同来源的杨树胶,进行冷冻粉碎混匀,用无水乙醇超声提取,料液比1∶30,超声45 min,提取2次,过滤、旋转蒸发制得浸膏。分别取10 mg不同来源杨树胶浸膏,用甲醇超声溶解定容,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱测定方法进行测定。参见图4,图中1、咖啡酸;2、p-香豆酸;3、阿魏酸;4、芦丁;5、杨梅酮;6、肉桂酸;7、松属素;8、CAPE;9、白杨素;10、高良姜素。
液相色谱仪的条件为:Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm);流速1.0 mL/min;检测波长280 nm;柱温30℃;进样量:2 μL。流动相为纯甲醇和体积比为0.5%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱,洗脱程序为:0~25 min,甲醇20~40%;25~55 min,甲醇40~55%;55~65 min,甲醇55%;65~80 min,甲醇55~75%;80~90 min,甲醇75~20%。
Claims (4)
1.一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法,其特征在于,通过以下步骤实现:(1)分别称取咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、肉桂酸、芦丁、杨梅酮、芹菜素、高良姜素、白杨素、咖啡酸苯乙酯和松属素对照品10、10、10、10、40、40、10、10、40、20、10 mg,用甲醇定容为10 mL,然后分别取0.5、0.4、0.3、0.3、0.5、0.5、2、2、0.5、1.0、2.0 mL作为标准混合液,用高效液相色谱法分析,获得混合标准品色谱图;
(2)取供试样品进行冷冻粉碎混匀,用100%的乙醇超声提取,料液比1∶30,超声45 分钟,提取2次,过滤、旋转蒸发制得浸膏,然后用甲醇超声溶解定容,经微孔膜过滤后,用高效液相色谱法进行测定,获得样品色谱图;
(3)将样品色谱图与咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、肉桂酸、芦丁、杨梅酮、芹菜素、高良姜素、白杨素、咖啡酸苯乙酯和松属素混合标准品色谱图比较以鉴别出蜂胶的真实性。
2.根据权利要求1所述的一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法,其特征在于,液相色谱条件为:Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm),流速1 mL/min,检测波长280 nm;柱温30℃,进样量:2 μL。
3.根据权利要求1所述的一种基于多指标质控的杨属型蜂胶真实性评价方法,其特征在于,流动相为:纯甲醇和体积比为0.5%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱,洗脱程序为:0~25 min,甲醇20~40%;25~55 min,甲醇40~55%;55~65 min,甲醇55%;65~80 min,甲醇55~75%;80~90 min,甲醇75~20%。
4.根据权利要求1所述方法在评价杨属型蜂胶真实性中应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130904 |