CN107974444A - 新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用 - Google Patents

新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107974444A
CN107974444A CN201610917305.8A CN201610917305A CN107974444A CN 107974444 A CN107974444 A CN 107974444A CN 201610917305 A CN201610917305 A CN 201610917305A CN 107974444 A CN107974444 A CN 107974444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
sequence
reaction
derivative
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610917305.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107974444B (zh
Inventor
肖友利
徐宝福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CN201610917305.8A priority Critical patent/CN107974444B/zh
Publication of CN107974444A publication Critical patent/CN107974444A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107974444B publication Critical patent/CN107974444B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。具体而言，本发明提供一种多肽，选自：(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；和(2)在(1)所述的多肽序列中经过插入、缺失或突变一个或几个氨基酸且具有赖氨酸脱羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列与促进SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表达、分泌到胞外或纯化的多肽序列组成的多肽。本发明首次从蛇足石杉中鉴定到赖氨酸脱羧酶，并验证体外和体内活性。利用该赖氨酸脱羧酶应可提高石松类生物碱尤其石杉碱甲的产量，因此具有较好的应用前景。

Description

新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。
背景技术
石杉碱甲是从中国传统草药千层塔(石松类石松属植物种蛇足石杉)提取出来的石松类生物碱，其是乙酰胆碱酯酶的有效抑制剂，具有治疗老年痴呆症巨大应用前景。石杉碱甲的生物合成途径的研究一直是困扰众多国内外研究者的难题，之前放射性同位素喂养的实验预测出了其分子结构水平的合成途径，此途径指出赖氨酸脱羧酶(LDC)以及铜胺氧化酶(CAO)是两个石松类生物碱合成的起始步骤。CAO已经被其他研究人员鉴定，但本领域尚未鉴定到富产石杉碱甲的蛇足石杉来源的LDC。
发明内容
本发明利用兼并引物以及快速扩张cDNA末端的方法获得6个全新的来源于蛇足石杉的编码LDC的序列。此外，本发明在体外以及体内进行了偶联反应，建立了定量检测反应中间体的方法。
本发明第一方面提供一种多肽，选自：
(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；
(2)在(1)所述的多肽序列中经过插入、缺失或突变一个或几个氨基酸且具有赖氨酸脱羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和
(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列与促进SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表达、分泌到胞外或纯化的多肽序列组成的多肽。
本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，选自：
(1)编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种核酸构建物，其含有本发明第二方面所述的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体。
本发明第四方面提供一种宿主细胞，其含有本发明的核酸构建物，如表达载体。
本发明第五方面提供本发明多肽、多核苷酸序列、表达载体在制备石松类生物碱尤其是石杉碱甲中的应用。
本发明第六方面提供一种检测LDC的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的尸胺的步骤。
本发明第七方面提供一种检测CAO的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的5-氨基戊醛的步骤。
本发明第八方面提供一种检测LDC和CAO的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的尸胺和5-氨基戊醛的步骤。
在第六方面的一个或多个实施方案中，所述方法包括向待检测的反应体系中加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物A的存在和/或含量：
在第七和第八方面的一个或多个实施方案中，所述方法包括向待检测的反应体系中加入还原剂，将5-氨基戊醛还原成5-氨基戊醇，然后加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物B的存在和/或含量：
本发明第九方面提供3,5-二硝基苯甲酰氯在检测LDC的酶催化产物中的应用，以及3,5-二硝基苯甲酰氯和任选的还原剂在检测CAO的酶催化产物中的应用。
本发明第十方面提供一种反应混合物，其含有LDC、L-赖氨酸和5’-磷酸吡哆醛(PLP)，或含有CAO、尸胺和CuSO4，或含有LDC、CAO、L-赖氨酸和5’-磷酸吡哆醛和CuSO4。
本发明第十一方面提供一种反应混合物，其含有LDC和衍生物A，或含有CAO和衍生物B，或含有LDC、CAO、衍生物A和衍生物B。
附图说明
图1：所选植物源的L/ODCs序列分析。蛋白序列利用Vector NTI(Invitrogen)软件进行分析。方框标出的序列为所选设计兼并引物的序列。
图2：蛇足石杉总RNA抽提电泳结果。M: Plus DNA Ladder；1，2是两个平行的蛇足石杉叶片提取的总RNA。
图3：利用兼并引物扩增LDC内部片段。
图4：蛇足石杉LDC 3’RACE(左图)和5’RACE(右图)电泳结果。
图5：扩增所得LDC与其他物种LDCs蛋白序列比对。
图6：L/ODCs的进化分析。
图7：Hs-LDC的高保真酶扩增以及T克隆。
图8：所得Hs-LDC DNA序列比对的部分结果。
图9：所得Hs-LDC蛋白序列比对的部分结果。
图10：HsLDC的纯化结果(左)及全波长扫描分析(右)。
图11：体外衍生化检测HsLDC活性。(A)HPLC分析HsLDC的反应，从底部到顶部：对照无L-赖氨酸；完整的反应；化学合成的HsLDC产物衍生化标品(衍生物A，化合物结构见图B)。(B)酶催化产物衍生化后的质谱检测，衍生物A(m/z 491.1184[M+H]+，C19H19N6O10，理论值491.1163；m/z513.0999[M+Na]+，C19H18N6O10Na，理论值513.0982)。HPLC条件:使用Luna5uC18(2)100A Phenomenex柱(250*4.6mm)。流速为1.0mL/min；A相为10mM甲酸-甲酸钠缓冲液，pH3.0；B相为乙腈；0-10min，5-40％B；10-30min，40-80％B；30-35min，80-95％B；35-40min，95％B；40-50min，柱平衡。
图12：PCR检测目标基因在烟草中的表达。WT：野生型烟草叶片；T-BV：转化空载pEAQ-HT-DEST1的烟草叶片；T-HsLDC：转化HsLDC烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1::HsLDC的烟草叶片；T-HsCAO：转化HsLDC烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1::HsLDC的烟草叶片；T-HsLDC+HsCAO：转化HsLDC和HsCAO烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1::HsLDC和pEAQ-HT-DEST1::HsCAO的烟草叶片。引物LDC和CAO指分别能够PCR扩增HsLDC和HsCAO的引物。
图13：HPLC分析以及比较在不同转基因的烟草叶片里尸胺和腐胺含量。(A)HPLC分析3,5-二硝基苯甲酰氯衍生化的烟草叶片样品。IS，内标，1,7-二氨基庚烷。(B)尸胺(Cad)定量标曲。(C)腐胺(Put)定量标曲。0.5-8mg/L尸胺和腐胺进行标曲的制作，所有样品都有3个平行。HPLC条件：使用Luna 5u C18(2)100A Phenomenex柱(250*4.6mm)。流速为1.0mL/min；A相为10mM甲酸-甲酸钠缓冲液，pH3.0；B相为乙腈；0-10min，5-40％B；10-30min，40-80％B；30-35min，80-95％B；35-40min，95％B；40-50min，柱平衡。
图14：烟草叶片瞬时表达HsLDC或HsCAO对腐胺(左柱)和尸胺(右柱)含量的影响。Tobacco-WT：野生型烟草叶片；Tobacco-BV：转化空载pEAQ-HT-DEST1的烟草叶片；Tobacco-HsLDC：转化HsLDC烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1::HsLDC的烟草叶片；Tobacco-HsCAO：转化HsLDC烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1::HsLDC的烟草叶片；Tobacco-HsLDC+HsCAO：转化HsLDC和HsCAO烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1::HsLDC和pEAQ-HT-DEST1::HsCAO的烟草叶片。每个样品有3个平行。
图15：监测HsLDC和HsCAO催化产物的衍生化原理。
图16：SDS-PAGE分析HsCAO蛋白纯化(A)及其全波长扫描(B)。
图17：体外一锅法偶联HsLDC和HsCAO生成5-氨基戊醛。(A)HPLC分析HsLDC和HsCAO偶联反应(从上至下，单独HsLDC反应，单独HsCAO反应，HsLDC和HsCAO偶联反应)。(B)从HsLDC和HsCAO偶联反应液衍生化并萃取出的衍生物B的质谱；m/z 298.1063[M+H]+，C12H16N3O6,理论值298.1039；m/z 320.0873[M+Na]+，C12H15N3NaO6，理论值320.0859。HPLC条件：使用Synergi Fusion RP 4u 80A Phenomenex柱(250*4.6mm)。流速为1mL/min；A相为10mM甲酸-甲酸钠缓冲液，pH3.0；B相为乙腈；0-10min，5-40％B；10-30min，40-80％B；30-35min，80-95％B；35-40min，95％B；40-50min，柱平衡。
图18：大肠杆菌体系偶联HsLDC和HsCAO发酵液分析。从上至下，5-氨基戊醛衍生物标品(衍生物B)，转化空载的大肠杆菌，转化HsLDC和HsCAO表达载体的大肠杆菌。HPLC条件:使用Luna 5u C18(2)100A Phenomenex柱(250*4.6mm)。流速为1mL/min；A相为10mM甲酸-甲酸钠缓冲液，pH3.0；B相为乙腈；0-10min，5-40％B；10-30min，40-80％B；30-35min，80-95％B；35-40min，95％B；40-50min，柱平衡。
图19：HPLC分析共转HsLDC和HsCAO的烟草叶片衍生物确认5-氨基戊醛的积累。a)衍生物A(尸胺衍生物)标品；b)衍生物B(5-氨基戊醛衍生物)；c)转化HsLDC表达载体的烟草叶片；d)共转HsLDC和HsCAO表达载体的烟草叶片；e)转化空载的烟草叶片；f)野生型烟草叶片。HPLC条件:使用Luna 5u C18(2)100A Phenomenex柱(250*4.6mm)。流速为1mL/min；A相为10mM甲酸-甲酸钠缓冲液，pH3.0；B相为乙腈；0-10min，5-30％B；10-20min，30％B；20-35min，30-80％B；35-40min，80-95％；40-45min，95％B；45-55min，柱平衡。
具体实施方式
本发明提供具有如SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列的赖氨酸脱羧酶(LDC)。本发明还包括在SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列的基础上用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时所获得的多肽。这种保守性取代通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明因此包括在SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列所具备的赖氨酸脱羧酶活性的由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14衍生的多肽。所述几个通常为10个以内，优选8个以内，更优选5个以内。
本领域技术人员可采用常规的技术手段判断SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列中哪些氨基酸残基可被取代或删除。例如，通过比对来自不同种属、活性相同或类似或明显不同的序列，可以判断这些序列中哪些氨基酸残基是可以被取代或删除。可采用本领域常规的方法(包括本发明所公开的方法)验证这样的序列是否具备本发明所述的酶活。
此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸序列添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，这些氨基酸序列包括但不限于适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。例如，本发明氨基酸序列的氨基端和/或羧基端可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。使用的标签例子包括Poly-Arg，如RRRRR(SEQ ID NO:15)；Poly-His 2-10个(通常6个)，如HHHHHH(SEQ ID NO:16)；FLAG，即DYKDDDDK(SEQ IDNO:17)；Strep-TagII，即WSHPQFEK(SEQ ID NO:18)；和C-myc，即WQKLISEEDL(SEQ ID NO:19)。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的赖氨酸脱羧酶酶活，即催化赖氨酸生成尸胺的活性。
因此，本发明也包括与SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％序列相同性的氨基酸序列。在更优选的实施例中，此类氨基酸序列也同样来自蛇足石杉，优选具有与本文SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14相同或类似的赖氨酸脱羧酶酶活，如在相同的反应体系和反应条件下具有相同或类似的动力学参数(如Km、Kcat及Kcat/Km值)。
可采用常规的手段计算比对的两条序列的序列相同性，例如，采用NCBI提供BLASTP，采用默认参数进行比对。
根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本申请包括本发明多肽的编码序列。SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13显示了本发明多肽的示例性编码序列。所述“编码序列”包括与SEQ ID NO:3、5、7、9、11或13高度同源的序列或在严格条件下与SEQ ID NO:3、5、7、9、11或13杂交的核苷酸序列或与上述分子高度同源的家族基因分子。编码本发明多肽的序列可以与SEQ ID NO:3、5、7、9、11或13所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQID NO:4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列，但与SEQ ID NO:3、5、7、9、11或13所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。
编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可先采用常规的技术手段从肠杆菌属(Enterobacter sp.)中获取基因组DNA，然后再根据本发明所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用于从该基因组DNA中扩增出脂肪酶基因。
因此，本发明也包括本发明编码序列的片段，所述片段通常长10～40个碱基，能作为引物或探针使用。“片段”在本文中指全长序列的连续的一部分序列。
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本发明的编码序列以及与该编码序列操作性连接并指导该编码序列在宿主细胞中在合适的条件下表达的一个或多个调控序列。编码本发明多肽的多核苷酸可以各种方式被操作，以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列，为由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。适用于本发明的启动子序列例子包括35S启动子和cspA启动子等。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，为由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5’端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5’端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。
本发明也涉及包括本发明多核苷酸的克隆载体或表达载体。这些载体可含有前文所述的各调控序列。
表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。
载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。
本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。
一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。
本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。本发明的表达载体更为优选包含有连续6个组氨酸序列的小肽，有利于蛋白质的提取和纯化。
本发明也涉及含有被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是植物细胞或单细胞微生物或非单细胞微生物。宿主细胞可以是原核细胞，包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)以及埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在更为优选的方面，宿主细胞是假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属以及埃希氏菌属的细胞。在最优选方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
可采用常规的转染方法将含本发明多核苷酸序列的核酸构建物转入宿主细胞中。转染通常分为瞬时转染和稳定转染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天。稳定转染中，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。转染的技术手段包括化学转染和物理转染，前者如DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法，后者如显微注射、电穿孔和基因枪等。
本发明的赖氨酸脱羧酶可用于生产石松类生物碱，尤其是石杉碱甲。例如，可将本发明多肽的表达载体转入用于生产石松类生物碱的宿主中，使该宿主表达本发明的赖氨酸脱羧酶，启动石松类生物碱的生产。优选的，在转入表达本发明多肽的表达载体的同时，还转入表达铜胺氧化酶(CAO)的表达载体。如图15所示，本发明赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸转化成尸胺，从而启动石松类生物碱的生产，而CAO则催化尸胺转化成2-氨基戊醛。
因此，本发明提供本发明所述的多肽、编码序列和核酸构建物在生产石松类生物碱，尤其是石杉碱甲中的应用。
如图15所示，LDC催化L-赖氨酸生成尸胺，由此启动石松类生物碱的生物合成。而CAO催化尸胺生成5-氨基戊醛。因此，尸胺和5-氨基戊醛是石松类生物碱生物合成途径中的两种中间体。通过检测这两种中间体的存在和含量，不仅可以检测LDC和CAO的酶学活性，还可为石松类生物碱生物合成途径的后续合成提供指导和改进依据。
因此，本发明还提供一种检测LDC和/或CAO的酶催化产物的方法，所述方法包括尸胺和/或5-氨基戊醛的含量的步骤。本发明该检测方法可应用于石松类生物碱生物合成途径的中间体检测中。
尸胺的检测方法可包括在待检测的反应体系中加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物A的存在和/或含量：
5-氨基戊醛的检测方法包括向待检测的反应体系中添加还原剂，将5-氨基戊醛还原成5-氨基戊醇，然后加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物B的存在和/或含量：
本发明中，所述待检测的反应体系可以来自任何来源的反应体系。例如，为了检测LDC的酶活，可配制含有LDC、L-赖氨酸和5’-磷酸吡哆醛(PLP)的反应溶液。在反应结束后，即可获得待检测的反应体系，该反应体系含有尸胺。然后可加入3,5-二硝基苯甲酰氯，并检测衍生物A的存在或含量。为检测CAO的酶活，可配制含CAO、尸胺和CuSO4的反应溶液，待反应结束后，即可获得待检测的反应体系，然后先后加入还原剂和3,5-二硝基苯甲酰氯，并检测衍生物B的存在和/或含量。或者，可配制含有LDC、CAO、L-赖氨酸、5’-磷酸吡哆醛和CuSO4的反应溶液，待反应结束后，先后加入适量的还原剂和适量的3,5-二硝基苯甲酰氯，并检测衍生物A和B的存在和/或含量。
应理解的是，上述反应溶液通常以水配制，反应溶于中的酶、L-赖氨酸、PLP和CuSO4的含量可根据实际的检测情况确定。通常而言，L-赖氨酸的摩尔浓度可以是LDC或CAO的摩尔浓度的100～500倍；PLP的摩尔浓度可以是LDC或CAO的摩尔浓度的5～50倍；CuSO4的摩尔浓度可以是LDC或CAO的摩尔浓度的0.5～5倍。本申请实施例第2.2.2部分给出了本发明反应溶液的具体实例。
通常，反应溶液中的反应在35～40℃(如37℃)下进行约0.5～1.5小时。此外，通常将各反应溶液的pH调节到约7。
在某些实施方案中，当在微生物如大肠杆菌中表达LDC和/或CAO时，可离心获得发酵液，然后按照上述方法配制相应的反应溶液，获得相应的待检测的反应体系。
而在实际的生产过程中，可从石松类生物碱的生产工具(例如各种转化了LDC和/或CAO的转基因植株或未转化LDC和/或CAO的非转基因植株)的一部分(例如叶片)中提取获得相应的待检测的反应体系，然后按照上述方法检测衍生物A和/或B的存在和/或含量。提取方法是本领域周知的，例如，本申请第1.8部分给出了提取的示例性方法。可根据不同的植物或不同的植物部分采取不同的提取方法。
在检测5-氨基戊醛的情况下，合适的还原剂可以是任何能将5-氨基戊醛还原成5-氨基戊醇的还原剂，包括但不限于NaBH4。通常，加入NaBH4处理一段时间后(例如15～60分钟)，将反应体系的pH调至9～11(例如约10)，然后加入适量的3,5-二硝基苯甲酰氯，反应10～30分钟后，检测衍生物B的生产和/或含量。若NaBH4过量，可在用NaBH4处理结束后加入适量的酸(如盐酸)，以消耗掉剩余的NaBH4。
在检测尸胺的情况下，可直接将适量的3,5-二硝基苯甲酰氯加到反应体系中，反应10～30分钟后，检测衍生物A的存在和/或含量。
可采用本领域常规的方法检测衍生物A和B。例如，可采用液相层析或质谱进行检测。通常，待反应结束后，可加入适量的萃取溶剂(如四氯化碳)萃取衍生物A和/或B，然后在萃取物中加入适量的NaCl，离心获得上层有机层，干燥后可溶于适量有机溶剂(如乙腈)中，以进行分析。
通常，当检测到衍生物A和B的存在时，应能确定所测的LDC和CAO发挥了其酶活。此外，根据检测到的衍生物A和B的量，以及3,5-二硝基苯甲酰氯与尸胺或5-氨基戊醇的化学反应，可推算出反应体系中尸胺和/或5-氨基戊醛的初始含量，由此可计算出酶活。
因此，本发明也包括上述反应溶液(反应混合物)。具体而言，本发明的反应混合物含有酶、反应底物和辅因子，或含有酶和反应产物。本发明的反应混合物是，含有的酶为赖氨酸脱羧酶，反应底物是L-赖氨酸，辅因子是5’-磷酸吡哆醛；或者，含有的酶为铜胺氧化酶，反应底物为尸胺，辅因子是CuSO4；或者，含有的酶是赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶，反应底物是L-赖氨酸，辅因子是5’-磷酸吡哆醛和CuSO4；或者含有的酶是赖氨酸脱羧酶，反应产物是下式所示的衍生物A；或者，含有的酶是铜胺氧化酶，反应产物是下式所示的衍生物B；或者，含有的酶是赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶，反应产物是下式所示的衍生物A和衍生物B的反应混合物。
本发明还提供3,5-二硝基苯甲酰氯在检测LDC的酶催化产物中的应用，以及3,5-二硝基苯甲酰氯和任选的还原剂在检测CAO的酶催化产物中的应用。
应理解的是，适用于本发明上述检测方法和检测应用的LDC和CAO可以是任何来源的LDC和CAO。
下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，本发明并不限于这些具体的实施方式。实施例中所采用的反应试剂、条件等，除非另有说明，否则为本领域常规的试剂、条件等。
1.鉴定蛇足石杉的赖氨酸脱羧酶
1.1设计赖氨酸脱羧酶兼并引物
根据图1所示的L/ODCD的保守蛋白序列设计兼并引物。蛋白序列利用Vector NTI(Invitrogen)软件进行分析。图1中方框标出的序列为所选设计兼并引物的序列。
表1.赖氨酸脱羧酶兼并引物(SEQ ID NO:20和21)
*此序列为兼并引物，其中R＝A/G；Y＝C/T；I是次黄嘌呤核苷酸，可与ATCG四种碱基配对。
1.2蛇足石杉(Huperzia serrata)叶片总RNA的抽提
Trizol购买于Takara公司，专用于RNA抽提。
取约0.5g蛇足石杉叶片材料液氮充分研磨，转入已处理的2mL EP管中，每EP管加入1mL Trizol，振荡混匀；加入0.6体积的氯仿，13000rpm，4℃，离心10min，取上清；重复氯仿抽提一次。加入上清3/4体积的异丙醇，-20℃静置30min；13000rpm，4℃，离心10min，弃上清，加入0.6mL的DEPC水溶解沉淀，加入0.2mL 8M LiCl，4℃静置2h；13000rpm，4℃，离心10min，弃上清(小心吸取上清，切勿将沉淀吸走)；75％乙醇洗沉淀三次，每次13000rpm，4℃，离心1min；冰上敞口放置10min，挥发乙醇；加入20μL水溶解；利用Nandro2000测定RNA浓度及纯度；最后进行RNA电泳检测(上样1μg左右)。总RNA电泳结果如图2所示。
以表1的引物进行PCR。50μL PCR体系包含：1μL cDNA，1μL 10mM dNTP，5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL DNA聚合酶(easy-taq，ex-taq或者PFU)，0.5μLddH2O，1μL 20μM正向引物和1μL 20μM反向引物。PCR程序：95℃，3min预变性，94℃，30s变性；40，45，50和60℃，1min退火；72℃，2min延伸；35轮。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测。结果显示，Pfu在四种退火温度下均未能成功扩增出片段；然而ex-taq和easy-taq都出现了较为理想的结果，尤其是在45度退火时，出现了明显的条带。图3中显示出了约为1000bp的条带，将此片段回收，并进行TA克隆，进行测序并分析显示为LDC内部片段。
1.3通过3’RACE&5’RACE获得LDC全长
表2：以LDC-inner序列设计3’RACE引物(SEQ ID NO:22-24)
表3：3’RACE所需接头序列(Invitrogen)(SEQ ID NO:25-27)
表4：以LDC-inner序列设计5’RACE引物(SEQ ID NO:28-30)
表5：5’RACE所需接头序列(Clontech smart)(SEQ ID NO:31-33)
3’-RACE：以表2-5的引物进行PCR。50μL PCR体系包含：1μL模板，1μL 10mM dNTP，5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL taq DNA聚合酶，40.5μL ddH2O，1μL 20μM正向引物和1μL 20μM反向引物。PCR程序：95℃，3min预变性，94℃，30s变性，40-70℃，40s退火，72℃，2min延伸，35轮。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测。
5’-RACE：(1)cDNA的准备：以oligo dT为引物准备cDNA，并利用氯仿抽提，异丙醇沉淀，75％乙醇清洗，最后以水溶解沉淀然后进行添加poly dC的反应。反应体系为：已经清洗的3’cDNA 15μL；5×TdT缓冲液4μL；0.1％BSA0.2μL；dCTP 0.5μL；TdT 1μL；置于37℃水浴1h，然后置于75℃水浴15min终止反应。最后在体系中添加1μL 20μM 5’-race-anchor。
(2)第1轮5’RACE：以上述cDNA为模板进行扩增，体系为：ddH2O39.5μL；10×easytaq缓冲液5μL；10mM dNTP 1μL；5’race-short-outer引物(20μM)1μL；GSP 1μL；cDNA 2μL，easytaq 0.5μL。PCR程序为：94℃，3min；94℃，30s，60℃，45s，72℃，2min，共10轮；94℃，30s；50℃，1min；72℃，2min，25轮；72℃，10min。电泳检测上样10μL。
(3)第2轮5’RACE：体系为：ddH2O 40.5μL；10×easytaq缓冲液5μL；10mM dNTP 1μL；5’Nest(20μM)1μL；GSP 1μL；胶回收产物或者PCR产物1μL，easytaq 0.5μL。PCR程序为：94℃，3min；94℃，30s，60℃，45s，72℃，2min，共35轮；72℃，10min。电泳检测上样10μL。T克隆体系为：片段6.5μL，pMD19(simple)0.5μL，Solution I 7μL；16℃金属浴1h。转化Top10，涂于氨苄平板。
电泳结果显示在图4中。
1.4HsLDC拼接
以3’&5’RACE得到的序列拼接而成LDC的全长，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示，推测的拼接HSLDC的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。
选取几个植物源的LDC进行同源比对以及进化分析，结果如图5所示。同源比对分析显示所鉴定出来的LDC的保守功能域都存在，判断所鉴定的基因属于LDC家族。
此外，进化树分子显示(图6)所鉴定的基因在蕨类植物或苔藓类的LDC分支上。与物种的整体进化有一定的相关性，与低等植物分支一致。
1.5利用高保真酶扩增LDC全长并克隆表达
利用高保真酶扩增LDC全长并克隆表达，所得序列的比对结果如图8和9所示。比对结果显示所得的LDC在DNA水平和蛋白质水平都存在一些差异，初步判断此基因存在选择性剪切或者存在复杂的二级结构。所得序列的DNA序列分别如SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示。
1.6HsLDC体外活性验证(HsLDC-1)
挑选HsLDC-1进行表达载体构建。利用PCR在HsLDC DNA片段两端加入Nde I和XhoI酶切位点，然后利用酶切连接的方法将其连接至双酶切的载体pET28a(Nde I/Xho I)上得到载体pET28a::HsLDC-N-His6。将构建好的HsLDC-1表达载体转化至BL21(DE3)，挑选单克隆进行过夜培养(LB，含有终浓度50mg/L的卡那霉素)，并按照1％的比例接种新鲜含有等浓度的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600至0.6左右，冰水浴冷却，添加终浓度0.5mM的IPTG，16℃诱导表达过夜。12000rpm离心收菌，菌体冻存于-80℃或立即进行纯化。取HsLDC表达的大肠杆菌菌体，利用缓冲液A(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)重悬，经压榨破碎后离心(18000rpm，4℃，30min)。取上清与适量的NTA-Ni柱料结合，用缓冲液A、40mM咪唑(利用缓冲液A配制)和500mM咪唑(利用缓冲液A配制)分别进行洗脱。
SDS-PAGE分析如图10(左图)所示，经过纯化可以得到比较纯的HsLDC-1蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。LDC纯化样品的全波长扫描结果显示在300-400nm波长下有吸收，初步判断含有辅因子磷酸吡哆醛(图10，右图)。
取纯化并透析除咪唑的HsLDC-1蛋白进行进一步体外活性检测。配制100μL反应体系，终浓度5μM的HsLDC-1，1mM PLP(5’-磷酸吡哆醛)，10mM L-赖氨酸37℃反应10min。反应液调整pH至10，加入适量的3,5-二硝基苯甲酰氯，混匀，超声反应20min。加入适量四氯化碳进行萃取，加入0.5g NaCl，3000g离心分层，取上层有机相，氮气吹干，适量乙腈溶解，LC-MS分析。如图12所示，在260nm高效液相色谱图以及在高分辨质谱上可以看到HsLDC-1催化产物衍生物A的生成。
对于另外5种LDC，可如下构建其表达载体。利用PCR分别在其DNA片段(SEQ ID NO:5、7、9、11和13)两端加入Nde I和Xho I酶切位点，然后利用酶切连接的方法将其连接至双酶切的载体pET28a(Nde I/Xho I)上得到相应的载体pET28a::HsLDC-N-His6。将构建好的HsLDC表达载体转化至BL21(DE3)，挑选单克隆进行过夜培养(LB，含有终浓度50mg/L的卡那霉素)，并按照1％的比例接种新鲜含有等浓度的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600至0.6左右，冰水浴冷却，添加终浓度0.5mM的IPTG，16℃诱导表达过夜。12000rpm离心收菌，菌体冻存于-80℃或立即进行纯化。取表达HsLDC大肠杆菌菌体，利用缓冲液A(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)重悬，经压榨破碎后离心(18000rpm，4℃，30min)。取上清与适量的NTA-Ni柱料结合，用缓冲液A、40mM咪唑(利用缓冲液A配制)和500mM咪唑(利用缓冲液A配制)分别进行洗脱。
可如下进行体外活性验证。配制100μL反应体系，终浓度5μM的各HsLDC蛋白，1mMPLP(5’-磷酸吡哆醛)，10mM L-赖氨酸37℃反应10min。实验结果表明，SEQ ID NO:6、8、10、12和14所示的LDC都能催化产物衍生物A的生成。
1.7HsLDC动力学
取纯化的HsLDC-1蛋白进行动力学测定。在反应缓冲液(150mM NaCl，100mM Tris-HCl，pH 7.5)里配制200μL反应液，成分含有NADH(1.75mM)，PEP(10mM)，PLP(0.8mM)，PEPC(PEP羧化酶)(2单位)，MDH(苹果酸脱氢酶)(8.24单位)，MgCl2(10mM)以及适量浓度的所选氨基酸底物。加入HsLDC-1(5.5μM)后开始监测在37℃下340nm吸光值的变化，从而推算出相应动力学参数。如表6所示，相对于其他底物而言HsLDC-1催化L-赖氨酸效率最高。
表6.HsLDC对9种氨基酸底物的动力学参数
1.8体内验证HsLDC活性并分析转HsLDC或HsCAO对烟草叶片尸胺和腐胺含量的影响
将HsLDC-1和HsCAO利用Gibbson重组技术构建至烟草表达载体pGambia2301上。将相应烟草表达载体及空载转化至GV3101农杆菌感受态细胞，挑选单克隆，在含有20mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的LB中28℃培养至OD600＝0.6,离心收菌，用MES缓冲液(10mMMES,10mM MgCl2,pH5.8)重悬，加入终浓度0.1mM的乙酰丁香酮，室温静置2h，然后将农杆菌打入烟草叶片内，继续培养两天，收集叶片。首先从叶片提取总RNA并制备成cDNA，利用PCR确定基因的表达。如图12所示，PCR检测背景没有HsLDC-1与HsCAO，转化的叶片都有相应转化基因的表达。
将转化的烟草叶片(HsLDC，HsCAO，HsLDC+HsCAO，野生型对照，转空载对照)冻干，称取冻干的叶片100mg，加入2mL的5％高氯酸，4℃静置1h以上，12000rpm，离心1min，取浸液，用0.2μm的滤膜过滤，取1mL于10mLEP管，加入1mL 5％高氯酸，加入50μL的4M NaOH，加入100μL 0.5M硼酸缓冲液(pH 10.0)，加入680μL 56mM 3,5-二硝基苯甲酰氯(用乙腈配制)，涡旋混匀，室温超声15min，加入500mg NaCl，加入205μL四氯化碳，涡旋1min，5000rpm，离心5min，取有机相，N2或者风机吹干，加入50μL乙腈溶解。相应的尸胺用2mL 10μg/mL的标品(溶于0.1M HCl)进行衍生化与萃取。如图14和15所示，转化HsLDC的叶片相对于野生型以及转化空载的叶片的腐胺的含量基本没有变化，而尸胺的含量从不能检测到变成了含量远大于其他生物胺，达0.75mg/g干重的含量。此含量是目前植物来源LDC所能达到的最大值。体内的数据证明了其对L-赖氨酸的选择性，故此酶可以定义为赖氨酸脱羧酶(LDC)。
2体外和体内HsLDC-HsCAO偶联催化生产5-氨基戊醛及其检测方法
2.1同时检测HsLDC和HsCAO产物的方法
将HsLDC-1和HsCAO共反应体系(其组成如下文第2.2.2节的“偶联体系”所示)的反应液调pH至7，适量的硼氢化钠处理反应液30min，将5-氨基戊醛还原成5-氨基戊醇；用1MHCl消耗掉剩余的硼氢化钠，然后调pH至10，加入适量的3,5-二硝基苯甲酰氯，混匀，超声反应20min生成衍生物A以及衍生物B；加入适量四氯化碳萃取产物的衍生物A和B，加入适量NaCl，3000g离心分层，取上层有机相，氮气吹干，适量乙腈溶解待分析。
HsLDC和HsCAO催化产物的衍生化原理如图15所示。
2.2体外偶联HsLDC和HsCAO生产5-氨基戊醛
2.2.1HsCAO蛋白纯化
利用PCR在HsCAO DNA片段两端加入Nde I和Xho I酶切位点，然后利用酶切连接的方法将其连接至双酶切的载体pET24a(Nde I/Xho I)上得到载体pET24a::HsLDC-C-His6。将构建好的HsCAO表达载体转化至BL21(DE3)，挑选单克隆进行过夜培养(LB，含有终浓度50mg/L的卡那霉素)，并按照1％的比例接种新鲜含有等浓度的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600至0.6左右，冰水浴冷却，添加终浓度0.5mM的IPTG，16℃诱导表达过夜。
12000rpm离心收菌，菌体冻存于-80℃或立即进行纯化。取HsCAO表达的大肠杆菌菌体，利用缓冲液A(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)重悬，经压榨破碎后离心(18000rpm，4℃，30min)取上清与适量的NTA-Ni柱料结合，缓冲液A、20mM咪唑(利用缓冲液A配制)和500mM咪唑(利用缓冲液A配制)进行分别洗脱适量的体积。纯化结果如图16所示。
2.2.2衍生化原理
100μL的偶联体系(HsLDC+HsCAO+L-Lys)含有50μM的HsLDC-1和50μM的HsCAO，1mM的PLP，10mM L-赖氨酸，0.1mM CuSO4。
100μL的单独HsLDC反应体系(HsLDC+L-Lys)含有50μM的HsLDC-1，1mM的PLP，10mML-赖氨酸。
100μL的单独HsCAO反应体系(HsCAO+尸胺)含有50μM的HsCAO，10mM尸胺，0.1mMCuSO4。
各反应在37℃孵育1h，按照图15进行处理以及衍生化。如图17，在液相以及质谱水平都可以看到偶联反应。
2.3体内偶联HsLDC和HsCAO生产5-氨基戊醛
2.3.1大肠杆菌体系
分别构建大肠杆菌表达载体。HsLDC-1和HsCAO DNA片段两端利用PCR引入Nde I和Xho I酶切位点，然后利用酶切连接的方法连接至相应载体，得到pET28a::HsLDC和pET21a::HsCAO表达载体，将两个表达载体共转化至BL21(DE3)，氨苄青霉素和卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，挑取单克隆进行培养过夜，按照1％接种至新鲜含有50mg/L的氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养至OD600至0.6，添加1mM IPTG诱导目的蛋白的表达，20℃发酵2天；离心取发酵液按照图16进行衍生化。
大肠杆菌体系偶联HsLDC-1和HsCAO发酵液分析结果如图18所示。
2.3.2烟草体系转化
HsLDC和HsCAO烟草表达载体与体内验证HsLDC活性时一致，衍生化方法按照图15所示进行。如图19所示，单转HsLDC-1可以明显提高尸胺的含量，与前述一致；共转HsLDC-1和HsCAO使原本较高的尸胺含量明显降低，并发现了5-氨基戊醛的衍生物的积累。烟草体系比体外以及大肠杆菌体系更好地呈现了两个酶偶联生成5-氨基戊醛的活性。

Claims (10)

1.一种多肽，选自：
(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；
(2)在(1)所述的多肽序列中经过插入、缺失或突变一个或几个氨基酸且具有赖氨酸脱羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和
(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列与促进SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表达、分泌到胞外或纯化的多肽序列组成的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，(2)所述的多肽与SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示的多肽序列具有至少95％，优选至少96％，更优选至少97％的序列相同性；
优选地，所述序列获自蛇足石杉。
3.一种多核苷酸序列，其选自：
(1)编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；
优选地，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13所示的核苷酸序列。
4.一种核酸构建物，其含有权利要求3所述的多核苷酸序列；优选地，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的核酸构建物。
6.权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述多核苷酸序列或权利要求4所述核酸构建物在制备石松类生物碱尤其是石杉碱甲中的应用。
7.一种检测赖氨酸脱羧酶和/或铜胺氧化酶的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的尸胺和/或5-氨基戊醛的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
向待检测的反应体系中加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物A的存在和/或含量；或
向待检测的反应体系中加入还原剂如NaBH4，将5-氨基戊醛还原成5-氨基戊醇，然后加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物B的存在和/或含量；或
向待检测的反应体系中加入还原剂如NaBH4，将5-氨基戊醛还原成5-氨基戊醇，然后加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物A和衍生物B的存在和/或含量：
9.3,5-二硝基苯甲酰氯在检测赖氨酸脱羧酶的酶催化产物中的应用，或与任选的还原剂在检测铜胺氧化酶的酶催化产物中的应用。
10.一种反应混合物，含有酶、反应底物和辅因子，或含有酶和反应产物，其特征在于，所述反应混合物选自：
(1)含有的酶为赖氨酸脱羧酶，反应底物是L-赖氨酸，辅因子是5’-磷酸吡哆醛的反应混合物；
(2)含有的酶为铜胺氧化酶，反应底物为尸胺，辅因子是CuSO4的反应混合物；
(3)含有的酶是赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶，反应底物是L-赖氨酸，辅因子是5’-磷酸吡哆醛和CuSO4的反应混合物；
(4)含有的酶是赖氨酸脱羧酶，反应产物是下式所示的衍生物A的反应混合物；
(5)含有的酶是铜胺氧化酶，反应产物是下式所示的衍生物B的反应混合物；和
(6)含有的酶是赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶，反应产物是下式所示的衍生物A和衍生物B的反应混合物：
CN201610917305.8A 2016-10-21 2016-10-21 新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用 Active CN107974444B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610917305.8A CN107974444B (zh) 2016-10-21 2016-10-21 新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610917305.8A CN107974444B (zh) 2016-10-21 2016-10-21 新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107974444A true CN107974444A (zh) 2018-05-01
CN107974444B CN107974444B (zh) 2022-06-14

Family

ID=62003659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610917305.8A Active CN107974444B (zh) 2016-10-21 2016-10-21 新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107974444B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192225A1 (en) * 1998-03-31 2002-12-19 Maurelli Anthony T. Methods of identifying bacterial genes that are incompatible with bacterial pathogenicity, and the use of such genes, such as cadA, to reduce pathogenicity in a bacteria or to combat pathogenic bacterial infections
CN101793642A (zh) * 2009-12-17 2010-08-04 东北农业大学 豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法
CN103789292A (zh) * 2013-12-26 2014-05-14 南京工业大学 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用
CN105424823A (zh) * 2015-11-02 2016-03-23 贵州省烟草科学研究院 一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192225A1 (en) * 1998-03-31 2002-12-19 Maurelli Anthony T. Methods of identifying bacterial genes that are incompatible with bacterial pathogenicity, and the use of such genes, such as cadA, to reduce pathogenicity in a bacteria or to combat pathogenic bacterial infections
CN101793642A (zh) * 2009-12-17 2010-08-04 东北农业大学 豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法
CN103789292A (zh) * 2013-12-26 2014-05-14 南京工业大学 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用
CN105424823A (zh) * 2015-11-02 2016-03-23 贵州省烟草科学研究院 一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDGAR PINTO: "Sensitive quantitation of polyamines in plant foods by ultrasound-assisted benzoylation and dispersive liquid-liquid microextraction with the aid of experimental designs", 《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
JIEYIN SUN: "Molecular cloning and characterization of copper amine oxidase from Huperzia serrata", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 *
JOCHEN KIRSCHBAUM: "Liquid chromatographic determination of biogenic amines in fermented foods after derivatization with 3,5-dinitrobenzoyl chloride", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
娄永新: "《实用临床细菌学检验与进展》", 30 November 1993, 天津科技翻译出版公司 *
彭思露: "蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中赖氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及功能", 《微生物学报》 *
杜次: "蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析", 《生物工程学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107974444B (zh) 2022-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113073089B (zh) 一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法
CN104673810B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因mimdh1及其重组表达载体
CN112626057B (zh) 一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用
CN108103120A (zh) 一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成l-天冬氨酸的方法
CN105936909A (zh) 一种醇脱氢酶及其基因、重组酶和合成手性双芳基仲醇的应用
CN103614349B (zh) 一种烯醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及其应用
JP6279478B2 (ja) ヒダントイナーゼの突然変異体
CN104673809B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN105296509B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因rkmdh2及其重组表达载体
CN112410356B (zh) 来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因rs及其应用
CN108913724A (zh) 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
CN107099559A (zh) 生物技术制备甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物的方法
CN105200068A (zh) 一种meso-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因、重组酶及其制备方法和应用
CN107974444A (zh) 新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用
CN101942422B (zh) 粘质沙雷氏菌d-乳酸脱氢酶基因,克隆、表达重组菌株及重组酶的研究
CN112481320B (zh) 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法
CN105255916B (zh) 一种编码具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因
CN112442474B (zh) 一种(-)γ-内酰胺的制备方法
KR100209785B1 (ko) 무작위적 돌연변이유발법을 이용한 돌연변이티로신 페놀리아제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 돌연변이 티로신 페놀리아제
CN110438055A (zh) 一种含有苯丙酮酸脱羧酶突变体的全细胞催化剂及在生产苯乙醇中的应用
CN106318917A (zh) 天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用
CN110093362A (zh) 高效辅助产氢的功能基因载体pET32a-fdhD及其构建
CN113684195B (zh) 一种甾醇酯酶和其编码基因及其突变体
KR20020056894A (ko) 신규 카르보닐 환원효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200609

Address after: 200032 building 4, No. 300 Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai

Applicant after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031, 319 Yueyang Road, Shanghai, Shanghai, Xuhui District

Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant