一种对乳或乳制品中酵母β-葡聚糖进行前处理的方法
技术领域
本发明涉及一种前处理方法,特别是一种对乳或乳制品中酵母β-葡聚糖进行前处理的方法。
背景技术
酵母β-葡聚糖(yeast beta glucan)是一种从酵母细胞壁中提取的葡萄糖聚合物,其分子结构主链包含β-1,3-D糖苷键,而支链包含β-1,6-D糖苷键,两者之比约为85:15。酵母β-葡聚糖的线性分子聚合度为1500、分子量约为240kDa,支链分子聚合度为140、分子量约为22kDa。酵母β-葡聚糖作为重要的食品膳食纤维来源,具有增强免疫力、防氧化辐射、抗肿瘤炎症、降低血脂胆固醇、促进伤口愈合等诸多营养价值和生理功能。2010年6月卫生部9号公告批准酵母β-葡聚糖作为新资源食品,2012年卫生部6号公告批准酵母β-葡聚糖用作食品添加剂(营养强化剂)。作为原料,酵母β-葡聚糖在食品和保健品中的应用更为广泛。饮用添加酵母β-葡聚糖的牛乳中可实现增强免疫力的功效。
由于酵母β-葡聚糖是一种水不溶性多糖,并与甘露聚糖、蛋白或几丁质等物质相互结合,其测定方法一直是个研究难点。传统的苯酚-硫酸法由于灵敏度较低,且易受其它多糖或单糖的干扰,测定结果不准确。为了改善测定结果的准确性,增加了对酵母β-葡聚糖进行前处理的步骤,利用所述前处理步骤将β-葡聚糖转化为易于测定的葡萄糖,再通过高效液相色谱法或离子色谱法等对前处理步骤获得的葡萄糖进行测定。所述前处理可以是例如利用强酸将葡聚糖水解为葡萄糖([非专利文献1]),或在碱性条件下将酵母细胞壁中的β-葡聚糖和甘露寡糖解离成阴离子([非专利文献2])。前处理步骤使得不需要预先衍生就能分析几乎所有的单糖和大部分的寡糖及低聚糖。
特别地,对于在乳或乳制品中添加酵母β-葡聚糖而言,由于在加工过程中为了防止脂肪球上浮,会采用高速剪切均质破碎乳品中的脂肪颗粒,不溶于水的葡聚糖颗粒也遭到破坏。此外,乳品基质极其复杂,其中的脂肪球、蛋白束、稳定剂和香精配料都将影响对酵母β-葡聚糖的提取与纯化,因此如何准确测定乳和乳制品中的酵母β-葡聚糖仍是具有挑战性的课题。目前,只有AOAC 32.2.10标准《AOAC Official Method995.16β-D-Glucan inBarley and Oats》和农业行业标准NY/T 2006-2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》对水溶性β-葡聚糖的检测进行了标准化,但对于水不溶性β-葡聚糖,特别是乳和乳制品中的酵母β-葡聚糖,国内外均缺少的成熟的检测标准和相关技术。
因此,如何对含有酵母β-葡聚糖的乳或乳制品进行前处理,从而获得准确可复现的检测结果,仍是亟待解决的问题。
[非专利文献1]:牛乳中酵母β-葡聚糖的应用与测定,付俊鹤等,《食品工业科技》2013年第4期;
[非专利文献2]:离子色谱—脉冲安培检测法测定酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露寡糖,李仁勇等,《食品与发酵工业》20008年第12期。
发明内容
发明人通过实验发现,添加有酵母β-葡聚糖的乳或乳制品在经过高速剪切均质破碎脂肪后,酵母β-葡聚糖颗粒的直径由最初的数十微米缩小至1.0μm以下,大部分集中在0.5至0.7μm(图1)。
因此,针对如上所述的技术问题,本发明提供了一种对乳或乳制品中酵母β-葡聚糖进行前处理的方法。具体而言,本发明的前处理方法包括如下步骤:
(1)蛋白酶解:用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对乳或乳制品进行酶解;
(2)滤器过滤分离:采用滤器对步骤(1)获得的酶解液进行过滤;
(3)酸解:向步骤(2)获得的截留物中加入一元酸进行加热水解。
具体而言,本发明是通过如下技术方案实现的:
1.一种对乳或乳制品中酵母β-葡聚糖进行前处理的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)蛋白酶解:用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对乳或乳制品进行酶解;
(2)滤器过滤分离:采用滤器对步骤(1)获得的酶解液进行过滤;
(3)酸解:向步骤(2)获得的截留物中加入一元酸进行加热水解。
2.如段落1所述的方法,其中,所述步骤(1)中,所述中性蛋白酶为所述碱性蛋白酶为
3.如段落1或2所述的方法,其中,所述步骤(1)中,处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述中性蛋白酶的酶活力为1.0×10-4AU/mL至1.0×10-3AU/mL,和/或处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述碱性蛋白酶的酶活力为2.8×10-4AU/mL至2.8×10-3AU/mL。
4.如段落1-3中任一项所述的方法,其中,所述步骤(1)中,所述中性蛋白酶的酶活力为5.0×10-4AU/mL,所述碱性蛋白酶的酶活力为1.4×10-3AU/mL。
5.如段落1-4中任一项所述的方法,其中,所述步骤(1)中,所述酶解的酶解温度为40~50℃。
6.如段落5所述的方法,其中,所述步骤(1)中,所述酶解的酶解温度为45℃。
7.如段落1-6中任一项所述的方法,其中,所述步骤(1)中,所述酶解的酶解时间为0.5~6小时。
8.如段落7所述的方法,其中,所述步骤(1)中,所述酶解的酶解时间为2小时。
9.如段落1-8中任一项所述的方法,其中,所述步骤(2)中,所述滤器为滤膜和/或滤纸。
10.如段落9所述的方法,其中,所述滤器为双层玻纤滤纸。
11.如段落1-10中任一项所述的方法,其中,所述步骤(2)中,所述滤器的孔径为0.7~0.8μm。
12.如段落1-10中任一项所述的方法,其中,在实施所述步骤(2)之前,使用加热的碱溶液对所述步骤(1)获得的蛋白酶解液进行稀释。
13.如段落12所述的方法,其中,所述碱溶液为8-12mmol/L的NaOH水溶液。
14.如段落13所述的方法,其中,所述碱溶液为10mmol/L的NaOH水溶液。
15.如段落1-14中任一项所述的方法,其中,所述碱溶液的温度是70-90℃。
16.如段落15所述的方法,其中,所述碱溶液的温度是80℃。
17.如段落12-16中任一项所述的方法,其中,所述稀释为等体积稀释。
18.如段落12-17中任一项所述的方法,其中,所述步骤(2)中,所述滤器的孔径为0.7~1.6μm。
19.如段落18所述的方法,其中,所述滤器的孔径为0.7μm。
20.如段落1-19中任一项所述的方法,其中,在所述步骤(2)中的过滤完成后,利用纯水或去离子水对截留物进行负压抽滤水洗。
21.如段落1-20中任一项所述的方法,其中,所述步骤(3)中,所述一元酸使用浓度为1mol/L的盐酸。
22.如段落1-21中任一项所述的方法,其中,所述步骤(3)中,所述加热水解的时间为0.5~2小时。
23.如段落22所述的方法,其中,所述步骤(3)中,所述加热水解的时间为1小时。
24.如段落1-23中任一项所述的方法,其中,所述步骤(3)中,所述加热水解的温度为110~130℃。
25.如段落24所述的方法,其中,所述步骤(3)中,所述加热水解的温度为121℃。
有益效果
本发明人发现,结合利用酶解、滤器过滤分离以及酸解的前处理步骤,能够直接将酵母β-葡聚糖从乳或乳制品中提取出来,所获得的产物中蛋白、乳糖和其他小分子含量低,从而在其后的分析步骤中不需考虑乳液中蛋白和其他小分子化合物干扰。这样的前处理步骤提高了水不溶性酵母β-葡聚糖从乳或乳制品中的提取率。
具体而言,首先,使用蛋白酶对乳或乳制品样品进行蛋白酶解处理可显著降低测定中乳或乳制品中的蛋白对葡聚糖的干扰。因此,在本发明的前处理步骤中,使用蛋白酶消化乳或乳制品中含有的大量蛋白。例如,牛乳中蛋白的含量约占全乳的3.3%~3.5%,其种类主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和一些具有重要生理功能的酶类,其中酪蛋白占蛋白总重的78.8%。采用蛋白酶酶解蛋白,可将蛋白或多肽链中的肽键进行全部或部分拆分,使其变成小分子量的肽类或氨基酸。蛋白四级结构的破坏将有助于被包裹的葡聚糖的析出,从而提高提取效率。然而,由于单酶水解能力有限、水解度不高,采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶协同水解可在较短时间内获得较高水解度,生成相对分子量较小的多肽。
随后,在滤器过滤分离步骤中,通过选择合适的过滤孔径,实现对葡聚糖颗粒的有效截留,并滤除小分子干扰物,通过水洗有效去除葡聚糖表面附着的乳糖、淀粉辅料以及内源性小分子,提高样品前处理方法回收率。
在采用一元酸对葡聚糖进行水解的过程中,一元酸对离子色谱分离干扰小,并能够获得较高的葡萄糖转化率。通过控制加热水解的时间和温度,能够减少对生成的葡萄糖的破坏作用,从而有效提高葡萄糖的转化率。
利用本发明的前处理方法对样本进行处理,回收率达到92.7~108.0%,远高于其他前处理方法,并且检测灵敏度和选择性也均优于不使用本发明的前处理方法。
附图说明
图1示出牛乳中β-葡聚糖的扫描电镜图(5000×)。箭头所示为不同葡聚糖颗粒的线度。
图2示出对利用本发明实施例2的前处理方法获得的样品进行检测所获得回收率的复现性。
图3A-3C示出使用离子色谱的检测方法,对根据本发明前处理方法进行处理后的样品中酵母β-葡萄聚糖的含量进行测量所获得的离子色谱图。图3A为含有5μg/mL半乳糖和5μg/mL葡萄糖的标准溶液的离子色谱图;图3B为未添加酵母β-葡聚糖的空白对照牛奶样品的离子色谱图;图3C为对根据本发明实施例2的前处理方法的20g添加有酵母β-葡聚糖的牛奶样品的离子色谱图。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
本发明所使用的术语“乳或乳制品”包括牛乳、羊乳、水牛乳、马乳等,还包括以牛乳、羊乳、水牛乳、马乳等为原料制成的鲜乳、乳粉、炼乳、奶油、干酪、干酪素和乳糖等制品。优选地,本发明的乳或乳制品为牛乳。
本发明所使用的术语“酵母β-葡聚糖”是提取自食用酵母细胞壁的结构性多糖。优选地,本发明的酵母β-葡聚糖为酿酒酵母β-葡聚糖。
在所述步骤(1)蛋白酶解步骤中,所述中性蛋白酶优选为碱性蛋白酶优选为在优选的实施方式中,处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述中性蛋白酶的酶活力为1.0×10-4AU/mL至1.0×10-3AU/mL、优选5.0×10-4AU/mL,和/或处于待酶解的所述乳或乳制品中的所述碱性蛋白酶的酶活力为2.8×10-4AU/mL至2.8×10-3AU/mL、优选1.4×10-3AU/mL。在优选的实施方式中,所述酶解的酶解温度为40~50℃、优选45℃。在优选的实施方式中,所述酶解的酶解时间为1~6小时、优选2小时。
在所述步骤(2)滤器过滤分离步骤中,所述滤器为滤膜和/或滤纸,优选双层玻纤滤纸。在一个实施方式中,所述滤器的孔径为0.7~0.8μm。在另一实施方式中,在实施所述步骤(2)之前,使用加热的碱溶液对所述步骤(1)获得的蛋白酶解液进行稀释。所述碱溶液是10mmol/L的NaOH,所述碱溶液的温度是80℃,所述稀释为等体积稀释。在该情况下,所述滤器的孔径为0.7~1.6μm、优选0.7μm。优选地,在过滤完成后利用纯水或去离子水对截留物进行负压抽滤水洗。
在所述步骤(3)酸解步骤中,所述一元酸使用浓度为1mol/L的盐酸。在优选的实施方式中,所述加热水解的时间为0.5~2小时,优选1小时。在优选的实施方式中,所述加热水解的温度为110~130℃、优选121℃。
可通过离子色谱分析或高效液相色谱分析的方法对经过本发明的前处理方法处理后的含有酵母β-葡聚糖的牛乳样品进行分析。在所述分析之前可对样品进行稀释。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明,这些实施例仅用于举例说明本发明,不应被解释为对本发明的限制。
本发明实施例中使用的乳或乳制品为同一批次的蒙牛乳业生产的鲜奶产品,酵母β-葡聚糖为安琪酵母的酵母葡聚糖G70。本发明实施例中采用的中性蛋白酶是诺维信公司的其原液的酶活力为0.8AU/g,密度为1.25g/ml。所采用的碱性蛋白酶为诺维信公司的其原液的酶活力为2.4AU/g,密度为1.17g/mL。
本实施例中所适用的滤器为玻纤滤纸。
利用如下方法制备添加有酵母β-葡聚糖的牛奶:将新鲜牛奶加热至80℃,根据实施例加入酵母β-葡聚糖,用均质机高速剪切10min进行混合,冷却备用。
除非特别指明,实施例所采用的添加有酵母β-葡聚糖的牛奶中酵母β-葡聚糖的含量为42mg/100g牛奶。
本发明实施例均采用离子色谱的方法对酸解后的葡萄糖含量进行测定,并推导出样品中葡聚糖的含量。具体而言,首先对葡聚糖酸解溶液进行稀释,使得待测定的葡萄糖浓度处于线性范围(即,下文中所述的0.5~20μg/mL)。所采用的色谱条件为:色谱柱为DionexCarboPac PA10色谱柱(4.0×250mm,5μm),流动相为15mmol NaOH溶液,流速为1ml/min,30℃柱温下等度洗脱。检测器为安培检测器。
按照式(1)计算样品牛奶中酵母β-葡聚糖的含量,数值以毫克每百克表示:
……………………………………式(1)
式中:
X——样品中酵母β-葡聚糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
C——样液中葡萄糖的测定值,单位为微克每毫升(μg/mL);
V——样品的最后定容体积,单位为毫升(mL);
m——样品质量,单位为克(g);
F——葡聚糖水解校正因子,F=1.78;
d——稀释倍数;
0.9——葡萄糖转换为葡聚糖系数;
1000——由μg/mL换算成mg/mL的换算因子。
100——由mg/g换算成mg/100g的换算因子。
由于经本方法处理的牛奶中乳糖干扰极低(如图3B所示,空白对照中几乎不存在半乳糖),在水解产物中基本检不出半乳糖,因此在计算葡萄糖时无需扣除半乳糖。
实施例1:
(1)蛋白酶解:以0.1%(v/v)的比例分别向酵母β-葡聚糖牛奶的3个样品中加入中性蛋白酶原液和碱性蛋白酶原液的等体积混合液,45℃下酶解2小时。所述0.1%(v/v)的中性蛋白酶原液和碱性蛋白酶原液的等体积混合液对应于处于待酶解的牛奶中的所述中性蛋白酶的酶活力为5.0×10-4AU/mL、所述碱性蛋白酶的酶活力为1.4×10-3AU/mL。
(2)滤器过滤分离:分别使用0.8μm滤纸、0.8μm双层滤纸和0.7μm/0.8μm双层滤纸(对应于样品1a-1c)对步骤(1)获得的酶解液进行过滤;
(3)酸解:向步骤(2)获得的截留物中加入1mol/L盐酸,121℃水解1小时。
结果表明,使用0.8μm滤纸时,滤纸上出现截留物。采用0.7μm/0.8μm双层滤纸(样品1c)时,测得样品中葡聚糖的含量为10.1mg/100g。
实施例2:
采用与实施例1相同的步骤(1)和步骤(3)。
在实施步骤(2)之前,使用80℃的NaOH水溶液将所述步骤(1)获得的蛋白酶解液稀释1倍。随后,分别使用1.6μm、1.0μm和0.7μm的玻纤滤纸(对应于样品2a-2c)对步骤(1)获得的沉淀进行过滤,并利用纯水或去离子水对截留物进行负压抽滤水洗2-3次。
结果表明,滤纸的孔径小截留的葡聚糖更多,然而其过滤速度明显低于大孔径的滤纸。此外,当牛奶样品温度下降后,容易出现蛋白与脂肪沉积,造成滤孔堵塞。经测定,样品2a-2c的葡聚糖含量分别为31.mg/100g、38.9mg/100g和45.9mg/100g。
如图3C所示,通过实施例2的前处理方法处理的牛奶样品,15.3min处的葡萄糖色谱峰响应良好,相邻13.8min处的半乳糖色谱峰响应极低,不构成干扰。
采用0.7μm滤纸时,样品回收率在92.7~108.0%,平均值为100.3%,相对标准偏差(RSD)为5.7%(n=10,以理论值42.0mg/100g计)。如图2所示,本发明方法的复现性良好。
实施例3:分析步骤的灵敏度、准确度和精密度分析
使用纯水配制0.5、1.0、4.0、8.0、10.0、15.0、20.0μg/mL一系列浓度的葡萄糖标准溶液和样品溶液,对分析的灵敏度、准确度和精密度进行评估。
在与实施例2相同的色谱条件下测定得到葡萄糖标准溶液的线性回归方程为Y=2.865X+0.395,线性范围是0.5~20μg/mL,线性相关系数为0.9995,检测限为0.1μg/mL,相对标准偏差为0.15%(n=6)。
以乳制品中添加酵母β-葡聚糖的浓度为42.00mg/100g作为标准样,制备标准样的70%、100%和130%三种添加水平的样品,测定三种浓度下的样品回收率:当添加量为70%时,平均测定值为24.58mg/100g,回收率为83.6%,相对标准偏差为4.52%(n=6);当添加量为100%时,平均测定值为40.03mg/100g,回收率为95.3%,相对标准偏差为4.16%(n=6);当添加量为130%时,平均测定值为57.98mg/100g,回收率为106.2%,相对标准偏差为3.05%(n=6)。