CN103592383B - 一种酒神菊属型蜂胶质量控制的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酒神菊属型蜂胶质量控制的方法，以绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C为参照指标，用高效液相色谱方法，检测蜂胶中绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C，真正实现酒神菊属型蜂胶的保真去伪。本发明方法鉴别酒神菊属型蜂胶的真实性具有准确度高，灵敏度强、相对时间短以及成本低等优点，解决了酒神菊属型蜂胶真实性鉴别及质量控制的技术难题。可以定性鉴别酒神菊属型蜂胶，有效辨别出是否添加了芦丁，是一种有效的酒神菊属型蜂胶保真去伪的方法。
Description
技术领域
本发明属蜂产品领域，涉及一种酒神菊属型蜂胶质量控制的方法。
背景技术
蜂胶具有广泛的生物学活性，主要有抑菌、抗真菌、抗原生动物、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗癌和抗氧化活性。蜂胶已广泛用于保健食品，饮料及药品。
巴西地处南美亚马逊流域，拥有世界最大的原始森林，植物种类冠于全球，被誉为世界的“植物宝库”。巴西不同地理来源的蜂胶化学成分及药理活性差异较大。目前研究表明，根据地理来源，化学组成及植物源可将巴西境内的蜂胶分为13个类型，其中巴西东南部的绿蜂胶是研究最多的，已出口至中国十余年，目前巴西绿蜂胶的主要进口国为日本，其次是中国。根据巴西发展工业部和对外贸易部的统计，2010年，巴西出口蜂胶51,213 Kg，产值$4,346,604，即84.87 $/Kg；2011年，巴西出口蜂胶38,845 Kg，产值$4,537,727，即116.81 $/Kg；2012年，巴西出口蜂胶41,721 Kg，产值$5,401,643，即129.47 $/Kg。从这些数据可以看出，与2010年相比，尽管蜂胶年出口量有所降低，但蜂胶的总产值及单产值均明显增加，其中2012年的总产值比2010年增加了50%以上。日本和中国进口的巴西蜂胶主要是酒神菊属型蜂胶，其价格也是逐增加，巴西酒神菊属型蜂胶的原料价格已达中国杨树型蜂胶原料价的十倍之多，而巴西蜂胶种类较多，如何保证巴西酒神菊属型蜂胶的真实性显得尤其重要。
巴西酒神菊属型蜂胶的植物来源是Baccharisdracunculifolia DC.，其主要成分为异戊烯苯丙类和p-香豆酸的异戊烯基衍生物，然而其总黄酮含量较低。由于缺少质量控制相关的指标，巴西蜂胶销售企业只能参照中国蜂胶的国家标准制定相应的企业标准。而中国蜂胶主要是杨属型蜂胶，其活性成分主要是类黄酮类化合物，以总黄酮含量高为特色。因此，参照中国的蜂胶国家标准难以体现巴西酒神菊属型蜂胶的生物活性，甚至出现以杨属型蜂胶乃至杨树胶冒充巴西酒神菊属型蜂胶的不法现象。建立巴西酒神菊属型蜂胶的真实性评价方法，将有利于进口和销售巴西酒神菊属型蜂胶的企业利益及消费者的合法权益。
发明内容
本发明目的是提供一种酒神菊属型蜂胶质量控制的方法，是一种用高效液相色谱方法检测蜂胶中绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C的方法，真正解决酒神菊属型蜂胶真实性鉴别及质量控制中的重要的技术难题。该方法鉴别酒神菊属型蜂胶的真实性具有准确度高，灵敏度强、相对时间短以及成本低等优点。
本发明的目的是通过以下方案实现：
（1）分别称取绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和阿替匹林（Artepillin）C对照品10、10、10、40、10 mg，用甲醇定容为10 mL，然后分别取0.5、0.2、0.5、0.25、4 mL用甲醇定容为10 mL作为标准混合液，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱（HPLC）分析；
（2）取一定量的待测样品进行冷冻粉碎混匀，取0.25g，用体积比85%的乙醇超声提取，料液比1∶15-45，超声15-45 min，提取2-4次，用相同浓度乙醇定容，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱测定方法进行测定；
（3）将待测样品色谱图（步骤2）与绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C混合标准品色谱图（步骤1）对比，在待测样品中检测到绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、Artepillin C的特征峰，则为酒神菊属型蜂胶；在待测样品中检测到绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、Artepillin C和芦丁色谱峰，则为添加了芦丁的酒神菊属型蜂胶样品；在待测样品中检测不到绿原酸和Artepillin C色谱峰，则为非酒神菊属型蜂胶。
本发明所述的高效液相色谱仪（HPLC）的分析条件为：Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速1 mL/min；检测波长280-360 nm；柱温28-35℃；进样量：2μL。
本发明所述的流动相为：纯甲醇和体积比为1%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱，洗脱程序为：0-10 min，甲醇15-25%；10-25 min，甲醇25-40%；25-55 min，甲醇40-60%；55-75 min，甲醇60-80%；75-90 min，甲醇80%。
本发明的另一个目的是提供所述方法在酒神菊属型蜂胶质量控制中的应用。
本发明所述的酒神菊属型蜂胶样本中含有绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、Artepillin C。通过与绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C标准品对照，检测酒神菊属型蜂胶质量。
本发明以绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C为参照指标，建立酒神菊属型蜂胶质量控制的检测方法，真正实现酒神菊属型蜂胶的保真去伪。其中，绿原酸和Artepillin C是巴西酒神菊属型蜂胶的特征性成分，p-香豆酸、咖啡酸在杨属型蜂胶中均存在，但杨树胶中不存在。芦丁是酒神菊属型和杨属型蜂胶中均不含有的物质，由于芦丁比较易获得，常被人为添加以提高总黄酮含量，因此，以这几种物质为参照可判断待测样品是否是酒神菊属型蜂胶以及是否添加了芦丁。
本发明经不同来源的酒神菊属型蜂胶样本、杨属型蜂胶、桉树型蜂胶以及杨树胶进行反复验证，证明该方法分离效果好、灵敏度高，可行性强，因此，该方法可以定性鉴别酒神菊属型蜂胶，而且可以有效辨别出是否添加了芦丁，是有效的酒神菊属型蜂胶保真去伪评价方法。
为验证该方法的准确性，采用ESI（±）/MS对酒神菊属型蜂胶样品进行全扫描，利用质谱工作站提供的提取离子功能，分别萃取出m/z为164、180、300、354的提取离子，经与文献报道相对比，初步鉴定出其对应的化合物分别为p-香豆酸、咖啡酸、Artepillin C、绿原酸，对应本发明检测方法的色谱图参见图1。
附图说明
图1为实施例1中对照品（a）和酒神菊属型蜂胶（b）的色谱图，1是绿原酸，2是咖啡酸，3是p-香豆酸，4是芦丁，5是阿替匹林C。
图2为实施例2中对照品（a）、杨树型蜂胶（b）和杨树胶（c）的色谱图，1是绿原酸，2是咖啡酸，3是p-香豆酸，4是芦丁，5是阿替匹林C。
图3为实施例3中对照品（a）和澳大利亚蜂胶（b）的色谱图，1是绿原酸，2是咖啡酸，3是p-香豆酸，4是芦丁，5是阿替匹林C。
具体实施方案
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
分别称取绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和阿替匹林（Artepillin）C对照品10、10、10、40、10 mg，用甲醇定容为10 mL。然后分别取0.5、0.2、0.5、0.25、4 mL用甲醇定容为10 mL作为标准混合液，HPLC分析。
取一定量的供试酒神菊属型蜂胶样品进行冷冻粉碎混匀，取0.25g，用80%的乙醇超声提取，料液比1∶30，超声15 min，提取3次，用80%乙醇定容，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱测定方法进行测定。
液相色谱仪的条件为：Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速1 mL/min；检测波长280 nm；柱温30℃；进样量：2 μL。
流动相为：纯甲醇和体积比为1%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱。洗脱程序为：0-10 min，甲醇15-25%；10-25 min，甲醇25-40%；25-55 min，甲醇40-60%；55-75 min，甲醇60-80%；75-90 min，甲醇80%。
绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C混合对照品与酒神菊属型蜂胶对比谱图参见图1。在酒神菊属型蜂胶中检测到绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸和Artepillin C，未检测到芦丁。
实施例2
分别称取绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C对照品10、10、10、40、10 mg，用甲醇定容为10 mL。然后分别取0.5、0.2、0.5、0.25、4 mL用甲醇定容为10 mL作为标准混合液，HPLC分析。
分别取一定量的杨树型蜂胶和杨树胶样品进行冷冻粉碎混匀，各取0.25g，分别用70%的乙醇超声提取，料液比1∶45，超声45 min，提取3次，用70%乙醇定容，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱测定方法进行测定。
液相色谱仪的条件为：Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速1 mL/min；检测波长280 nm；柱温30℃；进样量：2 μL。
流动相为：纯甲醇和体积比为1%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱。洗脱程序为：0-10 min，甲醇15-25%；10-25 min，甲醇25-40%；25-55 min，甲醇40-60%；55-75 min，甲醇60-80%；75-90 min，甲醇80%。
绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C混合对照品与杨树型蜂胶、杨树胶对比谱图参见图2。在杨树型蜂胶中检测到咖啡酸、p-香豆酸，未检测到绿原酸、Artepillin C和芦丁；在杨树胶中，绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C均未检测到。
实施例3
分别称取绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C对照品10、10、10、40、10 mg，用甲醇定容为10 mL。然后分别取0.5、0.2、0.5、0.25、4 mL用甲醇定容为10 mL作为标准混合液，HPLC分析。
取一定量的供试桉树型蜂胶进行冷冻粉碎混匀，取取0.25g，用90%的乙醇超声提取，料液比1∶30，超声30 min，提取2次，用90%乙醇定容，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱测定方法进行测定。
液相色谱仪的条件为：Sepax C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速1 mL/min；检测波长280 nm；柱温30℃；进样量：2 μL。
流动相为：纯甲醇和体积比为1%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱。洗脱程序为：0-10 min，甲醇15-25%；10-25 min，甲醇25-40%；25-55 min，甲醇40-60%；55-75 min，甲醇60-80%；75-90 min，甲醇80%。
绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和Artepillin C混合对照品与澳大利亚蜂胶对比谱图参见图3。在澳大利亚蜂胶中检测到芦丁，但未检测到绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸和Artepillin C。
Claims (1)
1.一种酒神菊属型蜂胶的检测方法，通过以下方案实现：
（1）分别称取绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、芦丁和阿替匹林C对照品10、10、10、40、10 mg，用甲醇定容为10 mL，然后分别取0.5、0.2、0.5、0.25、4 mL用甲醇定容为10 mL作为标准混合液，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱分析；
（2）取待测样品进行冷冻粉碎混匀，取0.25g，用体积比85%的乙醇超声提取，料液比1∶15-45，超声15-45 min，提取2-4次，用相同浓度乙醇定容，经微孔膜过滤后，用高效液相色谱测定方法进行测定；
其特征在于，（3）将步骤（2）待测样品色谱图与步骤（1）混合标准品色谱图对比，在待测样品中检测到绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿替匹林 C的特征峰，则为酒神菊属型蜂胶；在待测样品中检测到绿原酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿替匹林C和芦丁色谱峰，则为添加了芦丁的酒神菊属型蜂胶样品；在待测样品中检测不到绿原酸和阿替匹林C色谱峰，则为非酒神菊属型蜂胶；
所述的高效液相色谱的分析条件为：Sepax C18 ，150 mm×4.6 mm, 5μm；流速1 mL/min；检测波长280-360 nm；柱温28-35℃；进样量：2μL；流动相为：纯甲醇和体积比为1%的乙酸水混合液按体积比二元梯度洗脱，洗脱程序为：0-10 min，甲醇15-25%；10-25 min，甲醇25-40%；25-55 min，甲醇40-60%；55-75 min，甲醇60-80%；75-90 min，甲醇80%。
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