CN1281948C - 多波长中药色谱指纹图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，该方法通过色谱条件和紫外响应的考察与优化，确定在1～1.5小时洗脱时间下的梯度曲线和多个紫外检测波长用于指纹图谱测定并进行方法学验证；采用相对响应值和可定量峰作为定点指标进行相对化处理和矩阵化，建立量化多波长指纹图谱共有模式数据矩阵；对未知样品利用该矩阵进行相似度判别和成分差异比较，实现定性定量相结合的质量鉴别和评价。本发明的优点是不仅能从色谱的整体特征把握中药的品种和质量情况，而且通过多波长选取和指纹峰定性鉴定，能够更好表征中药的成分特异性，通过定量处理将主要成分量化，加强了指纹图谱对中药品种及其质量的表达能力和规范程度。采用本发明方法构建的中药色谱指纹图谱，可以广泛地应用于中药质量检测与评价技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种多波长中药色谱指纹图谱的构建方法。
背景技术
中药指纹图谱是通过色谱或光谱手段对中药分析样品的特征性进行表达的一种有效方式。在相关药物研究的指导性文件中已经对中药注射剂做了相应的要求，并已用于中药注射剂的鉴别。近年来，在中药质量控制和评价的实践发展过程中，由于质量要求的提高以及有关新药研究的发展，越来越要求对中药样品进行全面分析和整体表达，但是，由于中药样品中大量未知成分的存在，针对性地说明中药样品中包含成分和相对含量有较大的困难，因此在现代研究中，大量运用指纹图谱的方式进行样品特性表达，同时在针对中药材、饮片、中药提取物以及中药制剂的分析中也广泛地利用了色谱或光谱手段进行指纹图谱的研究。
在众多色谱指纹图谱的研究中，主要是运用紫外检测、蒸发光检测以及质谱检测方式，其中鉴于实用目的，紫外检测是指纹图谱测定的主要检测手段，但是比较而言，一般紫外检测方式存在以下问题：1、检测波长的唯一性，使得对大量其它非特征吸收的物质信息没有得到较好的表达；2、图谱在整体相似度比较的情况下没有对其中成分的相对量进行控制；3、在对指纹峰进行考察的过程中，仅仅采取相对保留值方式进行鉴别，没有建立蕴涵特征信息的指纹峰数据序列，用于专属性评价；4、在指纹图谱评价方法中，结果的定性和定量信息没有结合使用，判断结果针对性不强。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种采用定性和定量指标相结合的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：
(1)将中药样品进行制备，在色谱预选流动相体系中进行粗分，对其中较强的紫外吸收响应进行识别和认定，根据识别和认定的结果，确定样品的多个检测波长并跟踪响应，测定多级洗脱比例下容量因子和对应流动相比例关系；
(2)根据上述比例关系，确定在设定流动相体系下的梯度洗脱方法，进行实际样品测定，根据分离情况以及各个检测波长下色谱洗脱行为，进行整体优化，实时调整梯度洗脱曲线，最终按照跟踪响应的识别情况和容量因子分布，确定在1小时～1.5小时洗脱时间下的梯度曲线，从而确定该样品的指纹图谱测定方法；
(3)对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、测定范围以及耐用性；
(4)对不少于10批的实际样品进行测定，测定结果包括多个检测波长下的图谱及数据，对所述数据以保留时间纵向展开，对每个波长下所得相对峰面积值或峰高值进行一致性处理，建立测定样品的对应相对保留时间的相对峰面积值或峰高值的指纹图谱数据序列，对对应序列进行平均或取中位值，形成多个单波长下指纹图谱共有模式序列，然后进行多个波长下的数据整合，以所有全检测波长范围内可响应指纹峰对应的相对保留时间为列，各检测波长数据为行进行序列矩阵化，对应时间点无响应的位置以0填充，形成多波长指纹图谱共有模式数据矩阵；
(5)对相同的中药样品采取多种制备方式制备或采取多种检测方法对相同样品进行测定，并分别重复步骤(4)，将得到的多个数据矩阵进行差异比较，在此基础上对步骤(4)所得的数据进行层次化；
(6)对指纹图谱中的主要色谱峰进行指纹图谱定性；
(7)对指纹图谱中的主要色谱峰进行指纹图谱定量。
上述步骤(6)中，指纹图谱定性包含三个推断层次，即①采用对照品对照定性；②采用已知结构对照物为参照，利用液相色谱/质谱联用(LC/MS)中准分子离子或分子离子和相应碎片裂解规律和液相色谱/二极管阵列检测器(LC/DAD)的紫外吸收光谱特征推断指纹峰蕴含成分的结构类型，用于对指纹峰成分的推测；③采用LC/MS和LC/DAD信息及保留值标识指纹峰代表的物质成分，用于标识指纹峰的基本化学信息包括指纹峰的保留值、实时紫外吸收光谱、以及可能的分子量和质谱碎片信息。
上述步骤(7)中，指纹图谱定量包含三个层次，①采用对照品进行准确定量；②以准确定量指纹峰为参比，将推测具有相同结构类型的指纹峰与之比较，采用相对响应值进行定量；③采用百分响应值的方式，对用信息标识指纹峰进行量化控制。
上述步骤(5)中，层次化是指按照响应大小或按照物质成分鉴别情况，进行数据分类，将相似差异变化的数据归并为一类，对相同类别指纹峰数据进行比较，选取其中可定量成分或者可定性的稳定成分峰为参照，对类中其它数据进行相对化处理，作为相对含量或相对特征比值进行指纹数据的量化处理结果，将不同层次量化处理结果填入数据矩阵中，即形成量化指纹图谱共有模式数据矩阵。
上述步骤(5)中，多种制备方式包括冷浸法、温浸法、渗漉法、煎煮法、回流法、加压浸出、减压浸出、超声提取法、微波提取法、超临界提取法。
上述步骤(4)中，所述多个检测波长下的图谱及数据是在各检测波长下同时测定得到或在相同条件不同波长下分别测定得到。
本发明由于采取以上设计，其具有以下优点：1、由于本发明采用多波长检测方式，将多个波长下测得的图形进行组合整理，构建了一个较为完整的反映被测样品在各波长下特征的指纹图谱，因此可以更充分地表征各种中药成分特异性信息，并在中药样品质量鉴别和评价分析中，非常方便地对预检验物品进行定性的分析比较，并得出较为精确的判断结论。2、本发明由于将多个波长下测得的指纹峰数据进行了一致性和分层处理，并整合成共有模式的数据矩阵，因此可以将中药成分中的主要成分进行量化，加强了指纹图谱对中药品种及其质量的表达能力和规范程度，使得在中药样品质量鉴别和评价分析中，不但可以得到被检验物品定性的分析结果，而且还可以非常方便地得到具有针对性的定量判断。3、本发明由于提供了一整套规范的定性与定量相结合的多波长色谱指纹图谱的构建方法，因此当使用本方法得到的中药色谱指纹图谱进行中药成分鉴定、分析和评价时，不但方法简便、稳定可靠，而且易于掌握和应用。本发明可以广泛用于中药材、饮片、提取物、中药制剂以及保健品、食品等含有多类化学成分的复杂体系，通过构建多波长色谱指纹图谱进行定性和定量分析，达到鉴别、质量评价和质量控制的目的。
附图说明
图1是栀子药材全波长扫描图谱
图2a～c是栀子药材分别在240、330和440nm波长下的指纹图谱
图3是栀子药材多波长组合的指纹图谱(组合图谱)
图4a～c是栀子药材多波长HPLC定性定量分析对照品图谱
图5a～f是栽培(a)和野生(b)栀子药材的多波长指纹图谱对比
图6是清开灵注射液全波长扫描图谱
图7a～c是清开灵注射液中主要成分黄芩苷、栀子苷和绿原酸的紫外吸收光谱图
图8a～c是清开灵注射液分别在240、280和330nm波长下的指纹图谱
图9a～c是清开灵注射液中三种主要成分对照品HPLC色谱图
图10是清开灵注射液按保留值分类结果
图11a～d是不同厂家清开灵注射液采用本指纹图谱方法进行质控前相似度比较
图12a～d是不同厂家清开灵注射液采用本指纹图谱方法进行质控后相似度比较
具体实施方式
本发明多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1、将中药样品进行制备，在色谱预选流动相体系中进行粗分，对其中较强的紫外吸收响应进行识别和认定，根据识别和认定的结果，确定样品的多个检测波长并跟踪响应，测定多级洗脱比例下容量因子和对应流动相比例关系；
2、根据上述比例关系，确定在设定流动相体系下的梯度洗脱方法，进行实际样品测定，根据分离情况以及各个检测波长下色谱洗脱行为，进行整体优化，实时调整梯度洗脱曲线，最终按照跟踪响应的识别情况和容量因子分布，确定在1小时～1.5小时洗脱时间下的梯度曲线，从而确定该样品的指纹图谱测定方法；
3、对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、测定范围以及耐用性；
4、对不少于10批的实际样品进行测定，采用各检测波长下同时测定或在相同条件不同波长下分别测定的方式进行测定，得到的测定结果包括多个检测波长下的图谱及数据，对所述数据以保留时间纵向展开，对每个波长下所得相对峰面积值或峰高值进行一致性处理，即将数据相对化，一般可采用相对峰面积值或峰高值，并通过可定量的物质成分峰作为定点指标，进行保留时间的相对化处理，匹配相应测定批次的数据，识别共有指纹峰，建立测定样品的对应相对保留时间的相对峰面积值或峰高值的指纹图谱数据序列，对对应序列进行平均或取中位值，形成多个单波长下指纹图谱共有模式序列，然后进行多个波长下的数据整合，以所有全检测波长范围内可响应指纹峰对应的相对保留时间为列，各检测波长数据为行进行序列矩阵化，对应时间点无响应的位置以0填充，形成多波长指纹图谱共有模式数据矩阵；
5、对相同的中药样品采取冷浸法、温浸法、渗漉法、煎煮法、回流法、加压浸出、减压浸出、超声提取法、微波提取法、超临界提取法中的一种或多种制备方法对相同样品进行制备后，分别重复步骤4；或者采取紫外检测法、蒸发光检测法、质谱检测法中的一种或多种检测方法对相同样品进行测定，分别重复步骤4。将得到的多个数据矩阵进行差异比较，在此基础上对步骤4所得的数据进行层次化。层次化是指按照响应大小或按照物质成分鉴别情况，进行数据分类，将相似差异变化的数据归并为一类，对相同类别指纹峰数据进行比较，选取其中可定量成分或者基本可定性的稳定成分峰为参照，对类中其它数据进行相对化处理，作为相对含量或相对特征比值进行指纹数据的量化处理结果，将不同层次量化处理结果填入数据矩阵中，即形成量化指纹图谱共有模式数据矩阵。
6、对指纹图谱中的主要色谱峰进行指纹图谱定性，定性可以包含三个推断层次：(1)采用对照品对照定性；(2)采用已知结构对照物为参照，利用LC/MS中准分子离子或分子离子和相应碎片裂解规律和LC/DAD紫外吸收光谱特征推断指纹峰蕴含成分的结构类型，用于对指纹峰成分的推测；(3)采用LC/MS和LC/DAD信息及保留值标识指纹峰代表的物质成分，内容包括指纹峰的保留值、实时紫外吸收光谱、以及可能的分子量和质谱碎片信息用于标识该指纹峰。
7、对指纹图谱中的主要色谱峰进行指纹图谱定量，定量可以包含三个层次，(1)采用对照品进行准确定量；(2)以准确定量指纹峰为参比，将推测具有相同结构类型的指纹峰与之比较；(3)采用相对响应值进行定量，采用百分响应值的方式，对用信息标识指纹峰进行量化控制。
经上述构建方式得到的多波长中药色谱指纹图谱，可以对未知供试样品进行测定，利用上述矩阵进行样品的相似度判别和成分差异比较，从而实现定性定量相结合的质量鉴别和质量评价分析。
下面结合实施例，对本发明进一步进行描述。
实施例一：
1、栀子药材多波长指纹图谱的构建
(a)实验采用Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Phenomenex Luna C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)。
(b)栀子果实粉碎后，过40目筛，加入适量甲醇浸泡1小时，超声处理20分钟，放冷，3000rpm离心10分钟后，取上清液过滤即得。
(c)色谱条件：流动相为甲醇和水，流速0.8ml/min，柱温35℃，采用线性梯度洗脱。
(d)根据DAD检测器在200～600nm全波长扫描图(如图1所示)，为了使各组分达到吸收强、干扰小的目的，选择在240nm测定环烯醚萜苷类物质(如图2-a所示)，330nm测定绿原酸(如图2-b所示)，440nm测定藏红花素类物质(如图2-c所示)，获得三个波长下栀子的单独指纹图谱；将此三个波长下单独的指纹图谱有机地组合在一起就构成栀子的组合指纹图谱(如图3所示)，图中不同成分的谱图分别采用优化后的不同检测波长测得，其分别是：1、栀子酸；2、异栀子苷；4、京尼平龙胆二糖苷；8、栀子苷；7、绿原酸；14、藏红花素1；16、藏红花素2；18、藏红花素3；19、藏红花酸。
(e)采用对照品对样品物质成分进行定性，如图4a～c所示，是栀子药材的多波长HPLC定量分析对照品图谱，给出了栀子中9种成分的定性鉴定结果：1、栀子酸；2、异栀子苷；3、京尼平龙胆二糖苷；4、栀子苷；5、绿原酸；6、藏红花素1；7、藏红花素2；8、藏红花素3；9、藏红花酸，对其相似物及无对照品的成分采取在线扫描图谱的一致性分析结合LC/MS进行定性。
(f)采用对照品外标法对样品物质成分进行定量测定，在多波长HPLC指纹图谱中(如图4a～c所示)，采用对照品定量测定栀子药材中9种成分，采用相对峰面积对其相似物及无对照品的成分进行定量测定，其测量结果如表1所示：
表1栀子多波长指纹图谱共有模式数据矩阵数据表
| 相对保留时间 | 峰面积 | ||
| 240nm | 330nm | 440nm | |
| 3.85112.06414.03714.78415.69117.68518.31520.13920.58722.93323.07223.41323.43530.08030.52831.04031.47731.65931.86132.41632.42732.44832.74732.76833.2833.79233.82434.42134.43235.6835.88336.05336.19237.49339.10439.80846.76347.76548.37349.749 | 02554908909293050672756843598058150262739225580510403608000000297465401201610756831036234402978570848036129105156509006380548872433442541040082922500 | 00014686200118883936153500941500809591143350138811023152826521735083440014507020482370043631102333891018985700765237880015981079038162272721791878 | 1706000002885000000086210472200004189014450041120859800048912156343283000000 |
(g)将量化指纹图谱共有模式数据矩阵(如表1所示)，用于进行样品的相似度判别与评价。
2、栀子药材多波长指纹图谱的应用
如图5a～f所示，是栽培的栀子药材(a)(如图5-a、c、e所示)和野生栀子药材(b)(如图5-b、d、f所示)的多波长指纹图谱对比，本指纹图谱方法能够明确表征两者之间的异同。结果表明野生栀子中的栀子苷及藏红花素类成分含量普遍略高于栽培品的含量，表明栽培品质量低于野生品种。
实施例二：
1、清开灵多波长指纹图谱的构建
(a)采用岛津LC-2010A型高效液相色谱仪(带有SPD-M10 A型二极管阵列检测器，自动进样装置)，Kromasil C18色谱分析柱(250×4.6mm，5μm)。
(b)清开灵注射液用0.45μm滤膜过滤后直接进样。
(c)色谱条件：流动相为A相：0.3％甲酸水溶液，B相：甲醇，柱温：30℃；流速：1.0ml/min，采用线性梯度洗脱。
(d)经过DAD检测器在200～600nm全波长扫描(如图6所示)，扫描结果(溶剂：甲醇)表明栀子苷在238nm处有最大吸收；黄芩苷在280nm处有最大吸收；绿原酸在329nm处有最大吸收。图7a～c是清开灵注射液中主要成分黄芩苷、栀子苷和绿原酸的紫外吸收光谱图，图中：1、栀子苷，2、黄芩苷，3、绿原酸，溶剂为甲醇。为了使各组分达到吸收强、干扰小的目的，最终选择在238nm测定栀子苷(如图8-a所示)，280nm测定黄芩苷(如图8-b所示)，330nm测定绿原酸(如图8-c所示)，同时获得三个波长下的指纹图谱，图中：1、栀子苷，2、黄芩苷，3、绿原酸。
(e)采用对照品对样品物质成分进行定性，对其相似物及无对照品的成分采取在线LC/UV结合LC/MS进行定性(如图9a～c所示)，图中是清开灵注射剂中三种主要成分1、栀子苷，2、黄芩苷，3绿原酸的定性。
(f)采用对照品外标法对样品物质成分进行定量测定、采用相对峰面积对其相似物及无对照品的成分进行定量测定。
(g)将清开灵指纹峰按保留值分类(如图10所示)，分类结果采用量化指纹图谱共有模式数据矩阵，进行样品的相似度判别与评价。共有模式数据矩阵数据如表2所示：
表2清开灵多波长指纹图谱共有模式数据矩阵数据
| 相对保留时间 | 峰面积 | ||
| 238nm | 280nm | 330nm | |
| 4.7684.7796.2937.89310.27211.24311.65911.66913.19513.20514.10115.46718.34718.38920.45920.46921.14121.33321.37622.02723.69128.36329.06729.72830.93332.39542.2442.52843.37144.92846.30449.49349.50451.39252.17152.97153.61153.62154.73175.328 | 4536100000084401100557140926108669109384221089814201998911135709505544080077589200541039700101504447995601.09E+0800001010591031357014676526 | 038985688281734020553617910720302023175427316032415759523300044992800293555101634500000000244529902765330000334864218199607076680625855 | 03221000000000000103891000000540045426801042885231303201521172151123328821017297601.15E+0816786233287700119240832260720 |
2、清开灵多波长指纹图谱的应用
如图11a～d所示，是不同厂家清开灵注射液采用本发明的指纹图谱进行质控前与标准图谱进行相似度比较。各厂产品的指纹图谱基本反映出产品的原有状况，各厂家之间指纹图谱差异较大，相似度分别为0.958、0.780、0.650。
如图12a～d所示，是不同厂家清开灵注射液采用本发明的指纹图谱进行质控后相似度比较。经过指纹图谱指导下进行工艺改进，各厂家产品间指纹图谱趋于一致，相似度分别为0.974、0.941、0.925。
从以上说明可以看出，由本发明方法得到的多波长指纹图谱能够有效、全面、综合地反映中药产品的质量变异，可以有效地进行从药材、半成品到最终产品全过程的质量控制，使不同厂家能够生产出统一的、稳定的、相同质量的并达到质量标准的产品。
Claims (7)
1、一种多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：
(1)将中药样品进行制备，在色谱预选流动相体系中进行粗分，对其中较强的紫外吸收响应进行识别和认定，根据识别和认定的结果，确定样品的多个检测波长并跟踪响应，测定多级洗脱比例下容量因子和对应流动相比例关系；
(2)根据上述比例关系，确定在设定流动相体系下的梯度洗脱方法，进行实际样品测定，根据分离情况以及各个检测波长下色谱洗脱行为，进行整体优化，实时调整梯度洗脱曲线，最终按照跟踪响应的识别情况和容量因子分布，确定在1小时～1.5小时洗脱时间下的梯度曲线，从而确定该样品的指纹图谱测定方法；
(3)对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、测定范围以及耐用性；
(4)对不少于10批的实际样品进行测定，测定结果包括多个检测波长下的图谱及数据，对所述数据以保留时间纵向展开，对每个波长下所得相对峰面积值或峰高值进行一致性处理，建立测定样品的对应相对保留时间的相对峰面积值或峰高值的指纹图谱数据序列，对对应序列进行平均或取中位值，形成多个单波长下指纹图谱共有模式序列，然后进行多个波长下的数据整合，以所有全检测波长范围内可响应指纹峰对应的相对保留时间为列，各检测波长数据为行进行序列矩阵化，对应时间点无响应的位置以0填充，形成多波长指纹图谱共有模式数据矩阵；
(5)对相同的中药样品采取多种制备方式制备或采取多种检测方法对相同样品进行测定，并分别重复步骤(4)，将得到的多个数据矩阵进行差异比较，在此基础上对步骤(4)所得的数据进行层次化；
(6)对指纹图谱中的主要色谱峰进行指纹图谱定性；
(7)对指纹图谱中的主要色谱峰进行指纹图谱定量。
2、如权利要求1所述的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(6)中，所述指纹图谱定性包含三个推断层次，即①采用对照品对照定性；②采用已知结构对照物为参照，利用液相色谱/质谱联用中准分子离子或分子离子和相应碎片裂解规律和液相色谱/二极管阵列检测器的紫外吸收光谱特征推断指纹峰蕴含成分的结构类型，用于对指纹峰成分的推测；③采用液相色谱/质谱联用和液相色谱/二极管阵列检测器信息及保留值标识指纹峰代表的物质成分，用于标识指纹峰的基本化学信息包括指纹峰的保留值、实时紫外吸收光谱、以及可能的分子量和质谱碎片信息。
3、如权利要求1所述的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(7)中，所述指纹图谱定量包含三个层次，①采用对照品进行准确定量；②以准确定量指纹峰为参比，将推测具有相同结构类型的指纹峰与之比较，采用相对响应值进行定量；③采用百分响应值的方式，对用信息标识指纹峰进行量化控制。
4、如权利要求1所述的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(5)中，所述层次化是指按照响应大小或按照物质成分鉴别情况，进行数据分类，将相似差异变化的数据归并为一类，对相同类别指纹峰数据进行比较，选取其中可定量成分或者可定性的稳定成分峰为参照，对类中其它数据进行相对化处理，作为相对含量或相对特征比值进行指纹数据的量化处理结果，将不同层次量化处理结果填入数据矩阵中，即形成量化指纹图谱共有模式数据矩阵。
5、如权利要求1所述的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(5)中，所述多种制备方式包括冷浸法、温浸法、渗漉法、煎煮法、回流法、加压浸出、减压浸出、超声提取法、微波提取法、超临界提取法。
6、如权利要求1所述的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(4)中，所述一致性处理是指采用相对峰面积值或峰高值，进行保留时间的相对化处理，匹配相应测定批次的数据，并通过可定量的物质成分峰作为定点指标，识别共有指纹峰。
7、如权利要求1所述的多波长中药色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(4)中，所述多个检测波长下的图谱及数据是在各检测波长下同时测定得到或在相同条件不同波长下分别测定得到。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |