CN115718160B

CN115718160B - 一种lc-ms/ms检测血浆中gmdtc及其代谢产物的方法

Info

Publication number: CN115718160B
Application number: CN202211481122.8A
Authority: CN
Inventors: 胡伟; 唐小江
Original assignee: Jian Er Sheng Zhuhai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Jian Er Sheng Zhuhai Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-24
Filing date: 2022-11-24
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2042-11-24
Also published as: CN115718160A

Abstract

本发明提供了一种LC‑MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法，属于药物分析技术领域，本发明的方法包括如下步骤：S1.将含有抗凝剂的全血样品与沉淀剂混合，离心处理，得到上清液为血浆样品；将所述血浆样品与内标溶液混合，离心处理后，经稀释液稀释，得到待测的样品溶液；S2.标准曲线溶液制备；S3.LC‑MS/MS测定。通过选择合适的沉淀剂、稀释剂、内标，制得含有GMDTC及其代谢产物的样品溶液，再采用液相色谱‑质谱联用方法进行检测，可以实现对于血浆中的GMDTC和D2A的准确定性、定量检测，检测结果准确度高、精密度高，且耗时短，可以有效应用在药代动力学和生物等效性研究。

Description

一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其是一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法。

背景技术

N-(2,3,4,5,6-五羟基己基)N-(二硫代甲酸钠基)-蛋氨酸钠，简称GMDTC，结构式为是在二硫代氨基甲酸酯类(DTC)的基础上经取代的化合物。现有技术已有报道，GMDTC是一种重金属驱除剂，具有良好的驱镉效果，能有效穿过细胞膜进入胞内。根据动物实验，GMDTC能有效地将肾脏中蓄积的镉驱除，并且毒副作用小，填补了已有药物不能驱除肾脏中镉的空白。

GMDTC经非酶代谢会产生代谢产物D2A，结构式为GMDTC作为细胞内金属驱除剂，目前暂未有关于血浆中GMDTC的生物分析方法的报道。因此，有必要开发出一种快速、高效的检测方法，用来检测血浆中的GMDTC及其代谢产物。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法，包括如下步骤：

S1.样品溶液制备：

将含有抗凝剂的全血样品与沉淀剂混合，离心处理，得到上清液为血浆样品；将所述血浆样品与内标溶液混合，离心处理后，经稀释液稀释，得到待测的样品溶液；

S2.标准曲线溶液制备：

分别称取GMDTC标准品、D2A标准品，经溶解、定容并稀释，得到GMDTC标准工作溶液和D2A标准工作溶液；

分别将所述GMDTC标准工作溶液、D2A标准工作溶液与空白生物基质混合，配制为具有浓度梯度的GMDTC标准曲线溶液、D2A标准曲线溶液；

S3.LC-MS/MS测定：

分别取样品溶液和标准曲线溶液，采用液相色谱-串联质谱法进行定性检测或定量检测。

本发明的检测方法中，通过选择合适的沉淀剂、稀释剂、内标，制得含有GMDTC及其代谢产物的样品溶液，制备标准曲线溶液，再采用液相色谱-质谱联用方法进行检测，可以实现对于血浆中的GMDTC和D2A的准确定性、定量检测，检测结果准确度高、精密度高，且耗时短。

优选地，步骤S1中，所述抗凝剂为Na₂EDTA和/或K₂EDTA。

更优选地，步骤S1中，所述抗凝剂为Na₂EDTA和K₂EDTA的混合物。

优选地，步骤S1中，所述沉淀剂为氨水溶液，或乙腈水和氨水混合溶液。

本发明所采用的沉淀剂为氨水溶液或乙腈水和氨水混合溶液。氨水保证了GMDTC在血浆中的稳定性，GMDTC及其代谢产物D2A在含有氨水的条件下稳定。

优选地，所述沉淀剂为氨水溶液时，氨水占50～70％(v/v)、水占30～50％(v/v)；所述沉淀剂为乙腈水和氨水混合溶液时，乙腈占60～90％(v/v)、水占10～40％(v/v)、氨水占1～5％(v/v)。

优选地，步骤S1中，所述内标溶液为溶有内标的乙腈水溶液，所述内标为美托拉宗。

本发明选择美托拉宗(IS)为内标，结构式为IS为胺类化合物常用标准内标，并且发明人研究发现，IS对GMDTC和D2A的LC-MS/MS检测没有干扰。以乙腈水溶液为内标溶液的基体溶剂，有助于保证样品溶液中的GMDTC及其代谢产物的稳定性。

优选地，所述内标溶液中IS的浓度为50～100ng/mL，乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为2:1～5:1。

优选地，步骤S1中，所述稀释液为溶有Na₂EDTA的氨水溶液。

优选地，所述稀释液中Na₂EDTA的浓度为0.3-0.5g/100mL，氨水的浓度为1～2％(v/v)。

优选地，步骤S1为：在2～8℃条件下，将全血样品加至含有抗凝剂的棕色离心管中，加入沉淀剂，在13000～18000g离心力下进行离心处理8-15min，取上清得到血浆样品；将所述血浆样品与内标溶液等体积混合，进行涡旋处理，然后在2～8℃、3200g条件下离心10～15min，用稀释液稀释，得到待测的样品溶液。

优选地，步骤S2中，所述GMDTC标准工作溶液的浓度梯度分别为1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL。

具体地，所述GMDTC标准工作溶液的配置可以按照如下方法：称取GMDTC标准品，用氨水溶液溶解并定容，得到浓度为1mg/mL的GMDTC储备液，再使用乙腈水和氨水混合溶液进行稀释，配置为具有浓度梯度的GMDTC标准工作溶液。

用空白生物基质配置GMDTC标准曲线样品，GMDTC标准曲线溶液的浓度范围为50～5000ng/mL。具体地，所述GMDTC标准曲线溶液的浓度分别为：50.0、100、200、500、1000、1250、2500、5000ng/mL。

优选地，GMDTC标准工作溶液的配置中，所述氨水溶液的氨水浓度为0.1％(v/v)。

优选地，GMDTC标准工作溶液的配置中，所述乙腈水和氨水混合溶液中，乙腈的浓度为70％(v/v)，氨水的浓度为1.25％(v/v)。

优选地，步骤S2中，所述D2A标准工作溶液的浓度梯度分别为1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL

具体地，所述D2A标准工作溶液的配置可以按照如下方法：称取D2A标准品，用甲醇水溶液溶解并定容，得到浓度为1mg/mL的D2A储备液，再使用甲醇水溶液进行稀释，配置为具有浓度梯度的D2A标准工作溶液。

用空白生物基质配置D2A标准曲线样品，D2A标准曲线溶液的浓度范围为50～5000ng/mL。具体地，所述D2A标准曲线溶液的浓度分别为：50.0、100、200、500、1000、1250、2500、5000ng/mL。

优选地，D2A标准工作溶液的配置中，所述甲醇水溶液的甲醇浓度为50％(v/v)。

优选地，步骤S3中，所述液相色谱的分析条件为：

色谱柱：C18色谱柱；柱温为25～40℃，进样体积为3～10uL，流速0.5～0.8mL/min；流动相A为5～20mmol碳酸氢铵水溶液，流动相B为90～98％(v/v)乙腈水溶液，进行梯度洗脱。

更优选地，步骤S3中，所述液相色谱的分析条件为：

色谱柱：waters XBridge C18色谱柱，规格为4.6×150mm，5μm；柱温为35℃，进样体积为5uL，流速0.6mL/min；流动相A为10mmol碳酸氢铵水溶液，流动相B为95％(v/v)乙腈水溶液，进行梯度洗脱。

优选地，步骤S3中，所述梯度洗脱的条件为：

0～0.2min，流动相A 70％，流动相B 30％；0.2～2min，流动相A 70％→15％，流动相B 30％→85％；2～5min，流动相A 15％，流动相B 85％；5～5.1min，流动相A 15％→70％，流动相B 85％→30％；5.1～6min，流动相A 70％，流动相B 30％；

或

0～0.2min，流动相A 60％，流动相B 40％；0.2～2.1min，流动相A 60％→10％，流动相B 40％→90％；2.1～4min，流动相A 10％，流动相B 90％；4～4.1min，流动相A 10％→60％，流动相B 90％→40％；4.1～5min，流动相A 60％，流动相B40％。

更优选地，步骤S3中，所述梯度洗脱的条件为：

0～0.2min，流动相A 70％，流动相B 30％；0.2～2min，流动相A 70％→15％，流动相B 30％→85％；2～5min，流动相A 15％，流动相B 85％；5～5.1min，流动相A 15％→70％，流动相B 85％→30％；5.1～6min，流动相A 70％，流动相B 30％。

优选地，步骤S3中，所述质谱的分析条件为：离子源为电喷雾离子源；喷雾电压5500V；喷雾温度为400～600℃；扫描模式为多反应离子监测扫描模式；GMDTC的离子对为m/z 390.062-324.1，D2A离子对为324.1-133.0，美托拉宗的离子对为366-259.2。

优选地，步骤S3中，所述多反应离子监测的参数为：

优选地，步骤S3中，所述质谱的分析条件中：GS1为50～100psi，GS2为50～100psi，帘气为30～50psi。

更优选的，步骤S3中，所述质谱的分析条件中：GS1为55psi，GS2为55psi，帘气为40psi。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明开发了一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法，本发明的检测方法通过选择合适的沉淀剂、稀释剂、内标，制得含有GMDTC及其代谢产物的样品溶液，制备标准曲线溶液，再采用液相色谱-质谱联用方法进行检测，可以实现对于血浆中的GMDTC和D2A的准确定性、定量检测，检测结果准确度高、精密度高，且耗时短，可以有效应用在药代动力学和生物等效性研究。

附图说明

图1为实施例2的GMDTC、D2A以及内标的LC-MS/MS色谱图。

图2为GMDTC和D2A的标准曲线样图。

图3为实施例6的雌性大鼠GMDTC和D2A血药浓度-时间曲线。

图4为实施例7的比格犬GMDTC和D2A血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本申请实施例和对比例中，采用AB Sciex公司的QTRAP 5500液相质谱联用仪，Waters公司的XBridge C18 4.6×150mm 5μm色谱柱；贝克曼离心机，使用AB SCIEX公司的Analyst 1.7.1软件输出原始图谱、浓度、准确度等数据。GMDTC和D2A标准品来自凯莱英(生命)科学技术有限公司，美托拉宗(99.88％)购自于大连美仑生物技术有限公司，其他试剂均为市售HPLC或GR级别试剂。

本申请中涉及比格犬、大鼠、新西兰兔的实验中，动物许可证为：SYXK(粤)2020-0229。动物实验经珠海百试通生物科技有限公司动物伦理委员会批准。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

本实施例提供一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法，具体包括如下步骤：

(1)稀释液的配制

稀释液1：70％乙腈水-1.25％氨水：取70mL乙腈，加入30mL超纯水和1.25mL氨水，涡旋混匀后待用；

稀释液2：0.1％氨水：取50mL超纯水，加入50μL氨水，涡旋混匀后待用；

稀释液3：50％甲醇水：取25mL甲醇，加入25mL超纯水，涡旋混匀后待用；

稀释液4：80％ ACN/MeOH：取20mL甲醇，加入80mL乙腈，涡旋混匀后待用；

稀释液5：10mmol/L Na₂EDTA-1.25％氨水：称取约0.168g Na₂EDTA，加入50mL超纯水溶解，过滤膜后加入0.625mL氨水，涡旋混匀后待用。

(2)大鼠空白生物基质的制备

取适量K₂EDTA抗凝的空白Sprague-Dawley大鼠全血加入适量体积的稀释液1，使最终加入溶液体积与全血体积比为3：1(mL：mL)，混匀后，在约16000g，2～8℃条件下，离心10min，吸取上清液，作为空白生物基质。

(3)标准曲线溶液配制和质控溶液配制

GMDTC标准曲线溶液配制：

称取约2mg标准品GMDTC，以稀释液2溶解后定容至2mL，得浓度约为1mg/mL的GMDTC储备液Stock A1；以稀释液1为稀释液，配制标准工作溶液，GMDTC标准工作溶液浓度分别为：1、2、4、10、20、25、50、100ug/mL；用空白生物基质配置GMDTC标准曲线样品，浓度分别为：50.0、100、200、500、1000、1250、2500、5000ng/mL。

D2A标准曲线溶液配制：

称取约2mg标准品D2A，以稀释液3溶解后定容至2mL，得浓度约为1mg/mL的D2A储备液Stock A2；以稀释液3为稀释液，配制标准工作溶液，D2A标准工作溶液浓度分别为：1、2、4、10、20、25、50、100ug/mL；用空白生物基质配置D2A标准曲线样品，浓度分别为：50.0、100、200、500、1000、1250、2500、5000ng/mL。

GMDTC定量下限(LLOQ)及质控(QC)溶液配制：

取GMDTC储备液Stock A1，以稀释液1为稀释液，配制定量下限(LLOQ)及质控(QC)工作溶液，浓度分别为1.00、3.00、16.0、80.0ug/mL，用空白生物基质配置LLOQ和QC样品，浓度为分别为50.0ng/mL(LLOQ)、150ng/mL(LQC)、800ng/mL(MQC)和4000ng/mL(HQC)。

D2A定量下限(LLOQ)及质控(QC)溶液配制：

取储备液Stock A2，以稀释液3为稀释液，配制定量下限(LLOQ)及质控(QC)工作溶液，浓度分别为1.00、3.00、16.0、80.0ug/mL，用空白生物基质配置LLOQ和QC样品，浓度为分别为50.0ng/mL(LLOQ)、150ng/mL(LQC)、800ng/mL(MQC)和4000ng/mL(HQC)。

内标溶液配制：

称取约2mg内标(IS)，加入2mL乙腈溶解，配制浓度约为1mg/mL内标储备液；以稀释液4为稀释液，将内标储备液稀释至浓度为50.0ng/mL的内标溶液。

(4)样品溶液制备

全血样品处理方法与步骤(2)一致，得到血浆样品后储存在-60℃。待分析时，取血浆样品置于装有碎冰的冰盒内、避光条件下完全解冻(如为冻存样品)并混匀后才可进行取样；取标准曲线溶液、质控溶液或其他验证样品溶液100μL，加入100μL内标工作液(空白样品不加内标工作液，直接加入100μL的稀释液4)，涡旋混匀后，2～8℃条件下约3200g离心15min；吸取上清液50.0μL，加入200μL稀释液5，涡旋混匀后，即为样品溶液，用于LC-MS/MS进样分析。

(5)液相色谱分析条件

色谱柱：XBridge C18 4.6×150mm 5μm，柱温35℃，流速：0.6mL/min，进样体积：5μL，自动进样器温度4℃，切换阀：1.2min入质谱；4.6min入废液；流动相A相：10mmol/L碳酸氢铵水溶液，流动相B相：95％乙腈水，流动相洗脱梯度如表1。

表1

采集时间(min)	0.2	2.1	4	4.1	5.0
						A相(％)	60	10	10	60	60
B相(％)	40	90	90	40	40

(6)质谱分析条件

使用带有ESI源的QTRAP 5500质谱，采用正离子MRM扫描，喷雾电压5500V；喷雾温度为400℃；扫描模式为多反应离子监测扫描模式；GS1为55psi，GS2为55psi，帘气为40psi。化合物参数见表2。

表2

实施例2

本实施例为对实施例1的方法的方法学考察。

按2020年版《中国药典》四部生物样品定量分析方法验证指导原则的要求，验证分析方法的有效性。

(一)专属性考察

分别取6只不同个体的未混合的空白生物基质，按样品溶液制备方法处理后进样分析,内标干扰性通过分析使用不含内标进行处理的ULOQ浓度水平样品进行考察，待测物干扰性通过分析处理后的含内标及单一待测物的样品进行考察，静脉给药后8min全血样品，制备为样品溶液，然后进行血样分析。GMDTC和D2A在待测物保留时间处无干扰峰；在内标保留时间处平均干扰峰峰面积小于标准曲线及质控样品内标平均峰面积的5％。GMDTC、D2A和内标保留时间分别为2.04、2.18、3.88min。

具体的检测结果见图1。图1中其中A、D分别为空白血浆样品的GMDTC、D2A检测结果；B、E分别为标准曲线定量下限样品的GMDTC、D2A检测结果；C、F分别为静脉给药8min血浆样品的GMDTC、D2A检测结果。

(二)线性考察

标准曲线包含一个空白(Blank)样品、一个零浓度(Zero)样品及至少6个非零浓度点。GMDTC、D2A的线性范围为50.0～5000ng/mL，6个非零浓度点且75％的标准曲线点(包含LLOQ与ULOQ)满足准确度(％DEV)不超过±15％，LLOQ的准确度(％DEV)不超过±20％。相关系数均大于0.99。其中GMDTC的典型标准曲线为y＝3.37e-005x-3.52e-005r＝0.9995，D2A的典型标准曲线为y＝0.0013x+0.0105r＝0.9942。

图2A为GMDTC标准曲线样图，图2B为D2A标准曲线样图。

(三)精密度和准确度考察

准确度的定义为每个样品的实测浓度与理论浓度的偏差(％DEV)，精密度的定义为变异系数(％CV)。以一条标准曲线、4个浓度(LLOQ、QCL、QCM及QCH)水平，每个浓度水平各6份样品，组成1个分析批，至少运行3个分析批评价准确度与精密度。

GMDTC：考察6个分析批，每批次各考察4个浓度(50.0、150、800、4000ng/mL)水平，每个浓度的质控样本各6个。每个浓度水平的批内及批间的准确度(％DEV)均不超过±15％，LLOQ不超过±20％；批内及批间的精密度(％CV)均不超过15％，LLOQ不超过20％。

D2A：考察5个分析批，每批次各考察4个浓度(50.0、150、800、4000ng/mL)水平，每个浓度的质控样本各6个。每个浓度水平的批内及批间的准确度(％DEV)均不超过±15％，LLOQ不超过±20％；批内及批间的精密度(％CV)均不超过15％，LLOQ不超过20％。结果如表3所示，均符合要求。

表3

(四)基质效应和回收率考察

6只不同个体Sprague-Dawley大鼠的空白生物基质用于基质效应的评估。基质效应通过比较使用提取后的空白生物基质加入待测物及内标溶液至低浓度质控(QCL)和高浓度质控(QCH)浓度的样品与同样浓度待测物及内标的纯溶液样品的峰面积来判定。回收率通过比较3个QC浓度的QC样品与提取后的空白生物基质加入待测物及内标溶液至相同浓度样品的峰面积来判定。GMDTC和D2A低、中、高三个质控浓度水平各浓度及浓度间样品的回收率的％CV均不超过15％，所有样品的内标回收率的％CV不超过15％；低、高两个质控浓度水平各浓度及浓度间样品的内标归一化基质因子的％CV均不超过15％。结果如表4所示，均符合要求。

表4

(五)稀释可靠性考察

超过ULOQ浓度的样品需以空白生物基质为稀释液进行10倍、100倍及500可靠性的评估。

GMDTC和D2A超过ULOQ浓度的样品进行10倍、100倍及500倍的稀释可靠性的考察，每个稀释因子的平均％DEV均在理论浓度的±15％以内，％CV均在15％以内。具体结果见表5。

表5

(六)稳定性考察

配置两个浓度GMDTC和D2A质控样品，考察以下情况稳定性：

全血上清液样品稳定性：

GMDTC和D2A：全血上清液样品在装有碎冰的冰盒中避光放置大于4h、-60℃以下避光放置大于28天及反复冻融3次稳定。

GMDTC和D2A：处理后样品自动进样器4℃放置大于72h后进行。

结果镉浓度样品的平均％DEV均在理论浓度的±15％以内，％CV均在15％以内，稳定性考察合格，结果见表6。

表6

实施例2

本实施例区别实施例1在于，将空白血浆由大鼠换为比格犬，稀释剂1更换为稀释液6，Na₂EDTA更换为K₂EDTA。稀释液6配制方法为：取50mL超纯水，加入50mL氨水，涡旋混匀，离心力为18000g，时间为8min。

比格犬血浆中的GMDTC及其代谢产物分析方法验证内容：专属性、线性、精密度、准确度、基质效应、回收率、稳定性均满足要求，GMDTC全血上清液样品在装有碎冰的冰盒中避光放置6h、-60℃以下避光放置58天，反复冻融3次及自动进样器中46h稳定，D2A全血上清液样品在装有碎冰的冰盒中避光放置6、-60℃以下避光放置21天及反复冻融3次及自动进样器中74h稳定。

实施例3

本实施例区别实施例1在于，将空白血浆由大鼠换为新西兰兔，稀释剂1更换为稀释液7，稀释液7配制方法为：取30mL超纯水，加入70mL氨水，涡旋混匀，涡旋混匀，离心力为13000g，时间为15min，内标为100ng/mL。

新西兰兔血浆中的GMDTC及其代谢产物分析方法验证内容：专属性、线性、精密度、准确度、基质效应、回收率、稳定性均满足要求，GMDTC全血上清液样品在装有碎冰的冰盒中避光放置6h、-60℃以下避光放置41天，反复冻融3次及自动进样器中83h稳定，D2A全血上清液样品在装有碎冰的冰盒中避光放置6、-60℃以下避光放置41天及反复冻融3次及自动进样器中95h稳定。

实施例4

本实施例区别实施例1在于，流动相A相更换为90％乙腈水溶液，流动相B相更换为20mmol碳酸氢铵水溶液，流速为0.5mL/min，流动相洗脱梯度如表7。经检测，增加GMDTC和D2A保留时间，可以用于GMDTC和D2A的有效定量。

表7

采集时间(min)	0.2	2.0	5.0	5.1	6
						A相(％)	70	15	15	70	70
B相(％)	30	85	85	30	30

实施例5

本实施例区别实施例1在于，色谱条件中进样体积为10μL,柱温为40℃，流速为0.8mL/min。经检测，内源性物质对GMDTC、D2A和内标均无干扰。

实施例6

本实施例提供血浆样本检测。GMDTC注射药代动力学研究，采用18只SD大鼠进行实验，分为三组，剂量分别为50、100、250mg/kg，每组雌雄各三只，不同时间点镉采集0.25ml血样，按照已建立方法处理血样，并检测，其中雌性大鼠GMDTC和其代谢产物血药浓度-时间曲线见图3。

实施例7

本实施例提供血浆样本检测。GMDTC注射药代动力学研究，采用18只比格犬进行实验，分为三组，剂量分别为25、75、225mg/kg，每组雌雄各三只，不同时间点镉采集0.25ml血样，按照已建立方法处理血样，并检测，其中高剂量组犬GMDTC和其代谢产物D2A血药浓度-时间曲线见图4。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种LC-MS/MS检测血浆中GMDTC及其代谢产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.样品溶液制备：

S2.标准曲线溶液制备：

其中，D2A的结构式为

S3.LC-MS/MS测定：

分别取样品溶液和标准曲线溶液，采用液相色谱-串联质谱法进行定性检测或定量检测；

所述液相色谱的分析条件为：

色谱柱：C18色谱柱；柱温为25～40℃，进样体积为3～10uL，流速0.5～0.8mL/min；流动相A为5～20mmol碳酸氢铵水溶液，流动相B为90～98％乙腈水溶液，进行梯度洗脱；

梯度洗脱的条件为：0～0.2min，流动相A70％，流动相B 30％；0.2～2min，流动相A70％→15％，流动相B 30％→85％；2～5min，流动相A15％，流动相B85％；5～5.1min，流动相A15％→70％，流动相B 85％→30％；5.1～6min，流动相A 70％，流动相B 30％。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，包括如下(a)～(d)所述特征中的至少一种：

(a)所述抗凝剂为Na₂EDTA和/或K₂EDTA；

(b)所述沉淀剂为氨水溶液，或乙腈和氨水混合水溶液；

(c)所述内标溶液为溶有内标的乙腈水溶液，所述内标为美托拉宗；

(d)所述稀释液为溶有Na₂EDTA的氨水溶液。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1为：在2～8℃条件下，将全血样品加至含有抗凝剂的棕色离心管中，加入沉淀剂，在13000～18000g离心力下进行离心处理8-15min，取上清得到血浆样品；将所述血浆样品与内标溶液等体积混合，进行涡旋处理，然后在2～8℃、3200g条件下离心10～15min，用稀释液稀释，得到待测的样品溶液。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述GMDTC标准曲线溶液的浓度范围为50～5000ng/mL；所述D2A标准曲线溶液的浓度范围为50～5000ng/mL。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，称取GMDTC标准品，用氨水溶液溶解并定容，得到GMDTC储备液，再使用乙腈和氨水混合水溶液进行稀释，配置为具有浓度梯度的GMDTC标准工作溶液；称取D2A标准品，用甲醇水溶液溶解并定容，得到D2A储备液，再使用甲醇水溶液进行稀释，配置为具有浓度梯度的D2A标准工作溶液。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述质谱的分析条件为：离子源为电喷雾离子源；喷雾电压5500V；喷雾温度为400～600℃；扫描模式为多反应离子监测扫描模式；GMDTC的离子对为m/z 390.062-324.1，D2A离子对为324.1-133.0，美托拉宗的离子对为366-259.2。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述多反应离子监测的参数如下，参数的单位为V：

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述质谱的分析条件为：GS1为50-100psi，GS2为50-100psi，帘气为30-50psi。