CN110824054A - 附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法。该附子指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：制备对照品溶液；制备附子供试品溶液；分别量取相同体积的对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱柱以测定得到附子的指纹图谱。本申请提供的附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法可以快速精确地建立起附子指纹图谱，从而能达到对药材进行全面质量评价的目的。

Description

附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法
技术领域
本申请涉及附子指纹图谱测定的技术领域，具体而言，涉及一种附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法。
背景技术
中药指纹图谱是指某种中药材及其制剂中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱，指纹图谱的建立对于有效控制药材及其制剂的质量具有十分重要的意义。
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，主要功效为回阳救逆，补火助阳，散寒止痛。《中人民共和国药典2015版》对附子(黑顺片)中双酯型生物碱的限量和单酯型生物碱的含量分别进行了控制，但未建立药材的特征图谱或指纹图谱，不能达到对药材进行全面质量评价的目的。
针对上述问题，目前尚未有有效的技术解决方案。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法，以快速精确地建立起附子指纹图谱，从而能达到对药材进行全面质量评价的目的。
第一方面，本申请实施例提供了一种附子指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
制备对照品溶液：称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液以制成对照品溶液，其中，每lml对照品溶液各含苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱质量相等；
制备附子供试品溶液：称取附子粉末适置于容器中，在该容器中加入氨试液适量浸润，然后量取异丙醇－二氯甲烷适量加入容器称定重量a1，超声处理、放冷、再称定重量a2，采用异丙醇－二氯甲烷混合溶液补足减失的重量a1－a2；然后，摇匀、滤过得到滤液；精密量取续滤液适量，减压回收溶剂至干得残渣，然后将残渣加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液适量溶解并定容，摇匀滤过，取续滤液即得附子供试品溶液；
分别量取相同体积的对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱柱以测定得到附子的指纹图谱；其中，色谱条件为：三乙胺为流动相A，以甲醇为流动相B，分别对所述对照品溶液与供试品溶液进行梯度洗脱，使得所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比降低，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比升高。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，所述三乙胺的pH为5－5.5，所述三乙胺的重量含量百分数0.15wt％－0.25wt％。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，所述三乙胺的重量含量百分数为0.20wt％；所述流动相A的pH值为5.3。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，所述异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，所述附子粉末与所述氨试液的比例为0.04g/ml，所述氨试液的体积为50ml。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，在所述梯度洗脱过程中：
在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由67％－73％降至42％－48％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由27％－33％升至52％－58％；
在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由42％－48％降至24％－30％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由52％－58％升至70％－76％；
在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由24％－30％降至7％－13％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由70％－76％升至87％－93％。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，在所述梯度洗脱过程中：
在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由70％降至45％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由30％升至55％；
在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由45％降至27％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由55％升至73％；
在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由27％降至10％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由73％升至90％。
在本申请实施例所述的附子指纹图谱的建立方法中，所述色谱柱的型号为ThermoHypersil BDS C18；参数为4.6mm×250mm，5μm。
第二方面，本申请实施例还提供了一种附子指纹图谱，所述附子指纹图谱由上述任一项所述的附子指纹图谱的建立方法构建而成。
第三方面，本申请实施例还提供了一种附子质量检测方法，包括：将上述的附子指纹图谱与待检测的参附注射液的指纹图谱进行比较。
本申请提供的附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法可以快速精确地建立起附子指纹图谱，从而能达到对药材进行全面质量评价的目的。
本申请的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请实施例了解。本申请的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例提供的附子指纹图谱的建立方法所建立的附子指纹图谱。
图2为本申请实施例提供的参附注射液附子成分指纹图谱建立方法所建立的参附注射液附子成分的指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
第一实施例
本申请实施例提供了一种附子指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
S101、制备对照品溶液：称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液以制成对照品溶液，其中，每lml对照品溶液各含苯甲酰新乌头原碱9μg－11μg、苯甲酰乌头原碱9μg－11μg、苯甲酰次乌头原碱9μg－11μg。
进一步地，在一些实施例中，该异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。每lml对照品溶液各含苯甲酰新乌头原碱10μg、苯甲酰乌头原碱10μg、苯甲酰次乌头原碱10μg。苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱通过该异丙醇－二氯甲烷混合溶液进行溶解，可以得到较好的溶解效果，将异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1时，可以达到最好的溶解效果。当然可以理解地，也可以采用其他溶液来溶解该苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱。
S102、制备附子供试品溶液：称取附子粉末适置于容器中，在该容器中加入氨试液适量浸润，然后量取异丙醇－二氯甲烷50ml加入容器称定重量a1，超声处理28－35min、放冷、再称定重量a2，采用用异丙醇－二氯甲烷混合溶液补足减失的重量a1－a2；然后，摇匀、滤过得到滤液；精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干得残渣，然后将残渣加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液溶解并定容至2ml，滤过，取续滤液即得附子供试品溶液。
进一步地，在一些实施例中，附子粉末与所述氨试液的比例为0.04g/ml。该异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。该容器为具有塞子的锥形瓶。超声处理的功率为250W，频率为50KHZ，水温在25摄氏度以下。超声处理的时间为30分钟，该附子粉末的质量为2.0g。在对该滤液进行减压处理时，保持温度在40摄氏度以下。
S103、分别量取相同体积的对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱柱以测定得到附子的指纹图谱；其中，色谱条件为：以pH为5－5.5的0.15wt％－0.25wt％的三乙胺为流动相A，以甲醇为流动相B，分别对所述对照品溶液与供试品溶液进行梯度洗脱，使得所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比从67％－73％降至7％－13％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比从27％－33％升至87％－93％；梯度洗脱过程中检测波长为230－240nm，柱温28－32℃，流速0.8－1.2ml/min。
进一步地，在一些实施例中，其中，流动相A的pH值为5.3，具体调试流动相A的pH值时，可以采用冰醋酸来进行调节。而由于流动相A的pH发生微小变化时对特征峰的保留时间影响在可接受范围内，但是峰面积受到流动相A的pH影响较大，故采用pH值为5.3的三乙胺作为流动相A。三乙胺的重量含量百分数0.20wt％。梯度洗脱过程中检测波长为235nm，柱温30℃，流速1ml/min。柱温在发生变化时，会对特征色谱峰的保留时间产生影响，将柱温设置为30℃可以保证保留足够时间。
其中，在进行梯度洗脱过程中：
在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由67％－73％降至42％－48％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由27％－33％升至52％－58％。在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由42％－48％降至24％－30％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由52％－58％升至70％－76％。在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由24％－30％降至7％－13％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由70％－76％升至87％－93％。通过在洗脱过程中控制流动相A的体积占流动相总量的比例，最终可以使得得到的指纹图谱重现性好，各个特征峰清晰度高。
具体地，在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由70％降至45％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由30％升至55％；在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由45％降至27％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由55％升至73％；在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由27％降至10％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由73％升至90％。通过在洗脱过程中控制流动相A的体积占流动相总量的比例，最终可以使得得到的指纹图谱重现性好，各个特征峰清晰度高。
在本实施例中，该色谱柱的型号为Thermo Hypersil BDS C18；参数为4.6mm×250mm，5μm。梯度洗脱过程中检测波长为235nm
在测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱柱，测定，记录0～65分钟的色谱图，得到附子药材的指纹图谱。
其中，如图1所示，按照本申请提供的方法，确定了附子药材的对照图谱，包括11个共有峰，其中3(S)为苯甲酰新乌头原碱对照峰。这些共有特征峰共同构成了附子药材的指纹特征，形成附子药材的对照指纹图谱。
其中，总共有11个特征峰，其中在图1中，3个特征峰如下：峰2(S)峰为苯甲酰新乌头原碱、峰3为苯甲酰乌头原碱、峰4为苯甲酰次乌头原碱。指纹图谱中，以苯甲酰新乌头原碱为参照峰，11个特征峰的相对保留时间分别为：0.648～0.761(峰1)、1.000(峰2参照峰)、1.015～1.191(峰3)、1.101～1.293(峰4)、1.157～1.359(峰5)、1.515～1.779(峰6)、1.840～2.160(峰7)、2.018～2.369(峰8)、2.217～2.603(峰9)、2.615～3.070(峰10)、2.700～3.169(峰11)；相对峰面积分别为：0.064～0.075(峰1)、1.000(峰2参照峰)、0.172～0.202(峰3)、0.354～0.415(峰4)、0.081～0.095(峰5)、0.088～0.103(峰6)、0.038～0.045(峰7)、0.246～0.288(峰8)、0.073～0.085(峰9)、0.039～0.045(峰10)、0.017～0.020(峰11)。
本申请提供的附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法可以快速精确地建立起附子指纹图谱，从而能达到对药材进行全面质量评价的目的。
第二实施例
本申请实施例提供了一种附子指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
S201、制备对照品溶液：称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液以制成对照品溶液，其中，每lml对照品溶液各含苯甲酰新乌头原碱9μg、苯甲酰乌头原碱9μg、苯甲酰次乌头原碱9μg。
在一些实施例中，该异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
S202、制备附子供试品溶液：称取附子粉末适置于容器中，在该容器中加入氨试液适量浸润，然后量取异丙醇－二氯甲烷50ml加入容器称定重量a1，超声处理28min、放冷、再称定重量a2，采用用异丙醇－二氯甲烷混合溶液补足减失的重量a1－a2；然后，摇匀、滤过得到滤液；精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干得残渣，然后将残渣加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液溶解并定容至2ml，摇匀滤过，取续滤液即得附子供试品溶液。
进一步地，在一些实施例中，附子粉末与所述氨试液的比例为0.04g/ml。该异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。该容器为具有塞子的锥形瓶。超声处理的功率为250W，频率为50KHZ，水温在25摄氏度以下。超声处理的时间为30分钟。该附子粉末的质量为2.0g。在对该滤液进行减压处理时，保持温度在40摄氏度以下。
S203、分别量取相同体积的对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱柱以测定得到附子的指纹图谱；其中，色谱条件为：以pH为5－5.5的0.15wt％的三乙胺为流动相A，以甲醇为流动相B，分别对所述对照品溶液与供试品溶液进行梯度洗脱，使得所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比从67％－73％降至7％－13％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比从27％－33％升至87％－93％；梯度洗脱过程中检测波长为230nm，柱温28℃，流速0.8ml/min。
进一步地，在一些实施例中，其中，流动相A的pH值为5.3，具体调试流动相A的pH值时，可以采用冰醋酸来进行调节。而由于流动相A的pH发生微小变化时对特征峰的保留时间影响在可接受范围内，但是峰面积受到流动相A的pH影响较大，故采用pH值为5三乙胺作为流动相A。三乙胺的重量含量百分数0.20wt％。梯度洗脱过程中检测波长为235nm，柱温30℃，流速1ml/min。柱温在发生变化时，会对特征色谱峰的保留时间产生影响，将柱温设置为30℃可以保证保留足够时间。
其中，在进行梯度洗脱过程中：
具体地，在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由70％降至45％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由30％升至55％；在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由45％降至27％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由55％升至73％；在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由27％降至10％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由73％升至90％。通过在洗脱过程中控制流动相A的体积占流动相总量的比例，最终可以使得得到的指纹图谱重现性好，各个特征峰清晰度高。
在测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱柱，测定，记录0～65分钟的色谱图，得到附子药材的指纹图谱。
其中，如图1所示，按照本申请提供的方法，确定了附子药材的对照图谱，包括11个共有峰，其中峰2(S)为苯甲酰新乌头原碱对照峰。这些共有特征峰共同构成了附子药材的指纹特征，形成附子药材的对照指纹图谱。
第三实施例
本申请实施例提供了一种附子指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
S301、制备对照品溶液：称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液以制成对照品溶液，其中，每lml对照品溶液各含苯甲酰新乌头原碱11μg、苯甲酰乌头原碱11μg、苯甲酰次乌头原碱11μg。
进一步地，在一些实施例中，该异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
S302、称取附子粉末适置于容器中，在该容器中加入氨试液适量浸润，然后量取异丙醇－二氯甲烷50ml加入容器称定重量a1，超声处理35min、放冷、再称定重量a2，采用用异丙醇－二氯甲烷混合溶液补足减失的重量a1－a2；然后，摇匀、滤过得到滤液；精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干得残渣，然后将残渣加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液溶解并定容至2ml，摇匀滤过，取续滤液即得附子供试品溶液。
进一步地，在一些实施例中，附子粉末与所述氨试液的比例为0.04g/ml。该异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。该容器为具有塞子的锥形瓶。超声处理的功率为250W，频率为50KHZ，水温在25摄氏度以下。超声处理的时间为30分钟。该附子粉末的质量为2.0g。在对该滤液进行减压处理时，保持温度在40摄氏度以下。
S303、分别量取相同体积的对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱柱以测定得到附子的指纹图谱；其中，色谱条件为：以pH为5.5的0.25wt％的三乙胺为流动相A，以甲醇为流动相B，分别对所述对照品溶液与供试品溶液进行梯度洗脱，使得所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比有73％降至13％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比从27％升至87％；梯度洗脱过程中检测波长为240nm，柱温32℃，流速1.2ml/min。
在测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱柱，测定，记录0～65分钟的色谱图，得到附子药材的指纹图谱。
其中，如图1所示，按照本申请提供的方法，确定了附子药材的对照图谱，包括11个共有峰，其中峰2(S)为苯甲酰新乌头原碱对照峰。这些共有特征峰共同构成了附子药材的指纹特征，形成附子药材的对照指纹图谱。
本申请还提供了一种参附注射液附子成分指纹图谱建立方法。该方法包括：
供试品溶液的制备：取参附注射液20ml，加于固相萃取小柱，萃取小柱条件为：Polyclean－X－HLB，先以甲醇15ml活化，再以15ml水平衡。以水5ml冲洗，再以甲醇2ml洗脱，收集甲醇液，摇匀，作为供试品溶液。
参照物溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品，精密称定，加体积比为1：1的异丙醇－二氯甲烷混合溶液制成每l ml含10μg的溶液，即得。
色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18。参数：4.6mm×250mm，5μm。以0.2wt％的三乙胺(采用冰醋酸调pH5.3)为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。其中，在0～30min：流动相A的体积占流动相总体积的百分比由70％下降为45％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比由30％上升为55％；30～54min：流动相A的体积占流动相总体积的百分比由45％下降为27％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比由55％上升为73％；54～65min：流动相A的体积占流动相总体积的百分比由27％下降10％，流动相B的体积占流动相总体积的百分比由73％上升为90％；检测波长为235nm；柱温30℃；流速1ml/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于20000。分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱柱，测定，记录0～65分钟的色谱峰，即得参附注射液附子成分的指纹图谱。
请参照图2，其为采用上述方法测定的参附注射液附子成分指纹图谱；确定了参附注射液附子成分对照指纹图谱，包括7个共有峰，其中3(S)为苯甲酰新乌头原碱对照峰。这些共有特征峰共同构成了参附注射液附子成分的指纹特征，为参附注射液附子成分的对照指纹图谱。
图2的指纹图谱中，以苯甲酰新乌头原碱为参照峰，7个特征峰的相对保留时间分别为：0.848～0.995(峰1)、1.000(峰2参照峰)、1.013～1.189(峰3)、1.101～1.292(峰4)、1.203～1.413(峰5)、1.610～1.889(峰6)、2.704～3.174(峰7)；相对峰面积分别为：0.478～0.562(峰1)、1.000(峰2参照峰)、0.155～0.182(峰3)、0.509～0.598(峰4)、0.192～0.225(峰5)、0.417～0.490(峰6)、1.737～2.039(峰7)。
其中，图1中的附子指纹图谱中的特征峰：峰2、峰3、峰4、峰11与参附注射液指纹图谱中的中特征峰：峰2、峰3、峰4、峰7分别依次相对应。
然后，将本实施例中的参附注射液附子成分指纹图谱与上述实施例中得到的附子指纹图谱进行对比，从而可以评价从附子药材到参附注射液制剂过程中特征成分的变化情况。可以全面评价参附注射液从药材到制剂的量质传递情况。
在本申请所提供的实施例中，应该理解到，所揭露装置和方法，可以通过其它的方式实现。以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，又例如，多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些通信接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。

Claims (10)

1.一种附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备对照品溶液：称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液以制成对照品溶液，其中，每lml对照品溶液各含苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱质量相等；
制备附子供试品溶液：称取附子粉末适置于容器中，在该容器中加入氨试液适量浸润，然后量取异丙醇－二氯甲烷适量加入容器称定重量a1，超声处理、放冷、再称定重量a2，采用异丙醇－二氯甲烷混合溶液补足减失的重量a1－a2；然后，摇匀、滤过得到滤液；精密量取续滤液适量，减压回收溶剂至干得残渣，然后将残渣加入异丙醇－二氯甲烷混合溶液适量溶解并定容，摇匀滤过，取续滤液即得附子供试品溶液；
分别量取相同体积的对照品溶液与供试品溶液适量，注入液相色谱柱以测定得到附子的指纹图谱；其中，色谱条件为：三乙胺为流动相A，以甲醇为流动相B，分别对所述对照品溶液与供试品溶液进行梯度洗脱，使得所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比降低，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比升高。
2.根据权利要求1所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述三乙胺的pH为5－5.5，所述三乙胺的重量含量百分数0.15wt％－0.25wt％。
3.根据权利要求2所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述三乙胺的重量含量百分数为0.20wt％；所述流动相A的pH值为5.3。
4.根据权利要求1所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述异丙醇－二氯甲烷混合溶液中异丙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
5.根据权利要求1所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述附子粉末与所述氨试液的比例为0.04g/ml，所述氨试液的体积为50ml。
6.根据权利要求1所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，在所述梯度洗脱过程中：
在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由67％－73％降至42％－48％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由27％－33％升至52％－58％；
在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由42％－48％降至24％－30％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由52％－58％升至70％－76％；
在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由24％－30％降至7％－13％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由70％－76％升至87％－93％。
7.根据权利要求6所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，在所述梯度洗脱过程中：
在第0min－第30min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由70％降至45％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由30％升至55％；
在第30min－第54min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由45％降至27％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由55％升至73％；
在第54min－第65min的过程中，所述流动相A的体积占流动相总体积的百分比由27％降至10％，所述流动相B的体积占流动相总体积的百分比由73％升至90％。
8.根据权利要求1所述的附子指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱柱的型号为Thermo Hypersil BDS C18；参数为4.6mm×250mm，5μm。
9.一种附子指纹图谱，其特征在于，所述附子指纹图谱由权利要求1－8任一项所述的附子指纹图谱的建立方法构建而成。
10.一种附子质量检测方法，其特征在于，包括：将权利要求9所述的附子指纹图谱与待检测的参附注射液的指纹图谱进行比较。
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