CN103499653A - 珍菊降压片的指纹图谱检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种珍菊降压片的指纹图谱检测方法及其应用，本发明的珍菊降压片的指纹图谱检测方法，包括下列步骤：供试品溶液的制备：将粉碎的供试品与体积百分比为30%以上的甲醇水溶液提取溶剂混匀后，超声30分钟以上，固液分离后获得供试品溶液；供试品溶液的测定：在适当的条件下，采用高效液相色谱法测定或获得供试品溶液的指纹图谱。本发明还进一步提供了上述指纹图谱检测方法用于珍菊降压片的质量检测或珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量测定的用途。本发明的方法不仅适用于珍菊降压片的成品的测定，也可用于指导生产过程控制或工艺改进。

Description

珍菊降压片的指纹图谱检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药材质量检测领域，尤其是珍菊降压片的指纹图谱检测方法及其应用。

背景技术

珍菊降压片现行标准收载于《中药成方制剂第20册》(WS3-B3925-98)，受研制时的技术水平限制，该标准仅规定了性状、鉴别，并按制剂通则进行常规项目检查，未制定主要药效成分的定量测定项目，难以做到质量可控，无法保证临床使用的有效性和安全性和质量可控性。近年来，随着产品的二次开发和仿制药研发的不断深入，研究人员在提高和完善珍菊降压片的质量控制方法方面做了大量有益的探索。

野菊花膏粉为珍菊降压片方中君药，系由野菊花提取所得，受药材质量波动影响，其质量也不稳定，因此要控制成品质量，就必须解决其中的野菊花相关成分的定量问题。在现有报道中，多是采用HPLC法单独或与盐酸可乐定、氢氯噻嗪等其他成分同时测定绿原酸、蒙花苷的含量（张志勇，林锋，于敬海.中西药复方制剂珍菊降压片的质量标准研究[J].哈尔滨医科大学学报200943(1)79-81.；鲁敏，龚青，金樟照，等.高效液相色谱法测定珍菊降压片中绿原酸、盐酸可乐定、氢氯噻嗪的含量及含量均匀度[J].中国现代应用药学杂志200623(6)495-497；郁健，叶晓镭.HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸的含量[J].南京中医药大学学报200420(4)237-238；陈翠英，袁子民，程岚，等.HPLC法测定珍菊降压片中蒙花苷含量[J].辽宁中医杂志200734(4)501-502；叶晓镭，支月芳，周萍.HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸、氢氯噻嗪及芦丁的含量[J].现代中药研究与实践20059(1)43-45.；程令梅，李桂冬.HPLC法测定珍菊降压片中野菊花绿原酸的含量[J].化学分析计量200716(1)48-50；宫钦红，阮健.珍菊降压片中绿原酸与氢氯噻嗪的含量测定[J].中国中药杂志201136(4)481-483），尚未见有关木犀草苷的含量测定，也未见同时测定两个或以上野菊花相关成分的报道。在高苏亚等（高苏亚，李华，曹晓芹.区带毛细管电泳法测定珍菊降压片有效成分的含量[J].时珍国医国药200819(11)1656-2567）采用区带毛细管电泳法测定珍菊降压片中盐酸可乐定和氢氯噻嗪含量的同时对芸香苷、绿原酸、木犀草素进行了含量测定。综上所述，目前有关珍菊降压片中野菊花相关成分的质量控制方法的研究做得还很不够深入。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种珍菊降压片的指纹图谱检测方法及其应用。

本发明首先提供了一种珍菊降压片的指纹图谱检测方法，包括下列步骤：

1）供试品溶液的制备：将粉碎的供试品与体积百分比为30%以上的甲醇水溶液提取溶剂混匀后，超声30分钟以上，固液分离后获得供试品溶液。

2）供试品溶液的测定：

采用高效液相色谱法测定或获得供试品溶液的指纹图谱；其中，高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：A相为乙睛，B相为磷酸水溶液，线性梯度洗脱，流动相中，A与B的体积比随时间逐渐增加；

检测波长：320-370nm，优选334nm；

柱温：25-40℃，优选30℃；

流速：0.8-1.2mL/min，优选1.0mL/min。

所述步骤1）中，

所述甲醇水溶液优选体积百分比为50-70%的甲醇水溶液，最优选体积百分比为50%的甲醇水溶液。

所述固液分离方法优选先高速离心，而后用微孔滤膜滤过的方法。

所述高速离心条件优选12000r/min离心10min。

所述微孔滤膜优选0.45μm微孔滤膜。

所述超声的时间优选30分钟。

本发明的供试品溶液的制备中，采用超声提取替换回流提取，并在固液分离中引入高速离心操作，使供试品溶液的制备更加简捷、高效，减少了操作误差，提高了日常检测的可操作性。

所述步骤2）中，

所述B相可选择体积百分比0.025-0.1%的磷酸水溶液，B相最优选体积百分比0.05%的磷酸水溶液。

所述线性梯度洗脱以A相：B相体积比为10:90-70:30梯度变化洗脱。

最优选满足下列条件：

表1梯度洗脱方法

上述珍菊降压片的指纹图谱检测方法可用于珍菊降压片的质量检测或珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量测定。

本发明还提供了一种同时检测珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量的测定方法，包括下列步骤：

a.供试品溶液的制备：与珍菊降压片的指纹图谱检测方法的步骤1）相同。

b.对照品溶液的制备：将绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分对照品用与步骤a）相同的甲醇水溶液制成对照品溶液。

c.检测：采用高效液相色谱法在相同色谱条件下分别检测供试品溶液与对照品溶液，并按外标一点法计算供试品溶液中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量，所述高效液相色谱法的色谱条件与珍菊降压片的指纹图谱检测方法的步骤2）相同。

本发明还提供了一种珍菊降压片的质量检测方法，包括采用前述珍菊降压片的指纹图谱检测方法获得供试品的指纹图谱，将得到的供试品的指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的珍菊降压片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算、强峰峰面积比及特定特征峰相对峰面积偏差计算。

待测珍菊降压片的质量是否符合要求，可根据将质量检测结果与质量判定标准比对后判定。

进一步的，所述指纹图谱检测方法中，供试品溶液的制备方法包括下列步骤：将粉碎的供试品与体积百分比为50%的甲醇水溶液提取溶剂按每0.25g样品粉末50ml甲醇水溶液的比例混匀并超声30分钟，高速离心（如：12000r/min10min）后，以0.45μm微孔滤膜过滤获得供试品溶液。

优选的，制备完成供试品溶液后的24小时内进行供试品的指纹图谱检测。

优选的，所述指纹图谱检测方法中，供试品溶液的测定中，高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：Kromasil C18色谱柱，5μm，4.6×250mm；

流动相：A相为乙睛，B相为体积百分比0.05%磷酸水溶液，按表1条件线性梯度洗脱；

检测波长：334nm；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min。

上样量：20μl

所述标准指纹图谱以18号峰为内参比峰，包括符合下列特征的23个共有指纹峰：

其中，峰面积百分比=（特征峰面积/总峰面积）×100%。

所述指纹图谱相似度计算时，剔除溶剂峰、5号峰与8号峰。

计算可采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》B版软件计算。

所述强峰峰面积比是指待测珍菊降压片的2、3、4、9、10、11、12、13、14、16、17、18和20号峰面积之和占总峰面积的比值。

特定特征峰相对峰面积是指13号峰和18号峰的相对峰面积。

所述总峰面积为除溶剂峰、5号峰与8号峰以外的峰面积之和。

所述质量判定标准可为：含有对应的23个特征峰，除溶剂峰、5号峰和8号峰外，供试品与对照指纹图谱相似度不得低于0.90；除溶剂峰和5、8号峰外，供试品中2、3、4、9、10、11、12、13、14、16、17、18、20号峰等13强峰的峰面积之和应不低于总峰面积的80%，13、18号峰相对峰面积偏差应不大于±25%。

进一步的，所述珍菊降压片的质量检测方法还包括采用前述同时检测珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量的测定方法检测供试品中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。

在质量检测方法包含绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量检测时，所述质量判定标准还包括：绿原酸含量应不低于200μg/片，木犀草苷含量应不低于50μg/片，蒙花苷含量应不低于250μg/片，氢氯噻嗪含量应为4.0～6.0mg/片，芦丁应为15.0～21.0mg/片。

本发明建立了能同时用于珍菊降压片成品指纹图谱和多个野菊花相关成分含量测定的测定方法，此方法专属性、系统适用性佳，精密度、重复性好，不仅适用于成品的测定，也可用于指导生产过程控制或工艺改进。

附图说明

图1  实施例1对照品溶液和供试品溶液的高效液相色谱图（3指标成分含量测定）

1.绿原酸（Chlorogenic Acid）  2.木犀草苷（Luteoloside）  3.蒙花苷（Buddleoside）

图2  实施例1对照品溶液和供试品溶液的高效液相色谱图（5指标成分含量测定）

1.绿原酸（Chlorogenic Acid）  2.氢氯噻嗪（Hydrochlorothiazide）  3.芦丁（Rutin）  4.木犀草苷（Luteoloside）  5.蒙花苷（Buddleoside）

图3  实施例2供试品溶液DAD光谱

图4  实施例2色谱峰定位图谱

图5  实施例2样品溶液稳定性考察图谱

图6  实施例2精密度实验图谱

图7  实施例2重复性实验图谱

图8  珍菊降压片指纹图谱共有模式（平均数）

图9  实施例2指纹图谱相关性研究图谱

图10  16批珍菊降压片的指纹图谱（建立共有模式）

图11  12批珍菊降压片的指纹图谱（工艺稳定性评价）

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1  珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁的含量测定

1.测定方法：

1.1色谱条件

仪器：Agilent1200高效液相色谱仪

色谱柱：Kromasil C18（5μm，4.6×250mm）

流动相：A相为乙睛，B相为0.05%磷酸水溶液，线性梯度洗脱（见表1）

流速：1.0mL/min  柱温：30℃  检测波长：334nm

表1  梯度洗脱方法

1.2溶液的制备

对照品溶液的制备（方法1）：取绿原酸、木犀草苷、蒙花苷对照品置五氧化二磷干燥器中真空干燥24小时；取木犀草苷对照品约10mg，精密称定，置100mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为木犀草苷储备液。取绿原酸对照品、蒙花苷对照品各10mg，精密称定，置250mL的量瓶中，精密加入木犀草苷储备液25mL，再加甲醇溶解（必要时可超声），定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。精密量取2.0mL对照品储备液，置10mL量瓶中，加2.0mL水，摇匀，冷至室温，用50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

对照品溶液的制备（方法2）：取绿原酸、木犀草苷、蒙花苷对照品置五氧化二磷干燥器中真空干燥24小时；取木犀草苷对照品约10mg，精密称定，置100mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为木犀草苷储备液。取氢氯噻嗪对照品约12.5mg，精密称定，置25mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为氢氯噻嗪储备液。取绿原酸对照品、蒙花苷对照品各10mg，精密称定，置250mL的量瓶中，精密加入木犀草苷储备液25mL，再加溶解（必要时可超声），定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。取芦丁对照品溶液10mh，精密称定，置25mL的量瓶中，精密加入5.0mL混合对照品储备液和5.0mL氢氯噻嗪储备液，溶解，摇匀，再加10.0mL水，摇匀，冷至室温，用50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品20片，称定平均片重，研成细粉，取细粉0.25g，精密称定，置磨口三角瓶中，精密加入50%甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声提取30min，用50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，离心（12000r/min，10min），上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.3测定法

精密量取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标一点法计算药材中各指标成分含量，即得。

2.样品前处理方法考察

由于制剂采用野菊花膏粉投料，待测成分的溶出不受细胞或组织结构的影响，因此提取方法选择超声法，并对提取溶剂、提取时间进行了考察。由于制剂处方中的珍珠层粉、淀粉以及膏粉中其他杂质的存在，使提取液浑浊、粘稠，增加了固液分离的难度，因此对提取液固液分离方法进行了单独考察。

2.1提取溶剂的选择

取本品细粉四份，每份0.25g，精密称定，置磨口三角瓶中，分别精密加入30%、50%、70%甲醇溶液和甲醇50mL，密塞，称定重量，超声提取30min；冷至室温，加提取溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶中，分别加70%、50%、30%甲醇溶液和水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过；取续滤液40μL进样测定，比较相对峰面积（峰面积与称样量的比值）大小，色谱条件同1.1。结果表明，50%甲醇溶液对各指标成分的提取效率最高，故选其为提取溶剂。见表2。

表2  提取溶剂选择实验结果

2.2提取时间的考察

取本品细粉四份，每份0.25g，精密称定，置磨口三角瓶中，精密加入50%甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，分别超声提取10、20、30、40min；冷至室温，加提取溶剂补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过；取续滤液20μL进样测定，比较相对峰面积（峰面积与称样量的比值）大小，色谱条件同1.1。结果表明，超声30min各指标成分即已提取完全，故确定提取时间为30min。见表3。

表3  提取时间考察实验结果

2.3固液分离方法考察

取超声后的提取液按以下方法处理：

1）直接用0.45μm微孔滤膜滤过；

2）先定量滤纸滤过，续滤液再用0.45μm微孔滤膜滤过；

3）先高速离心（12000r/min，10min），上清液再用0.45μm微孔滤膜滤过。

其他供试品溶液的制备的其他方面同1.2。

取三种方法得到的滤液进行测定，色谱条件及测定同1，结果表明所得峰面积无明显差异，但方法“1）”过滤阻力大，易致滤膜穿孔，滤液有微弱乳光；方法“2）”滤纸过滤耗时长，滤液浑浊，且微孔滤膜滤过仍有较大阻力，乳光也未完全消除；方法“3）”离心后上清液澄清透明，微孔滤膜滤过无明显阻力，滤液无乳光。综合考虑除杂效果和效率后，确定采用方法“3）”作为提取液固液分离方法。

3.方法学验证（采用1的测定方法）

3.1专属性和系统适用性试验

取对照品溶液和供试品溶液，依法测定，记录色谱图和DAD光谱，以绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的色谱峰计算，分离度均不低于2.0，理论塔板数均不低于20000，DAD光谱的峰纯度均不低于995。见图1和2。

3.2线性关系考察

分别精密量取对照品溶液（含绿原酸7.98μg/mL、木犀草苷1.53μg/mL、蒙花苷7.86μg/mL、氢氯噻嗪0.1021mg/mL、芦丁0.3620mg/mL）2μL、5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、100μL注入液相色谱仪，依法测定。以各指标成分进样量（ng）为横坐标，峰面积（mAU*S）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数以及线性范围。见表4。

表4  线性关系考察结果

备注：绿原酸、木犀草苷、蒙花苷采用2μL、5μL、10μL、20μL、40μL、100μL进样体积进行计算；氢氯噻嗪、芦丁采用2μL、5μL、10μL、20μL、30μL、40μL进样体积进行计算。

绿原酸回归方程为：y=2.5977x+6.2596，r=0.99998，在15.96～798.00ng范围内线性关系良好。木犀草苷回归方程为：y=2.563x-0.0631，r=0.99999，在3.06～153.00ng范围内线性关系良好。蒙花苷回归方程为y=2.1672x+0.3102，r=0.99999，在15.72～786.00ng范围内线性关系良好。氢氯噻嗪回归方程为y=287.56x+2.0851，r=0.99999，在0.20～4.08μg范围内线性关系良好。芦丁回归方程为y=1410.2x+22.961，r=0.99999，在0.72～14.48μg范围内线性关系良好。

3.3样品溶液稳定性考察

取同一份供试品溶液，分别于配制后0、6、12、18、24、36、48、72h测定，以各指标成分色谱峰的峰面积计算RSD值。结果表明，各指标成分RSD值均小于2.0%，说明供试品溶液在72h内稳定。见表5。

表5  样品溶液稳定性考察结果

3.4仪器精密度实验

取对照品溶液，重复测定6次，以各指标成分色谱峰的峰面积计算RSD值。结果表明，各指标成分RSD值均小于2.0%，仪器精密度符合规定。见表6。

表6

3.5重复性实验

取同一批珍菊降压片细粉（批号：101122），制备6份供试品溶液，依法测定并计算各指标成分含量及其RSD值。结果表明，各指标成分含量的RSD值均小于2.0%，该方法的重复性符合规定。见表7。

表7  重复性试验结果

3.6中间精密度实验

取同一批珍菊降压片细粉（批号：101122），依法测定各指标成分含量，考察不同日期、不同人员、不同仪器测定结果的精密度。结果表明，除不同仪器RSD稍大外，不同日期、不同人员所得各指标成分含量测定结果的RSD值均小于2.0%，该方法的中间精密度符合规定。见表8。

表8  中间精密度试验结果

3.7回收率

取珍菊降压片细粉（批号：101122）粉末6份，每份0.125g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入对照品储备液25mL，再精密加入水25mL、50%甲醇1.7mL（甲醇和水混合后的体积补偿），称定重量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算各指标成分回收率及其RSD值。结果表明，各指标成分回收率RSD值均小于2.0%，该方法的准确度符合规定。相关数据见表9、表10。

表9  回收率试验结果1

表10  回收率试验结果2

4.样品测定（采用1的测定方法）

取3批珍菊降压片大生产样品，依法测定其绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁的含量。见表11。

表11  3批珍菊降压片含量测定结果

根据目前累积的研究数据，可以暂定珍菊降压片中绿原酸含量应不低于200μg/片，木犀草苷含量应不低于50μg/片，蒙花苷含量应不低于250μg/片，氢氯噻嗪含量应为4.0～6.0mg/片，芦丁应为15.0～21.0mg/片。

5.讨论

采用本发明的方法检测珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁的含量，该方法专属性强，精密度、准确度良好，为成品中野菊花相关成分的含量控制提供了有效的检测手段。

实施例2  珍菊降压片指纹图谱的建立

1.检测方法：

1.1色谱条件

仪器：Agilent1200高效液相色谱仪

色谱柱：Kromasil C18（5μm，4.6×250mm）

流动相：A相为乙睛，B相为0.05%磷酸水溶液，线性梯度洗脱（见表1）

流速：1.0mL/min  柱温：30℃  检测波长：334nm

1.2溶液的制备

对照品溶液的制备：取绿原酸、木犀草苷、蒙花苷对照品置五氧化二磷干燥器中真空干燥24小时；取木犀草苷对照品约10mg，精密称定，置100mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为木犀草苷储备液。取绿原酸对照品、蒙花苷对照品各10mg，精密称定，置250mL的量瓶中，精密加入木犀草苷储备液25mL，再加甲醇溶解（必要时可超声），定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取2.0mL对照品储备液，置10mL量瓶中，加2.0mL水，摇匀，冷至室温，用50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品20片，称定平均片重，研成细粉，取细粉0.25g，精密称定，置磨口三角瓶中，精密加入50%甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声提取30min，用50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，离心（12000r/min，10min），上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

色谱峰定位用对照品溶液制备取盐酸可乐定、绿原酸、氢氯噻嗪、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、蒙花苷、木犀草素对照品，用50%甲醇溶液配制成适当浓度的混合对照品溶液和各单一对照品溶液。

1.3测定法

取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录60分钟内色谱图，按《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》B版软件计算相似度、特征峰相对峰面积。按面积归一化法计算13强峰占总峰面积的百分比。

2.方法学验证

2.1专属性和系统适用性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液及色谱峰定位用对照品溶液，采集色谱图和DAD光谱，对供试品色谱中各对照品对应色谱峰进行归属，并计算理论塔板数、分离度和峰纯度。见图3、4。

结果表明，除盐酸可乐定不能未出峰外，供试品色谱中各对照品色谱峰理论塔板数均大于20000、分离度均大于2.0、峰纯度均大于995，该方法专属性符合指纹图谱测定要求。该方法可以对绿原酸、氢氯噻嗪、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、蒙花苷、木犀草素等成分定性。

2.2样品溶液稳定性考察

取同一份供试品溶液，分别于制备后0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h测定指纹图谱（见图5）。将各时间点图谱与0h图谱进行比较，相似度分别为1.000、0.999、0.998、0.996、0.993、0.988、0.983、0.976，呈明显下降趋势。

对图谱进行分析后发现，图谱中紧邻木犀草素的色谱峰（图中箭头所指），随放置时间延长，呈显著下降趋势，这可能是导致相似度下降的原因。样品溶液放置24h时的相似度大于0.990，因此在进行指纹图谱研究时，样品溶液应在24h内完成测定。

2.3精密度实验

取同一份供试品溶液，重复测定6次，将所得图谱进行相似度比较，结果各图谱相似度均为1.000，说明该方法精密度良好，符合指纹图谱测定要求。见图6。

2.4重复性试验

取同一批珍菊降压片细粉6份，依法测定，将所得图谱进行相似度比较，结果各图谱相似度均为1.000，说明该方法重复性良好，符合指纹图谱测定要求。见图7。

3.指纹图谱的建立

取野菊花膏粉分别由不同来源的16批珍菊降压片（其投料用野菊花制备），制备供试品溶液，并进行色谱测定，将测定结果用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》A版软件处理，生成珍菊降压片HPLC指纹图谱共有模式（见图8），标定23个共有指纹峰（见表10）。

以蒙花苷色谱峰（18号峰，S峰）为内参比峰，在不含溶剂峰和5、8号峰面积的情况下，2、3、4、9、10、11、12、13、14、16、17、18、20号峰面积和超过总峰面积的80%，定为13强峰；13、18号峰面积超过总峰面积的10%，规定其相对峰面积偏差不大于±25%。

根据26批珍菊降压片样品指纹图谱分析结果，暂定本品的质量判定标准为；按《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》B版软件计算，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有对应的23个特征峰；除溶剂峰和5、8号峰外，供试品与对照指纹图谱相似度不得低于0.90；除溶剂峰和5、8号峰外，供试品中2、3、4、9、10、11、12、13、14、16、17、18、20号峰等13强峰的峰面积之和应不低于总峰面积的80%，13、18号峰相对峰面积偏差应不大于±25%。

表11  珍菊降压片指纹图谱特征峰参数

4.指纹图谱关联性研究

取来源相同的野菊花药材、膏粉和珍菊颗粒、成品，按下列方法制备相应的供试品溶液：

1）野菊花溶液的制备：取野菊花细粉0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50%甲醇溶液50mL，称定重量，80℃回流2h，冷至室温，加50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2）珍菊成品溶液的制备：取珍菊降压片细粉0.25g，按“1.2”项下方法制备，即得。

3）珍菊颗粒溶液的制备：取珍菊降压片颗粒细粉0.25g，与珍菊成品同法制备，即得。

4）野菊花膏粉溶液的制备：取野菊花膏粉0.1g，与珍菊成品同法制备，即得。

取上述溶液各20μL（野菊花溶液10μL）注入液相色谱仪，按“1.1”项下色谱条件测定指纹图谱（见图9）

如图8所示，野菊花图谱中01、05、06、07、08位的峰在膏粉图谱中明显减弱，甚至消失，02-03位和04-05位的峰在高峰图谱中比例明显发生改变，膏粉图谱中11、12位的峰在野菊花图谱中未出峰，说明野菊花在提取过程发生了明显的成分转化。颗粒与成品的图谱一致，说明在成型过程中无成分转化。成品图谱中21、22、23、24、25、27位的峰都是颗粒和成品中独有，26位的峰与膏粉、野菊花相比含量明显增加，说明这些成分都是由制剂处方或工艺中引入。需要特别说明的是27位峰在样品溶液稳定性试验中随时间发生明显衰减，提示其稳定性较差。

5.样品的指纹图谱分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》B版软件，对建立共有模式用的16批珍菊降压片进行指纹图谱分析，指纹图谱见图10。

16批珍菊降压片指纹图谱相似度计算结果表明，除一批外，其余15批样品相似度均大于0.90，其中5批大于相似度0.99，因此可暂定相似度限度标准为不小于0.90；13强峰峰面积比值计算结果表明，除三批外，其余各批13强峰峰面积之和均超过总峰面积的80%，因此可暂定13强峰峰面积之和应不低于总峰面积的80%。

6.指纹图谱用于评价工艺的稳定性

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》B版软件，对用于评价工艺稳定性的12批珍菊降压片的进行指纹图谱分析，指纹图谱见图11。

相似度计算结果表明，101122、101123、101124三批产品采用同一批野菊花膏粉投料，其相互间相似度均大于0.99，说明制剂工艺相对稳定；110513、110517、110521、110524、110525、110528、110532、110537、110540等9批产品为分别采用同一批野菊花药材提取所得的9批野菊花膏粉投料，其相互间相似度均大于0.90，说明野菊花膏粉的提取工艺也相对稳定。

7.讨论

1）图谱分析在珍菊降压片指纹图谱测定条件下，其中芦丁和氢氯噻嗪的峰面积分别占到总峰面积的74%和5%，由于其所占比重太大，若将其带入计算，则几乎所有样品的相似度均为1.000，将严重削弱了指纹图谱对产品质量的判别能力，因此在进行指纹图谱相似度计算和13强峰峰面积的比值时将芦丁和氢氯噻嗪色谱峰剔除。

2）工艺的过程控制指纹图谱关联性研究结果显示，本发明所建立珍菊降压片指纹图谱方法，可适用于野菊花药材、膏粉和珍菊颗粒、成品的测定，若将其作为生产过程控制的监控手段，则有利于及时发现生产过程中出现的偏差，有效避免或减少质量事故的发生。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (13)

1.一种珍菊降压片的指纹图谱检测方法，包括下列步骤：

1）供试品溶液的制备：将粉碎的供试品与体积百分比为30%以上的甲醇水溶液提取溶剂混匀后，超声30分钟以上，固液分离后获得供试品溶液；

2）供试品溶液的测定：

采用高效液相色谱法测定或获得供试品溶液的指纹图谱；其中，高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：A相为乙睛，B相为磷酸水溶液，线性梯度洗脱，流动相中，A与B的体积比随时间逐渐增加；

检测波长：320-370nm；

柱温：25-40℃；

流速：0.8-1.2mL/min。

2.如权利要求1所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述甲醇水溶液优选体积百分比为50-70%的甲醇水溶液，最优选体积百分比为50%的甲醇水溶液。

3.如权利要求1所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述固液分离方法为先高速离心，而后用微孔滤膜滤过的方法。

4.如权利要求1所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述超声的时间为30分钟。

5.如权利要求1所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述B相为体积百分比0.025-0.1%的磷酸水溶液，B相优选体积百分比0.05%的磷酸水溶液。

6.如权利要求1所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述线性梯度洗脱以A相：B相体积比为10:90-70:30梯度变化洗脱。

7.如权利要求1所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，检测波长为334nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min。

8.如权利要求1-7任一权利要求所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法的用途，其特征在于，将所述指纹图谱检测方法用于珍菊降压片的质量检测或珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量测定。

9.一种同时检测珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量的测定方法，包括下列步骤：

a.供试品溶液的制备：采用权利要求1-7任一权利要求所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法中的步骤1）制备；

b.对照品溶液的制备：将绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分对照品用与步骤a）相同的甲醇水溶液制成对照品溶液；

c.检测：采用高效液相色谱法在相同色谱条件下分别检测供试品溶液与对照品溶液，并按外标一点法计算供试品溶液中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量，所述高效液相色谱法的色谱条件采用权利要求1-7任一权利要求所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法的色谱条件。

10.一种珍菊降压片的质量检测方法，包括采用权利要求1-7任一权利要求所述珍菊降压片的指纹图谱检测方法获得供试品的指纹图谱，将得到的供试品的指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的珍菊降压片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算、强峰峰面积比及特定特征峰相对峰面积偏差计算。

11.如权利要求10所述珍菊降压片的质量检测方法，其特征在于，所述标准指纹图谱以18号峰为内参比峰，包括符合下列特征的23个共有指纹峰：

其中，峰面积百分比=（特征峰面积/总峰面积）×100%

所述总峰面积为除溶剂峰、5号峰与8号峰以外的峰面积之和。

12.如权利要求11所述珍菊降压片的质量检测方法，其特征在于，所述指纹图谱相似度计算时，剔除溶剂峰、5号峰与8号峰；所述强峰峰面积比是指待测珍菊降压片的2、3、4、9、10、11、12、13、14、16、17、18和20号峰面积之和占总峰面积的比值；特定特征峰相对峰面积是指13号峰和18号峰的相对峰面积。

13.如权利要求11所述珍菊降压片的质量检测方法，其特征在于，还包括采用权利要求9所述同时检测珍菊降压片中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量的测定方法检测供试品中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、氢氯噻嗪、芦丁等任意一种或几种成分的含量。

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