CN110672757B

CN110672757B - 一种检测奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的预处理方法

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Publication number: CN110672757B
Application number: CN201911079831.1A
Authority: CN
Inventors: 李兆丰; 陈双娣; 李才明; 顾正彪; 程力; 洪雁
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-11-07
Also published as: CN110672757A

Abstract

本发明公开了一种检测奶粉中2’‑岩藻糖基乳糖含量的预处理方法，属于食品检测技术领域。所述方法是溶解、离心、稀释、过膜；所述溶解是采用沉淀剂溶解奶粉样品；所述沉淀剂为甲醇、乙醇、乙腈、缓冲液溶液中的一种。本发明采用的预处理方法，相比于其他预处理方法，具有操作简便、检测灵敏度高、分离度高等优点，大大减少了乳糖的干扰，改善了2’‑岩藻糖基乳糖的定量限，定量限低至100μg/g，对于低含量2’‑岩藻糖基乳糖的检测准确度具有重要意义。

Description

一种检测奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的预处理方法

技术领域

本发明涉及一种检测奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的预处理方法，属于食品检测技术领域。

背景技术

母乳喂养永远是首选，有利于在生命早期促进人体健康肠道环境的形成，近年来，一些母乳的健康功效被逐渐重视，在婴幼儿配方奶粉中添加接近母乳有效成分以获得相应功能效应成为市场趋势。母乳低聚糖是人类母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大组分，具有很高的生物活性，不仅能对肠道病原微生物起到很好的抗感染作用，还能维持肠道微生态平衡。岩藻糖基低聚糖，是常见的母乳低聚糖，是选择双歧杆菌和致病菌受体可溶性类似物作为生长刺激因子，从而保护婴儿免受肠道病原体感染和毒素结合。其中，2’-岩藻糖基乳糖是最丰富的岩藻糖基乳糖，每升母乳中有约2.4g，占总母乳低聚糖的30％以上，目前已被婴幼儿营养品市场大力推广。

由于目前大多数奶粉中含有乳糖，且含量占碳水化合物总量的50％以上，而2’-岩藻糖基乳糖是由一分子乳糖通过α-1,2糖苷键与一分子岩藻糖连接而成，在结构和性质上与乳糖极其相似，对2’-岩藻糖基乳糖的分离和检测带来了极大的困难。而且，婴幼儿奶粉中乳糖的含量远远高于2’-岩藻糖基乳糖，进一步加大了检测的难度，对于婴幼儿奶粉产品的监控带来了很大的困扰。因此，目前关于2’-岩藻糖基乳糖的检测方法，鲜有报道。Thurl等人(1996)建立了人乳中2’-岩藻糖基乳糖的测定，但是样品需离心超滤，再通过凝胶渗透色谱分离，最后通过离子交换色谱进行分析，整个过程操作繁琐复杂，成本较高，误差较大，对于现在样品的批量检测可行性低。Bao等人(2012年)通过石墨碳高效液相色谱-串联质谱法进行分离测定，需要提前将乳寡糖还原，该方法也存在操作过程繁琐、耗时、检测灵敏度低的问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种奶粉中2’-岩藻糖基乳糖的检测方法，通过优化预处理试剂，分析柱、洗脱条件等检测条件，该方法操作过程简单，时间短，成本低，检测准确度和灵敏度高，对于2’-岩藻糖基乳糖的定量检测手段具有很大的突破和应用价值。

本发明的第一个目的是提供一种检测奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的预处理方法，所述预处理方法包括：(1)称取一定量的奶粉样品；(2)用沉淀剂进行溶解样品以除去蛋白质；(3)离心取上清；(4)用超纯水稀释；(5)过膜；所述沉淀剂为甲醇、乙醇、乙腈、缓冲液溶液中的一种。

本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为醋酸钠-醋酸(NaAc-HAc)缓冲溶液和醋酸(HAc)缓冲溶液中的一种。

本发明的一种实施方式中，所述乙醇溶液浓度为70～80％(v/v)。

本发明的一种实施方式中，所述NaAc-HAc缓冲溶液pH为4-5，浓度为20-50mmol/L。

本发明的一种实施方式中，所述HAc缓冲溶液pH为4-5，浓度为0.1～0.2％(v/v)。

本发明的一种实施方式中，所述奶粉样品用沉淀剂溶解后浓度为5-10mg/mL。

本发明的一种实施方式中，所述离心转速为8000-14000rpm，时间为5-10min。

本发明的一种实施方式中，所述稀释倍数为20～100倍。

本发明的一种实施方式中，所述过膜是过0.22μm或0.45μm的尼龙微孔滤膜。

本发明的第二个目的是提供一种奶粉中2’-岩藻糖基乳糖的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)应用上述预处理方法对奶粉进行预处理；(2)高效阴离子交换色谱定量检测。

本发明的一种实施方式中，高效阴离子交换色谱的分析柱为Dionex CarboPac糖类分析柱，包括PAl、PAl0、PA20、PAl00、PA200和MA1。优选地，采用Dionex CarboPac PA20阴离子交换柱。

本发明的一种实施方式中，洗脱中淋洗液为：0.25mol/L NaOH为A液，1mol/L NaAc为B液，超纯水为C液。

本发明的一种实施方式中，洗脱条件为以下七种中的一种：

条件1：0-40min，10％B+90％C；

条件2：0-40min，5％B+95％C；

条件3：0-40min，50％A+50％C；

条件4：0-40min，20％A+80％C；

条件5：0-40min，10％A+90％C；

条件6：0-15min，10％A+90％C；15-25min，20％A+80％C；25-40min，A液、B液、C液以任一比例复配；

条件7：0-20min，10％A+90％C；20-40min,20％A+80％C；

A液为0.25mol/L NaOH，B液为1mol/L NaAc，C液为超纯水。

本发明的一种实施方式中，洗脱条件为：0-15min，10％A+90％C；15-25min，20％A+80％C；25-27min，30～24％A+0～36％B+70～40％C；27～35min，24％A+36％B+40％C；35-37min，24～10％A+36～0％B+40～90％C；37～50min，10％A+90％C。

本发明的一种实施方式中，所述检测条件为：采用安培检测器采用四电位脉冲安培法检测，参比电极为Ag/AgCl；采用Dionex CarboPac PA20阴离子交换柱；淋洗条件：采用梯度洗脱，以0.25M NaOH和1M NaAC为淋洗液进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL；所述交换柱为分析柱(3×150mm)或保护柱(3×30mm)。

本发明的一种实施方式中，采用外标法定量检测2’-岩藻糖基乳糖含量。

本发明第三个目的是提供一种所述预处理方法在含2’-岩藻糖基乳糖及其衍生物的产品检测方面的应用。

本发明的第四个目的是提供一种上述检测方法在检测2’-岩藻糖基乳糖方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明中样品预处理过程避免了衍生化、还原或分离纯化等步骤，操作简单，节约试剂成本，对于批量检测具有很大的可行性；

(2)本发明采用的预处理方法，相比于预处理方法，具有检测灵敏度高、分离度高等优点，大大减少了乳糖的干扰，改善了2’-岩藻糖基乳糖的定量限，定量限低至100μg/g，对于低含量2’-岩藻糖基乳糖的检测准确度具有重要意义；

(3)采用本发明方法检测的加标回收率在96.6％～103.6％之间，检测结果准确，灵敏度高，无干扰，对工业上批量化检测具有很好的应用价值。

附图说明

图1普通配方奶粉(空白)的离子色谱图。

图2普通配方奶粉(添加量500μg/g奶粉)的离子色谱图。

图3普通配方奶粉(添加量800μg/g奶粉)的离子色谱图。

图4普通配方奶粉(添加量1000μg/g奶粉)的离子色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

实施例1：乙醇溶液预处理

采用不同浓度的乙醇溶液按如下方式进行预处理和检测：

(1)样品预处理：精确称取0.5g的奶粉样品，预先用50mL 80％的乙醇溶液溶解，10000rpm离心10min，取上清，用超纯水稀释20倍，过0.22μm的尼龙微孔滤膜，待用。

(2)采用高效阴离子交换色谱(带有脉冲电流检测器)定量检测：

分析条件为：安培检测器采用四电位脉冲安培法检测，参比电极为Ag/AgCl，Dionex CarboPac PA20阴离子交换柱，采用梯度洗脱，淋洗条件：以0.25M NaOH(A液)、1MNaAc(B液)和超纯水(C液)为淋洗液进行梯度洗脱(0-15min,10％A+90％C；15-25min,20％A+80％C；25-27min,30～24％A+0～36％B+70～40％C；27～35min,24％A+36％B+40％C；35-37min,24～10％A+36～0％B+40～90％C；37～50min,10％A+90％C)，流速为0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL；交换柱为分析柱(3×150mm)或保护柱(3×30mm)。

其中，乙醇浓度(v/v)分别设为60％、70％、80％、90％、100％(v/v)，各检测情况如表1所示。其中，乙醇浓度对一些参数(如样品分离度、检测灵敏度、保留时间准确度等)没有明显影响(数据未列出)。

表1 不同浓度的乙醇溶液预处理方法下样品测定分析结果比对

注：¹样品沉淀后状态，直接通过肉眼观察；²过膜情况以过膜的速度和破损情况进行判断；³测定值RSD通过连续测定6组样品的峰面积计算得到的。

从表1可以看出，乙醇溶液浓度达70％以上，对奶粉样品具有较好的除杂效果，得到的溶液澄清透明，且过膜容易；但浓度在90％以上，样品检测的精确度大大降低，RSD＞5％，可能原因是乙醇浓度过高，导致样品测定过程中容易挥发不稳定。因此，采用70％-80％的乙醇溶液进行预处理奶粉样品比较合适。

实施例2：NaAc-HAc缓冲液预处理

与实施例1相比，区别仅在于：采用pH 4.7的NaAc-HAc缓冲液进行样品预处理，其中，NaAc-HAc缓冲液浓度分别设为10、20、30、40、50mM，其他预处理和检测方式同实施例1，各检测情况如表2所示。其中，NaAc-HAc缓冲液浓度对一些参数(如测定值准确度、检测灵敏度、保留时间准确度等)没有明显影响(数据未显示)。

表2 不同浓度的NaAc-HAc缓冲液预处理方法下样品测定分析结果比对

注：¹样品沉淀后状态，直接通过肉眼观察；²过膜情况以过膜的速度和破损情况进行判断；³分离度以最大的乳糖干扰峰与2’-岩藻糖基乳糖目的峰保留时间之差进行计算得到的。

从表2可以看出，低浓度(10mM)的NaAc-HAc缓冲液对奶粉中蛋白质的沉淀情况不太理想，过膜较困难，对检测带来了一定的困难；随着NaAc-HAc浓度的提高(20mM以上)，奶粉样品比较容易过膜，说明杂质除去的较好。另外，从分离度结果看，随着缓冲液浓度的提高，分离度越来越低，可能是由于样品中含有的NaAc浓度较高，而NaAc作为淋洗液具有洗脱能力，因此造成了目的峰的迁移，降低了分离度。因此，采用20mM的NaAc-HAc缓冲液(pH4.7)进行预处理奶粉样品比较合适。

实施例3：HAc缓冲液预处理

与实施例1相比，区别仅在于：采用pH 4.7的HAc缓冲液进行样品预处理，其他预处理和检测方式同实施例1。通过预实验发现奶粉用0.15％的HAC溶液溶解后，pH 4.7左右，也能利用蛋白等电原理对杂蛋白进行很好的沉淀。因此，对乙醇溶液沉淀法、NaAc-HAc溶液沉淀法和HAc溶液沉淀法进行比较，以确定更好地预处理奶粉样品方法，来改善奶粉中2’-岩藻糖基乳糖的含量检测。而甲醇和乙腈溶液预处理后的检测情况与乙醇类似，不再列出比较。其中，乙醇溶液浓度为80％(v/v)，NaAc-HAc缓冲液浓度为20mM，HAc溶液浓度为0.15％。其他过程与实施例1和2中相同。各预处理方法的检测情况见表3。

表3 不同预处理方法下样品测定分析结果比对

注：¹定量限LOQ指加标回收率在95％-105％范围内的最低检测含量；²保留时间RSD是通过连续测定6组样品的保留时间计算得到的；³定量时间RSD是通过连续测定6组样品的峰面积计算得到的；⁴精密度RSD是通过测定6组样品计算含量后得到的；⁵分离度是以最大的乳糖干扰峰与2’-岩藻糖基乳糖目的峰保留时间之差进行计算得到的；⁶目的峰面积是在同一样品上样浓度(5mg/mL)下测定出来的；⁷目的峰高是在同一样品上样浓度(5mg/mL)下测定出来的；⁸专属性是样品中加入低聚果糖、低聚半乳糖或低聚异构化乳糖制成阴性对照，判断干扰性。

从表3可以看出，乙醇溶液沉淀法、0.2mM NaAc-HAc和0.15％HAc溶液沉淀法这3种预处理方法对于2’-岩藻糖基乳糖的检测具有很好的重复性和精密度。但其中，乙醇溶液沉淀法，与0.2mM NaAc-HAc或0.15％HAc溶液沉淀法相比，其目的峰高值明显低，说明在同一上样浓度情况下，该方法响应值较低，因此导致了其定量限只有500μg/g；而NaAc-HAc溶液沉淀法因NaAc较强的洗脱能力，导致分离度偏低，受乳糖干扰大，从而导致了定量限只有300μg/g。综上，0.15％HAc溶液沉淀法对奶粉样品预处理后，定量限能达100μg/g，具有较好的分离度、重复性和精密度，是一种很好的改善奶粉中2’-岩藻糖基乳糖检测的预处理方法，对于低含量2’-岩藻糖基乳糖的检测具有重要意义。

实施例4：分析柱的选择

根据2’-岩藻糖基乳糖的结构特征，选择Dionex CarboPac PA20和PA200进行分析检测，检测情况见表4。

表4 PA200和PA20分析柱的检测情况比对

注：¹保留时间可以衡量目的峰分离的可能性，值越小表示可能性越低；²加标情况是通过外加2’-岩藻糖基乳糖标准品，观察峰面积变化情况，可初步判断目标峰的检测可能性，越明显，检测可能性越大；³分离情况是通过图谱中峰的数量判断，数目越多，表示该分析柱对样品的分离情况越好。

从表4可以看出，Dionex CarboPac PA20柱分离检测奶粉时，保留时间较长，加标情况明显，且分离情况好，分离2’-岩藻糖基乳糖的可能性极大。且PA20柱初步预实验显示，只受乳糖峰的干扰检测较大，其他峰分离度较好，因此，选取Dionex CarboPac PA20柱进行进一步优化，主要集中于乳糖干扰峰和2’-岩藻糖基乳糖目的峰的分离。另外，发明人也研究了其他分析柱，如：PAl、PAl0、PAl00和MA1，发现PAl和MA1不能分离乳糖和2’-岩藻糖基乳糖，而PAl0、PAl00分离速度和柱效不及PA20和PA200。

实施例5：洗脱条件的选择

以0.25M NaOH(A液)和1M NaAc(B液)为淋洗液进行梯度洗脱，其中B液的洗脱强度大于A液，通过调节A液、B液以及超纯水(C液)的比例，来控制洗脱能力，进而控制不同糖的保留时间以准确地分离检测2’-岩藻糖基乳糖。

首先，将奶粉样品按实施例2进行预处理和上机检测，然后按以下几种洗脱条件进行检测优化：

条件1：0-40min,10％B+90％C；

条件2：0-40min,5％B+95％C；

条件3：0-40min,50％A+50％C；

条件4：0-40min,20％A+80％C；

条件5：0-40min,10％A+90％C；

条件6：0-15min,10％A+90％C；15-40min,20％A+80％C；

条件7：0-20min,10％A+90％C；20-40min,20％A+80％C；

各洗脱条件的分离情况见表5，从保留时间、峰形情况及分离度进行判断。

表5 不同洗脱条件下的检测情况比对

注：¹保留时间可以衡量目的峰分离的可能性，值越小表示可能性越低；²峰形情况通过观察图谱中目的峰与旁边乳糖峰的重叠、交叉、分离、拖尾等情况进行说明；³分离度是以最大的乳糖干扰峰与2’-岩藻糖基乳糖目的峰保留时间之差进行计算得到的。

从表5可以看出，即使低浓度的B液(条件1和条件2)，也无法将旁边干扰最大的乳糖峰和目的峰进行很好的分离，并且保留时间短，很难调节B液浓度进行优化，因此，选用洗脱能力弱的A液进行洗脱分离检测。当洗脱浓度为50％A(条件3)时，仍无法分离乳糖峰和目的峰；进一步浓度降为20％A(条件4)时，乳糖干扰峰和目的峰的峰形及其分离度均较好；进一步降低洗脱浓度，设为10％A(条件5)时，虽然两个峰的保留时间及分离度都有所改善，但因洗脱能力减弱，乳糖峰拖尾比较严重；因此，改变梯度，设置洗脱条件为0-15min,10％A+90％C；15-40min,20％A+80％C(条件6)，相比于条件4，分离度有了进一步改善；但条件7中由于目的峰在梯度变化的拐角处，影响峰的准确确定。综上，洗脱条件定为：0-15min,10％A+90％C；15-40min,20％A+80％C(条件6)。另外，0-15min，10％A+90％C；15-25min，20％A+80％C；25-40min，A液、B液、C液可以以任一比例复配，对检测方法不影响。

实施例6：方法的准确性和重复性

通过实施例1的方法并采用0-15min,10％A+90％C；15-40min,20％A+80％C洗脱条件对样品进行测定，记录保留时间和峰面积，并计算含量及其RSD，结果见表6。可以看出，该方法检测结果准确，灵敏度高，无干扰。

表6 样品测定分析结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种检测奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括：(1)称取一定量的奶粉样品；(2)用沉淀剂进行溶解样品；(3)离心取上清；(4)稀释；(5)过膜；所述沉淀剂为HAc缓冲溶液；所述HAc缓冲溶液pH为4-5，浓度为0.15％v/v。

2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述奶粉样品用沉淀剂溶解后浓度为5-10mg/mL。

3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述离心转速为8000-14000rpm，时间为5-10min。

4.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述稀释倍数为20～100倍。

5.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述过膜是过0.22μm或0.45μm的尼龙微孔滤膜。

6.权利要求1-5任一所述的预处理方法在含2’-岩藻糖基乳糖及其衍生物的产品检测方面的应用。