CN112461948A - 一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法 - Google Patents

一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法 Download PDF

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覃旭
吴密
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陈庆南
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Abstract

本发明公开了一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法，包括以下步骤：S1.将锯叶棕果肉干燥、粉碎，用乙醇提取，然后加水定容，得多糖提取液；S2.建立标准曲线，将葡萄糖加水溶解，制成标准溶液，测吸光度，制作标准曲线；S3.取多糖提取液，测吸光度值，计算多糖含量；S4.多糖水解及衍生化；S5.制作单糖标准曲线；S6.HPLC测定锯叶棕果实多糖中的单糖组成。通过本发明能快速分析出锯叶棕果实中的多糖成分及单糖组成。

Description

一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法
技术领域
本发明涉及锯叶棕成分分析技术领域，尤其是一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法。
背景技术
锯叶棕，又名锯棕叶或锯棕榈，属于棕榈科锯叶棕属，是一种常见的棕榈科植物，通常生长在北美洲气候炎热的地区。它是锯叶棕属唯一代表植物，是一种重要的药用棕榈植物，同时也可作为观赏植物，供庭院种植。
据《美国药典》、《英国药典》及文献记载，锯叶棕的果实有抗菌消炎、祛痰平喘、镇静、解痉、调节内分泌、催欲生Chemicalbook精、促进乳房生长发育和泌乳能力、利尿、促进食欲以及抗肿瘤之效。可治疗酒精中毒、头痛、风湿病等50多种疾病。
锯叶棕果实中除含有大量的油脂成分，还含有多糖、氨基酸、黄酮类物质等，为在原料环节对锯叶棕果实的质量进行控制，建立其中成分的分析方法是非常有必要的。
发明内容
本发明公开了一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法，能快速分析出锯叶棕果实中的多糖成分及单糖组成。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法，包括以下步骤：
S1.将锯叶棕果肉干燥、粉碎，用乙醇提取，然后加水定容，得多糖提取液；
S2.建立多糖标准曲线，将葡萄糖加水溶解，制成标准溶液，并向每1.0mL的标准溶液中加入1.0 mL5wt%苯酚溶液，再加入5.0 mL硫酸，静置9~20min，振荡混合，然后置于28~35℃的水浴中反应15~30min，490 nm测吸光度，制作标准曲线；
S3.取多糖提取液，按照步骤S2溶液处理及检测吸光度的步骤进行操作，测得吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量；
S4.多糖水解及衍生化；
S5.制作单糖标准曲线；
S6.HPLC测定锯叶棕果实多糖中的单糖组成。
进一步的，所述步骤S4具体包括：将多糖提取液进行冷冻干燥，称取冻干的多糖样品2 mg，加入2 mol/L 三氟乙酸溶液0.5 mL，在120℃条件下水解120 min；吹干；
向水解吹干后的单糖样品加入溶于无水甲醇的0.5mol/L 的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮试剂和 0.3 mol/L的NaOH 溶液各0.5mL，充分混匀后，水浴 70℃ 反应 30 min；冷却至室温，加入 0.3 mol/L HCl 溶液0.5 ml，充分混匀；加入1 ml 氯仿，震荡萃取，离心去除氯仿层，萃取2~3次，水层用 0.22μm滤膜过滤后，得单糖提取液。
进一步的，所述步骤S5具体包括：配制10mg/mL单糖标准品，放置于-20℃，用时取出融化，在可以密封的容器中加入所述单糖标准品各5μL，混匀；然后加入2 mol/L TFA溶液0.5 mL，与多糖样品同时在120℃条件下水解120 min，空气泵吹干。
进一步的，所述步骤S5中，HPLC的色谱条件为：色谱柱：Thermo ODS-2 C18柱，4.6×250 mm, 5 μm；流动相为 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液:乙腈的体积比为 82:18；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；进样量10 μL，检测波长为245 nm。
进一步的，所述步骤S1具体包括：加入水浸润锯叶棕果实，再加入乙醇，超声提取，提取完成后离心，弃去上清液，不溶物用乙醇溶液洗涤、离心；用水将不溶物转移入容器中，于沸水浴中提取，冷却至室温，过滤，将滤液转移至容量瓶中，残渣洗涤2~3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容，得多糖提取液。
更进一步的，所述步骤S1具体包括：称取1.0g锯叶棕果实粉末样品，过40目筛，置于具塞离心管内，用5 mL水浸润所述锯叶棕果实粉末样品，加入20 mL无水乙醇，振摇，混合均匀，超声提取30 ~40min；提取结束后，离心，弃去上清液；不溶物用乙醇溶液洗涤、离心；用水将所述不溶物转移入烧瓶，加人蒸馏水，沸水浴中提取2~3h；冷却至室温，过滤，将上清液转移至容量瓶中，残渣洗涤2~3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容，得多糖提取液。
以上所述的锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法，能快速检测出锯叶棕果实中的多糖成分及单糖组成，可测得锯叶棕果实中含有6种单糖成分，且分离效果好，能为锯叶棕果实质量的控制，以及确保锯叶棕果实相关药物临床使用疗效，提供必要的理论保证。
附图说明
图1是多糖水解后的PMP-衍生物HPLC色谱图。
其中，甘露糖1，鼠李糖2，葡萄糖3，半乳糖4，木糖5，阿拉伯糖6。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器设备
材料：锯叶棕果实，采摘于广西壮族自治区亚热带作物研究所种质资源圃中引种成活的锯叶棕，去果核后的果肉置于35℃的鼓风干燥箱中鼓风干燥，经粉碎过40目筛后装袋备用；
试剂：硫酸(H2SO4) 、无水乙醇(C2H6O）、苯酚(C6H6O）、80%乙醇溶液、葡萄糖(C6H12O6)、三氟乙酸、乙腈（色谱纯）、磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）、单糖标准品等。
主要仪器设备：可见分光光度计、分析天平（感量为0.001g）、超声提取器、离心机、Waters 1525HPLC 液相色谱仪。
1.2试验方法
S1. 锯叶棕果实多糖提取液的制备
称取1.0g过40目筛的果实粉末样品，精确到0.001g，置于50 mL具塞离心管内。用5 mL水浸润锯叶棕果实粉末样品，缓慢加入20 mL无水乙醇，同时使用涡旋振荡器振摇，使混合均匀，置超声提取器中超声提取30 min。提取结束后，于4000r/min离心10 min，弃去上清液；不溶物用10 mL乙醇溶液洗涤、离心。用水将所述不溶物转移入圆底烧瓶，加人50 mL蒸馏水，装上磨口的空气冷凝管，于沸水浴中提取2h。冷却至室温，过滤，将上清液转移至100mL容量瓶中，残渣洗涤2~3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容，此溶液为多糖提取液。
S2. 多糖标准曲线的建立：称取0.1000g葡萄糖于100 mL烧杯中，加水溶解，定容至1000mL，配制成100 mg/L葡萄糖标准溶液，并置于4℃冰箱中贮存。分别吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖标准溶液，置20 mL具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1.0mL。向试液中加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10 min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20 min，490 nm测吸光度。以葡聚糖或葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。
S3. 吸取1.00 mL多糖提取液于20 mL具塞试管中，按葡萄糖标准曲线建立步骤进行同样的操作，测定吸光度，同时以不加提取液的试管液作为空白调零，根据吸光度值和标准曲线计算多糖含量。
S4. 多糖水解及衍生化
完全酸水解：将上述操作得到的多糖提取液进行冷冻干燥，之后称取冻干的多糖样品2mg，加入2 mol/L 三氟乙酸溶液0.5 mL，在120℃条件下水解120 min；氮吹仪吹干。
PMP衍生化：向水解干燥后得到的单糖样品中加入溶于无水甲醇的0.5mol/L 的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 试剂和 0.3 mol/L的NaOH 溶液各0.5 ml，充分混匀后，水浴 70℃ 反应 30 min；冷却至室温，加入 0.3 mol/L HCl溶液 0.5 ml，充分混匀；加入1ml 氯仿，充分震荡萃取，离心（5000 rpm，5 min）去除氯仿层，共萃取三次。水层（不低于0.4ml）用 0.22μm滤膜过滤后，得单糖提取液待上机。
S5. 标准品处理：首先配制10mg/ml单糖标准品，放置于-20℃；用时取出融化，在可以密封的玻璃管中加入上述单糖标准品各5μL，混匀；然后加入2 mol/L TFA溶液0.5 mL，与多糖提取液样品同时在120℃条件下水解120 min，空气泵吹干。
S6. HPLC色谱条件：色谱柱：Thermo ODS-2 C18柱（4.6×250 mm, 5 μm）；流动相为 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液(PB):乙腈为 82:18（v/v）；流速为每分钟1.0 mL/min；柱温为25℃；进样量10 μL，检测波长为245 nm。
2检测结果与分析
2.1锯叶棕果实粗多糖的提取结果
经上述提取方法提取，分光光度计测量并葡萄糖标品标准曲线换算得到多糖提取液的浓度为97μg/ml，多糖提取液的定容体积为100ml。
多糖提取率的计算公式如下：
多糖提取率=[(c*v)/m]×100%
该公式中：m，果实干粉原料质量；c，经标准曲线换算的样液浓度；v，多糖提取液的定容体积。
经公式计算锯叶棕果实多糖提取率为0.97%。
2.2单糖组成及含量测定分析结果
锯叶棕果实粗多糖水解产物PMP衍生物的高效液相色谱图如图1，由图1可知，粗多糖水解后各种单糖PMP衍生物均实现了良好的分离。锯叶棕果实粗多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖6种单糖组成。用单糖对照品溶液制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，按上述方法进行衍生及色谱分析。以对照品溶液各单糖的峰面积(Y) 对相应进样量(X)，进行线性回归，得到各单糖的回归方程、相关系数及线性范围，见表1。由果实多糖组分中各单糖的峰面积，计算得到果实多糖中各单糖含量（见表2），各个单糖组分甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的摩尔比为0.04：0.14：0.26：0.40：0.65：0.04。
表1 6种单糖的标准曲线
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2 多糖样品中6种单糖相对含量
Figure DEST_PATH_IMAGE004

Claims (6)

1.一种锯叶棕果实中多糖成分及单糖组成的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.将锯叶棕果肉干燥、粉碎，用乙醇提取，然后加水定容，得多糖提取液；
S2.建立多糖标准曲线，将葡萄糖加水溶解，制成标准溶液，并向每1.0mL的标准溶液中加入1.0 mL5wt%苯酚溶液，再加入5.0 mL硫酸，静置9~20min，振荡混合，然后置于28~35℃的水浴中反应15~30min，490 nm测吸光度，制作标准曲线；
S3.取多糖提取液，按照步骤S2溶液处理及检测吸光度的步骤进行操作，测得吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量；
S4.多糖水解及衍生化；
S5.制作单糖标准曲线；
S6.HPLC测定锯叶棕果实多糖中的单糖组成。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
所述步骤S4具体包括：将多糖提取液进行冷冻干燥，称取冻干的多糖样品2 mg，加入2mol/L 三氟乙酸溶液0.5 mL，在120℃条件下水解120 min；吹干；
向水解吹干后的单糖样品加入溶于无水甲醇的0.5mol/L 的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮试剂和 0.3 mol/L的NaOH 溶液各0.5mL，充分混匀后，水浴 70℃ 反应 30 min；冷却至室温，加入 0.3 mol/L HCl 溶液0.5 ml，充分混匀；加入1 ml 氯仿，震荡萃取，离心去除氯仿层，萃取2~3次，水层用 0.22μm滤膜过滤后，得单糖提取液。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：
所述步骤S5具体包括：配制10mg/mL单糖标准品，放置于-20℃，用时取出融化，在可以密封的容器中加入所述单糖标准品各5μL，混匀；然后加入2 mol/L TFA溶液0.5 mL，与多糖样品同时在120℃条件下水解120 min，空气泵吹干。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
所述步骤S5中，HPLC的色谱条件为：色谱柱：Thermo ODS-2 C18柱，4.6×250 mm, 5 μm；流动相为 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液:乙腈的体积比为 82:18；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；进样量10 μL，检测波长为245 nm。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
所述步骤S1具体包括：加入水浸润锯叶棕果实，再加入乙醇，超声提取，提取完成后离心，弃去上清液，不溶物用乙醇溶液洗涤、离心；用水将不溶物转移入容器中，于沸水浴中提取，冷却至室温，过滤，将滤液转移至容量瓶中，残渣洗涤2~3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容，得多糖提取液。
6.根据权利要求1或5所述的测定方法，其特征在于：
所述步骤S1具体包括：称取1.0g锯叶棕果实粉末样品，过40目筛，置于具塞离心管内，用5 mL水浸润所述锯叶棕果实粉末样品，加入20 mL无水乙醇，振摇，混合均匀，超声提取30~40min；提取结束后，离心，弃去上清液；不溶物用乙醇溶液洗涤、离心；用水将所述不溶物转移入烧瓶，加人蒸馏水，沸水浴中提取2~3h；冷却至室温，过滤，将上清液转移至容量瓶中，残渣洗涤2~3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容，得多糖提取液。
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