CN112649533B - 一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒uplc-ms特征图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC‑MS特征图谱及其构建方法和应用。本发明提供的构建方法，以对照品、对照药材作为对照，以甲酸水溶液‑乙腈为流动相进行梯度洗脱，通过对色谱条件和质谱条件进行合理化控制，从而形成黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC‑MS特征图谱的全貌，使黑顺片的质量控制得到提升，可对黑顺片从饮片经标准汤剂再到配方颗粒成品的工艺过程中的内在品质进行把控，有利于整体评价黑顺片相关工艺过程的科学性、合理性，确保黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定性，从而保证黑顺片的临床疗效。

Description

一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱及其 构建方法和应用
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱，该特征图谱的构建方法，以及利用该特征图谱进行样品检测的应用。
背景技术
附子是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)的子根的加工品，根据加工方法的不同，可分为盐附子、黑顺片、白附子等，其中黑顺片为纵切片，上宽下窄，外皮黑褐色，切面暗黄色，性大热，味辛、甘，有毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效。
研究表明，附子中的主要成分是生物碱，《中国药典》(2015年版)一部中以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱作为含量测定指标，但未对其进行特征图谱控制。有文献报道称，王晓雅等人基于指纹图谱和化学计量学对3个主产区(四川江油、四川布拖和云南)的35批黑顺片进行质量评价，结果表明来自不同产地的35批黑顺片样品指纹图谱的相似度均大于0.900(王晓雅,熊亮,蒙春旺,彭成等,基于指纹图谱盒化学计量法评价不同产地黑顺片的质量[J],中药新药与临床药理,2020,3:353-358)；孙凯等人研究了不同产地的黑顺片中的HPLC指纹图谱，并建立了测定黑顺片中次乌头碱、乌头碱、新乌头碱的HPLC分析方法(孙凯,李佳,张永清,黑顺片指纹图谱及有效成分含量测定[J],江西中医药,2012,43(10):58-61)；黄慧莲等人研究了四川江油、陕西汉中及云南丽江等附子主产区的黑顺片的高效液相色谱指纹图谱(黄慧莲,刘科兰,邵峰等,不同主产地黑顺片的指纹图谱研究[J],中国实验方剂学杂志,2011,17(16):44-49)；王超越等人建立了黑顺片中6种酯型生物碱含量的高效液相测定方法(王超群,翟宏焱,王晓华,RP-HPLC法测定黑顺片中6种酯型生物碱的含量[J],化学分析计量,2015,2:62-65)。
然而，上述报道仅针对黑顺片饮片进行了HPLC指纹图谱研究，或者采用RP-HPLC法建立了控制指标，还未见对黑顺片标准汤剂、配方颗粒特征图谱研究的报道，现有的检测方法难以有效对比和分析黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的差异与变化，难以深入认识黑顺片药效物质基础在从原料到配方颗粒成品的工艺过程中的传递情况，难以整体评价和控制从黑顺片饮片到配方颗粒成品的工艺过程。
因此，构建统一的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱，并利用该特征图谱进行测定，有利于整体评价黑顺片相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒的内在质量，确保黑顺片的临床疗效。
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供了一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，通过该方法构建的特征图谱能整体控制黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分。
用于解决问题的方案
第一方面，本发明提供一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)制备黑顺片的饮片供试品溶液、标准汤剂供试品溶液和配方颗粒供试品溶液以及对照药材溶液和对照品溶液；
2)将所述对照品溶液、所述对照药材溶液、所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，得到各自的UPLC-MS图谱；
3)基于所述对照品溶液的UPLC-MS图谱，确定所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的特征峰，并以所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱作为对照，分别按照要求选出所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液各自UPLC-MS图谱中的对应峰，构建黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱。
优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤1)中，
所述对照品包括新乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱、宋果灵、附子灵和尼奥林。
优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤1)中，
制备所述对照品溶液的步骤包括：将对照品用异丙醇-二氯甲烷混合溶剂溶解，再用甲醇水溶液稀释；
制备所述对照药材溶液的步骤包括：将黑顺片对照药材用水提取；
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤包括：分别将黑顺片饮片、标准汤剂和配方颗粒采用甲醇或甲醇水溶液提取。
进一步优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤1)中，
制备所述对照品溶液的步骤包括：将对照品用等体积混合的异丙醇-二氯甲烷混合溶剂溶解，再用50％甲醇水溶液稀释，制得所述对照品溶液；其中，所述对照品溶液中对照品的质量浓度为50ng/mL～120ng/mL，优选质量浓度为80ng/mL～100ng/mL；
制备所述对照药材溶液的步骤中，所述提取选自超声提取和回流提取；为促进对照药材中单酯型生物碱的提取，优选回流提取；
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤包括：取黑顺片饮片、标准汤剂粉末和配方颗粒粉末，分别加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，提取，并补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即分别制得所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液；其中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30％～75％，优选30％～50％，更优选分别采用30％、50％和50％甲醇水溶液提取黑顺片饮片、标准汤剂粉末和配方颗粒粉末；所述提取选自超声提取、振摇提取和回流提取，优选超声提取；所述提取的时间为15分钟～45分钟，优选30分钟。
优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤2)中，
所述超高效液相色谱-质谱分析的色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)色谱柱；流动相：二元流动相体系，其中：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱；
所述超高效液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测模式：正离子模式。
进一步优选地，所述色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18色谱柱，100×2.1mm，1.7μm。
进一步优选地，所述梯度洗脱的程序如下：0～11min，95％→75％流动相A；11～15min，75％→50％流动相A；15～16min，50％→5％流动相A；16～17min，5％流动相A。
进一步优选地，所述色谱条件还包括：流速：0.3mL/min～0.5mL/min，优选0.4mL/min；进样量：1μL；柱温：25℃～45℃，优选35℃。
进一步优选地，所述质谱条件还包括：干燥气温度：300℃；干燥气流量：8L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：4000V；毛细管出口电压：175V；锥孔电压：65V；碎裂电压：120V。
优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤3)中，
所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中包含至少10个特征峰。
更优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤3)中，选出所述对应峰的要求如下：
所述饮片供试品溶液的UPLC-MS图谱中包含与所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的至少10个特征峰的保留时间和质核比分别对应的色谱峰，并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定；
所述标准汤剂供试品溶液的UPLC-MS图谱中包含与所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的至少9个特征峰的保留时间和质核比分别对应的色谱峰，并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定；
所述配方颗粒供试品溶液的UPLC-MS图谱中包含与所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的至少9个特征峰的保留时间和质核比分别对应的色谱峰，并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定。
进一步优选地，该黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，步骤3)中，所述关于相对保留时间的规定如下：
在所述供试品溶液的UPLC-MS图谱中，以有对照品参比且峰面积最大的色谱峰作为S峰，无对照品参比的各色谱峰相对于S峰的相对保留时间在规定值(例如0.49和1.24)的±15％之内，所述规定值基于所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中各特征峰的相对保留时间确定。
第二方面，本发明还提供一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱，其基于上述构建方法构建。
第三方面，本发明还提供上述黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱在评价黑顺片从饮片到标准汤剂和/或从标准汤剂到配方颗粒的生产工艺中的应用。
第四方面，本发明还提供一种黑顺片饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品的检测方法，包括以下步骤：
1)制备黑顺片的饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液；
2)将所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，得到各自相应的UPLC-MS图谱；
3)将所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液的UPLC-MS图谱与上述黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱进行对应比较，以评价所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品品质，并比较所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液的UPLC-MS图谱之间的差异，以评价所述标准汤剂和/或配方颗粒的生产工艺稳定性。
发明的效果
本发明提供的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，以对照品(如苯甲酰新乌头原碱)及对照药材作为对照，以甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，通过对色谱条件和质谱条件进行合理化控制，从而形成黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的全貌，使黑顺片的质量控制得到提升，从原来只能通过指纹图谱对黑顺片饮片进行检测，上升到可针对黑顺片在从饮片经标准汤剂再到配方颗粒成品的工艺过程中的内在品质进行把控，有利于整体评价黑顺片相关工艺过程的科学性、合理性，确保黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定性，从而保证黑顺片的临床疗效。
本发明采用黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱对待测样品进行检测，为黑顺片从原料到成品的内在质量控制提供新的分析手段，方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，保持了黑顺片饮片、标准汤剂与配方颗粒质量的一致性，为确保符合配方颗粒要求的标准汤剂以及确保符合标准汤剂要求的黑顺片饮片原料的生产过程提供重要的多指标参数依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为新乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品的UPLC-MS图谱的叠加图；
图2为宋果灵对照品、附子灵对照品、尼奥林对照品的UPLC-MS图谱的叠加图；
图3为次乌头碱对照品的UPLC-MS图谱；
图4为黑顺片对照药材的UPLC-MS图谱；
图5为16批黑顺片饮片供试品的UPLC-MS图谱叠加图；
图6为黑顺片饮片的UPLC-MS特征图谱；
图7为16批黑顺片标准汤剂供试品的UPLC-MS图谱叠加图；
图8为黑顺片标准汤剂的UPLC-MS特征图谱；
图9为3批黑顺片配方颗粒供试品的UPLC-MS图谱叠加图；
图10为黑顺片配方颗粒的UPLC-MS特征图谱；
图11为黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒的UPLC-MS特征图谱的叠加图；
图12为黑顺片饮片供试品提取溶剂的考察；
图13为黑顺片饮片供试品提取方式的考察；
图14为黑顺片饮片供试品提取时间的考察；
图15为黑顺片饮片供试品色谱-质谱分析流动相的考察；
图16为黑顺片饮片供试品色谱-质谱分析碎裂电压参数的考察；
图17为黑顺片饮片供试品色谱-质谱分析不同色谱柱的分离效果对比；
图18为黑顺片饮片供试品色谱-质谱分析不同柱温对分离效果的影响；
图19为黑顺片饮片供试品色谱-质谱分析不同流速对分离效果的影响；
图20为黑顺片标准汤剂供试品、配方颗粒供试品提取溶剂的考察；
图21为黑顺片标准汤剂供试品、配方颗粒供试品提取方式的考察；
图22为黑顺片标准汤剂供试品、配方颗粒供试品提取时间的考察；
图23为黑顺片标准汤剂供试品、配方颗粒供试品色谱-质谱分析流动相的考察；
图24为黑顺片标准汤剂供试品、配方颗粒供试品色谱-质谱分析碎裂电压参数的考察；
图25为黑顺片标准汤剂供试品色谱-质谱分析不同色谱柱的分离效果对比；
图26为黑顺片标准汤剂供试品色谱-质谱分析不同柱温对分离效果的影响；
图27为黑顺片标准汤剂供试品色谱-质谱分析不同流速对分离效果的影响；
图28为黑顺片配方颗粒供试品色谱-质谱分析不同色谱柱的分离效果对比；
图29为黑顺片配方颗粒供试品色谱-质谱分析不同柱温对分离效果的影响；
图30为黑顺片配方颗粒供试品色谱-质谱分析不同流速对分离效果的影响。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，附图中给出了本发明的较佳实施例，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施，并不限于本文所描述的实施例。
若未特别指明，实施例中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；若未特别指明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本说明书中，有关溶液“A％”均表示体积分数为A％，如“50％甲醇水溶液”表示甲醇“体积分数”为50％的水溶液。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
实验仪器、试剂及药品
1.仪器
Agilent 1290超高效液相色谱仪，Agilent G6530 Accurate-Mass Q-TOF质谱联用仪，Agilent Mass Hunter Workstation数据采集及定性分析软件(Agilent公司)；
电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
KQ-250B超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；
HY-4调速多用振荡仪(金坛市科兴仪器厂)；
控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；
纯水系统(Sartorius公司)；
AS165W型离心机(亚速旺(上海)商贸有限公司)。
2.试剂
乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；
超纯水(自制)；
甲酸(LC-MS级，Thermo Fisher公司)；
3.药品
新乌头原碱(批号：MUST-19052604，纯度99.08％)，购于成都曼斯特生物科技有限公司，供含量测定用，使用前无须处理；苯甲酰新乌头原碱(批号：111795-201604，纯度94.0％)，苯甲酰乌头原碱(批号：111794-201705，纯度99.1％)，苯甲酰次乌头原碱(批号：111796-201705，纯度98.6％)，次乌头碱(批号：110798-201609，纯度99.2％)，均购于中国食品药品检定研究所；宋果灵(批号：ST14110105，纯度98.0％)，附子灵(批号：ST14170105，纯度98.0％)，尼奥林(批号：ST14210105，纯度98.0％)，均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；黑顺片对照药材(批号：280107-202007)，购于上海鸿永生物科技有限公司。
实施例1：黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建。
1.制备溶液
1.1对照药材溶液的制备
取黑顺片对照药材约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加水20mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。
1.2对照品溶液的制备
分别取新乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、次乌头碱对照品适量，精密称定，分别加异丙醇-二氯甲烷(体积比为1:1)混合溶剂，制成10μg/mL的贮备液；再精密吸取该贮备液适量，加入50％甲醇水溶液稀释至100ng/mL，即得。
再分别取宋果灵对照品、附子灵对照品、尼奥林对照品适量，精密称定，分别加入异丙醇-二氯甲烷(体积比为1:1)混合溶剂，制成8μg/mL的贮备液；再精密吸取该贮备液适量，加入50％甲醇水溶液稀释至80ng/mL，即得。
1.3供试品溶液的制备
1.3.1饮片供试品溶液的制备
取黑顺片的饮片约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇水溶液10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得饮片供试品溶液。
1.3.2标准汤剂供试品溶液的制备
取黑顺片的标准汤剂粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得标准汤剂供试品溶液。
1.3.3配方颗粒供试品溶液的制备
取黑顺片的配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得配方颗粒供试品溶液。
2.超高效液相色谱-质谱分析
分别吸取第1项中制备的对照品溶液、对照药材溶液、饮片供试品溶液、标准汤剂供试品溶液、配方颗粒供试品溶液各1μL，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，得到各自相应的UPLC-MS图谱。其中，新乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品的UPLC-MS图谱的叠加图如图1所示，宋果灵对照品、附子灵对照品、尼奥林对照品的UPLC-MS图谱的叠加图如图2所示，次乌头碱对照品的UPLC-MS图谱如图3所示，对照药材的UPLC-MS图谱如图4所示。
具体地，超高效液相色谱-质谱联用仪的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(例如采用反相色谱柱，如Waters ACQUITYBEH C18色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)，以0.1％甲酸水溶液(体积分数，下同)为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4mL；柱温为35℃；进样量为1μL。
Figure BDA0002872396150000061
超高效液相色谱-质谱联用仪的质谱条件如下：
采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，信噪比(S/N)按照苯甲酰新乌头原碱计算应不低于3，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。
上述质谱条件还包括：干燥气温度为300℃，干燥气流量为8L/min，雾化器压力为35psi；毛细管电压为4000V，毛细管出口电压为175V，锥孔电压为65V，碎裂电压为120V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围为m/z100～2000，采样速度为1spectra/s，采样时间为1000ms/spectra；正离子采用嘌呤(121.050873)和HP-0921(922.009798)进行质量数实时校准，雾化压力为5psi。
3.特征图谱的构建
将第2项中得到的对照品溶液的UPLC-MS图谱(图1-3)、对照药材溶液的UPLC-MS图谱(图4)作为对照，分别从饮片供试品溶液、标准汤剂供试品溶液、配方颗粒供试品溶液各自的UPLC-MS图谱中选出对应峰，构建黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱。
3.1黑顺片饮片特征图谱的构建
采用最终确定的分析方法，对16批黑顺片饮片供试品溶液进行UPLC-MS分析，记录各自图谱中各色谱峰的保留时间和峰面积，如图5所示。
表1黑顺饮片供试品的相关信息
Figure BDA0002872396150000062
根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出且峰面积相对较高的原则，从各批次黑顺片饮片供试品溶液的UPLC-MS图谱中选择10个重复性较好的峰作为特征峰，其与对照药材UPLC-MS图谱中10个特征峰(基于对照品UPLC-MS图谱确定)的保留时间和质荷比(m/z)相对应，适宜选为共有峰；其中，峰1、峰2、峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰10分别与新乌头原碱对照品、宋果灵对照品、附子灵对照品、尼奥林对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱对照品的保留时间相对应。
以与苯甲酰新乌头原碱对照品相对应的共有峰(峰6)为S峰，计算无对照品参比的两个共有峰(峰5和峰9)与S峰的相对保留时间，其结果应在规定值的±15％之内，规定值为0.49(峰5)、1.24(峰9)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批黑顺片饮片供试品溶液的UPLC-MS图谱进行合成，建立了黑顺片饮片的UPLC-MS特征图谱，如图6所示，其中：峰1：新乌头原碱(m/z 486)；峰2：宋果灵(m/z 358)；峰3：附子灵(m/z 454)；峰4：尼奥林(m/z438)；峰6：苯甲酰新乌头原碱(m/z 590)；峰7：苯甲酰乌头原碱(m/z 604)；峰8：苯甲酰次乌头原碱(m/z 574)；峰10：次乌头碱(m/z 616)，其可以在后续的未知待测样品检测时作为对照图谱，能够较为准确地整体控制黑顺片饮片的质量。
3.2黑顺片标准汤剂特征图谱的构建
采用最终确定的分析方法，对16批黑顺片标准汤剂供试品溶液进行UPLC-MS分析，记录各自图谱中各色谱峰的保留时间和峰面积，如图7所示。
本步骤中标准汤剂供试品是由前述16批黑顺片饮片制成。
根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出且峰面积相对较高的原则，从各批次黑顺片标准汤剂供试品溶液的UPLC-MS图谱中选择9个重复性较好的峰作为特征峰，其与对照药材UPLC-MS图谱中9个特征峰(基于对照品UPLC-MS图谱确定)的保留时间和质荷比(m/z)相对应，适宜选为共有峰；其中，峰1、峰2、峰3、峰4、峰6、峰7、峰8分别与新乌头原碱对照品、宋果灵对照品、附子灵对照品、尼奥林对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品的保留时间相对应。
以与苯甲酰新乌头原碱对照品相对应的共有峰(峰6)为S峰，计算无对照品参比的两个共有峰(峰5和峰9)与S峰的相对保留时间，其结果应在规定值的±15％之内，规定值为：0.49(峰5)、1.24(峰9)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对16批黑顺片标准汤剂供试品溶液的UPLC-MS图谱进行合成，建立了黑顺片标准汤剂的UPLC-MS特征图谱，如图8所示)其中：峰1：新乌头原碱(m/z 486)；峰2：宋果灵(m/z 358)；峰3：附子灵(m/z 454)；峰4：尼奥林(m/z 438)；峰6：苯甲酰新乌头原碱(m/z 590)；峰7：苯甲酰乌头原碱(m/z 604)；峰8：苯甲酰次乌头原碱(m/z574)，其可以在后续的未知待测样品检测时作为对照图谱，能够较为准确地整体控制黑顺片标准汤剂的质量。
3.3黑顺片配方颗粒特征图谱的构建
采用最终确定的分析方法，对3批黑顺片配方颗粒供试品溶液(江阴天江药业有限公司，批号：20030199、20030209、20030219)进行UPLC-MS分析，记录各自图谱中各色谱峰的保留时间和峰面积，如图9所示。
根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出且峰面积相对较高的原则，从各批次黑顺片配方颗粒供试品溶液的UPLC-MS图谱中选择9个重复性较好的峰作为特征峰，其与对照药材UPLC-MS图谱中9个特征峰(基于对照品UPLC-MS图谱确定)的保留时间和质荷比(m/z)相对应，适宜选为共有峰；其中，峰1、峰2、峰3、峰4、峰6、峰7、峰8分别与新乌头原碱对照品、宋果灵对照品、附子灵对照品、尼奥林对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品的保留时间相对应。
以与苯甲酰新乌头原碱对照品相对应的共有峰(峰6)为S峰，计算无对照品参比的两个共有峰(峰5和峰9)与S峰的相对保留时间，其结果应在规定值的±15％之内，规定值为：0.49(峰5)、1.24(峰9)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批黑顺片配方颗粒供试品溶液的UPLC-MS图谱进行合成，建立了黑顺片配方颗粒的UPLC-MS特征图谱，如图10所示，其中：峰1：新乌头原碱(m/z 486)；峰2：宋果灵(m/z 358)；峰3:附子灵(m/z 454)；峰4：尼奥林(m/z 438)；峰6：苯甲酰新乌头原碱(m/z 590)；峰7：苯甲酰乌头原碱(m/z 604)；峰8：苯甲酰次乌头原碱(m/z 574)，其可以在后续的未知待测样品检测时作为对照图谱，能够较为准确地整体控制黑顺片配方颗粒的质量。
将图6、图8、图10进行叠加，即得到图11，其中：峰1：新乌头原碱(m/z 486)；峰2：宋果灵(m/z 358)；峰3:附子灵(m/z 454)；峰4：尼奥林(m/z 438)；峰6：苯甲酰新乌头原碱(m/z 590)；峰7：苯甲酰乌头原碱(m/z 604)；峰8：苯甲酰次乌头原碱(m/z 574)；峰10：次乌头碱(m/z 616)。图11可为确保符合配方黑顺片颗粒要求的黑顺片标准汤剂以及确保符合黑顺片标准汤剂要求的黑顺片饮片(即从原料到配方颗粒产品的生产过程)提供重要的多指标参数依据。
方法学考察
1.黑顺片饮片
1.1饮片供试品溶液的制备考察
1.1.1提取溶剂考察
取黑顺片饮片(批号：YP1802058)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、75％甲醇水溶液、甲醇各10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用对应体积分数的甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对比采用上述四种溶剂对黑顺片饮片提取后的BPC图谱，如图12所示，其结果表明，四种不同浓度的溶剂对黑顺片饮片提取，其色谱峰峰形均较好，但综合考虑提取效率和有机溶剂使用量，选择30％甲醇水溶液作为提取溶剂。
1.1.2提取方式考察
取黑顺片饮片(批号：YP1802058)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇水溶液10mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)、振摇提取、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
结果表明，如图13所示，采用三种不同提取处理方式所得的色谱峰数目和峰响应值相差不大，超声处理的提取效率优于振摇提取和加热回流，最终选择超声处理作为供试品溶液提取方式。
1.1.3提取时间考察
取黑顺片饮片(批号：YP1802058)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇水溶液10mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
结果表明，如图14所示，采用三种提取时间所得的色谱峰数目和峰响应值相差不大，超声提取30分钟提取效率优于15分钟和45分钟，最终选择超声处理30分钟。
综上所述，黑顺片饮片供试品溶液的制备方法为：取黑顺片饮片约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2质谱条件和色谱条件的确定
1.2.1流动相选择
取黑顺片饮片(批号：YP1802058)供试品溶液，先后比较了0.1％甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇、0.1％甲酸水溶液-甲醇、水-乙腈不同流动相进行考察。
结果表明，如图15所示，采用水-甲醇和水-乙腈作为洗脱溶剂，峰形较差且响应较加甲酸的低，0.1％甲酸水溶液-乙腈的峰形和各主要峰分离情况优于0.1％甲酸水溶液-甲醇，故所选流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈。
1.2.2碎裂电压参数考察
取黑顺片饮片(批号：YP1802058)供试品溶液，分别在100V、120V、130V下进样1μL进行分析，记录其BPC图，如图16所示。
结果表明，100V、120V、130V下峰相应强度和峰总数较为相似，但从节约电能角度考虑更宜选用较低的碎裂电压，如100V、120V；但考虑到后续黑顺片标准汤剂方法学考察时，120V的峰总数要优于100V，因此综合考虑选用120V。
1.3精密度考察
取同一批号黑顺片饮片供试品(批号：YP1802058)，按“1.3.1饮片供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，进样6次，每次1μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表2精密度实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000091
表3精密度实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000092
由表2和表3得知，各特征峰相对保留时间及相对峰面积值RSD均小于4％，仪器精密度良好。
1.4稳定性考察
取同一批号黑顺片饮片供试品(批号：YP1802058)，按“1.3.1饮片供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，每隔2小时进样一次，共测定12小时，分别进样1μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表4稳定性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000101
表5稳定性实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000102
由表4和表5得知，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于4％，供试液在12小时内稳定性良好。
1.5重复性考察
取同一批号黑顺片饮片供试品(批号：YP1802058)共6份，按“1.3.1饮片供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，进样1μL分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表6重复性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000103
表7重复性实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000111
由表6和表7得知，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积值的RSD均小于3％，该方法的重复性良好。
1.6耐用性考察
1.6.1不同色谱柱考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱Acquity CSH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)、Acquity CORTECS C18(Waters，2.1×100mm，1.6μm)、Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)进行了考察。
其结果如图17所示，1、2和3分别代表Acquity CSH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)、Acquity CORTECS C18(Waters，2.1×100mm，1.6μm)和Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)，这说明，使用Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)主要色谱峰的响应和分离优于前两者，因此选择Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)进行研究。
1.6.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别考察了柱温为25℃、35℃和45℃时的供试品分离效果，如图18所示。
结果表明，柱温为25℃～45℃时供试品的主要色谱峰响应和分离效果均较好，柱温的微小变动不影响特征图谱的测定，优选35℃。
1.6.3流速考察
分别考察了流速为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min时的供试品分离效果，如图19所示。
结果表明，不同流速时供试品主要色谱峰响应和分离效果均较好，流速的微小变动不影响供试品特征图谱的测定。考虑到分析时间及色谱系统压力，选择流速为0.4mL/min。
2.标准汤剂
2.1标准汤剂供试品溶液的制备考察
2.1.1提取溶剂考察
取黑顺片标准汤剂粉末(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)约0.1g，精密称定，精密加入30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、75％甲醇水溶液、甲醇各25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用对应体积分数的甲醇或甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对比采用上述四种溶剂对黑顺片标准汤剂提取后的BPC图，如图20所示，四种不同浓度的溶剂对黑顺片标准汤剂提取，其色谱峰峰形均较好，但综合考虑提取效率和有机溶剂使用量，选择50％甲醇水溶液作为提取溶剂。
2.1.2提取方式考察
取黑顺片标准汤剂粉末(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)约0.1g，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液25mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)、振摇提取、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图21所示，采用三种不同提取处理方式所得的色谱峰数目和峰响应值相差不大，超声处理的提取效率优于振摇提取和加热回流，最终选择超声处理作为供试液提取方式。
2.1.3提取时间考察
取黑顺片标准汤剂粉末(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)约0.1g，精密称定，加入50％甲醇水溶液25mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
其结果如图22所示，超声提取30分钟提取效率优于15分钟和45分钟，最终选择超声处理30分钟。
综上所述，黑顺片标准汤剂供试品溶液的制备方法为：取黑顺片标准汤剂约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2质谱条件和色谱条件的确定
2.2.1流动相选择
取黑顺片标准汤剂供试品溶液(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)，先后比较了0.1％甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇、0.1％甲酸水溶液-甲醇、水-乙腈不同流动相进行考察。
结果表明，如图23所示，采用水-甲醇和水-乙腈作为洗脱溶剂，峰形较差且响应较加甲酸的低，0.1％甲酸水溶液-乙腈的峰形和各主要峰分离情况优于0.1％甲酸水溶液-甲醇，故所选流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈。
2.2.2碎裂电压参数考察
取黑顺片标准汤剂供试品溶液(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)，分别在100V、120V、130V下进样1μL进行分析，记录其BPC图，如图24所示。
结果表明，120V下峰响应强度和峰总数优于100V，峰总数优于130V且比130V节约电能，因此选用120V作为优选碎裂电压。
2.3精密度考察
取同一批号标准汤剂供试品(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)按“1.3.2标准汤剂供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，进样6次，每次1μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表8精密度实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000121
表9精密度实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000131
由表8和表9得知，各特征峰相对保留时间及相对峰面积值RSD均小于2％，仪器精密度良好。
2.4稳定性考察
取同一批号标准汤剂供试品(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)按“1.3.2标准汤剂供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，每隔2小时进样一次，共测定12小时，分别进样1μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表10稳定性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000132
表11稳定性实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000133
由表10和表11得知，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3％，供试品溶液在12小时内稳定性良好。
2.5重复性考察
取同一批号标准汤剂供试品(批号：DG1802057，由黑顺片饮片YP1802057制得)共6份，按“1.3.2标准汤剂供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，进样1μL分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表12重复性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000141
表13重复性实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000142
由表12和表13得知，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积值的RSD均小于3％，该方法的重复性良好。
2.6耐用性考察
2.6.1不同色谱柱考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱Acquity CSH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)、Acquity CORTECS C18(Waters，2.1×100mm，1.6μm)、Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)进行了考察。
其结果如图25所示，其中，1、2和3分别代表Acquity CSH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)、Acquity CORTECS C18(Waters，2.1×100mm，1.6μm)、Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)，这说明，使用Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)主要色谱峰的响应和分离优于前两者，因此选择Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)进行研究。
2.6.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别考察了柱温为25℃、35℃和45℃时的供试品分离效果。
结果如图26所示，柱温为25℃～45℃时供试品的主要色谱峰响应和分离效果均较好，柱温的微小变动不影响特征图谱的测定，优选35℃。
2.6.3流速考察
分别考察了流速为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min时的供试品分离效果，如图27所示。
结果表明，不同流速时供试品主要色谱峰响应和分离效果均较好，流速的微小变动不影响供试品特征图谱的测定。考虑到分析时间及色谱系统压力，选择流速为0.4mL/min。
3.配方颗粒
3.1配方颗粒供试品溶液的制备考察
3.1.1提取溶剂考察
取黑顺片配方颗粒(批号：20030199)适量，研细，取约0.1g，精密称定，精密加入30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、75％甲醇水溶液、甲醇各25mL，密塞，称定重量，超声处理30(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)分钟，放冷，再称定重量，用对应体积分数的甲醇或甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
采用四种溶剂对黑顺片配方颗粒提取后的BPC图与黑顺片标准汤剂BPC图(详见方法学考察部分“2.1.1提取溶剂考察”)相同，如图20所示，上述四种提取溶剂中色谱峰的峰形均较好，但综合考虑提取效率和有机溶剂使用量，选择50％甲醇水溶液作为提取溶剂。
3.1.2提取方式考察
取黑顺片配方颗粒(批号：20030199)适量，研细，取约0.1g，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液25mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)、振摇提取、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
采用上述三种提取方式对黑顺片配方颗粒提取效果与黑顺片标准汤剂(详见方法学考察部分“2.1.2提取方式考察”)相同，如图21所示，采用三种不同提取方式所得的色谱峰数目和峰响应值相差不大，超声处理的提取效率优于振摇提取和加热回流，最终选择超声处理作为供试溶液提取方式。
3.1.3提取时间考察
取黑顺片配方颗粒(批号：20030199)适量，研细，取约0.1g，精密称定，加入50％甲醇水溶液25mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
采用上述三种提取时间对黑顺片配方颗粒提取效果与黑顺片标准汤剂(详见方法学考察部分“2.1.3提取时间考察”)相同，如图22所示，结果表明，超声提取30分钟提取效率优于15分钟和45分钟，最终选择超声处理30分钟。
综上所述，黑顺片配方颗粒供试品溶液的制备方法为：取黑顺片配方颗粒适量，研细。取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.2质谱条件和色谱条件的确定
3.2.1流动相选择
取黑顺片配方颗粒供试品溶液(批号：20030199)，先后比较了0.1％甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇、0.1％甲酸水溶液-甲醇、水-乙腈不同流动相进行考察。
其结果同黑顺片标准汤剂(详见方法学考察部分“2.2.1流动相选择”)结果，如图23所示，采用水-甲醇和水-乙腈作为洗脱溶剂，峰形较差且响应较加甲酸的低，0.1％甲酸-乙腈的峰形和各主要峰分离情况优于0.1％甲酸水溶液-甲醇，故所选流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈。
3.2.2碎裂电压参数优化
取黑顺片配方颗粒供试品溶液(批号：20030199)，分别在100V、120V、130V下进样1μL进行分析，记录其BPC图。
其结果同黑顺片标准汤剂(详见方法学考察部分“2.2.2碎裂电压参数考察”)结果，如图24所示，120V下峰响应强度和峰总数优于100V，峰总数优于130V且比130V节约电能，因此选用120V作为优选碎裂电压。
3.3精密度考察
取黑顺片配方颗粒(批号：20030199)0.1g，按“1.3.3配方颗粒供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，连续进样6次，每次1μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表14精密度实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000161
表15精密度实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000162
由表14和表15分别得知，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1％，相对峰面积的RSD均小于2％，精密度良好。
3.4稳定性考察
取黑顺片配方颗粒(批号：20030199)0.1g，按“1.3.3配方颗粒供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，每隔2小时进样一次，共测定12小时，分别进样1μL，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表16稳定性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000163
表17稳定性实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000171
由表16和表17得知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，除峰1外其他特征峰相对峰面积的RSD均小于3％，这说明供试品溶液在12小时内稳定性良好。
3.5重复性考察
取同一批号(20030199)供试品共6份，按“1.3.3配方颗粒供试品溶液的制备”的方法制备成供试品溶液，进样1μL分析，以苯甲酰新乌头原碱所对应的7号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
表18重复性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872396150000172
表19重复性实验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872396150000173
由表18和表19得知，各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，特征峰相对峰面积的RSD均小于5％，重复性较好。
3.6耐用性考察
3.6.1不同色谱柱考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱Acquity CSH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)、Acquity CORTECS C18(Waters，2.1×100mm，1.6μm)、Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm))进行了考察。
其结果如图28所示，其中，1、2和3分别代表Acquity CSH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)、Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.6μm)和Acquity CORTECS C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)，这说明，使用Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)主要色谱峰的响应和分离优于前两者，因此选择Acquity BEH C18(Waters，2.1×100mm，1.7μm)进行研究。
3.6.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别考察了柱温为25℃、35℃和45℃时的供试品分离效果。
如图29所示，柱温为25℃～45℃时供试品的主要色谱峰响应和分离效果均较好，柱温的微小变动不影响特征图谱的测定，优选35℃。
3.6.3流速考察
分别考察了流速为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min时的供试品分离效果。
其结果如图30所示，不同流速时供试品主要色谱峰响应和分离效果均较好，流速的微小变动不影响供试品特征图谱的测定。考虑到分析时间及色谱系统压力，选择流速为0.4mL/min。
实施例2：黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒的待测样品检测。
具体方法如下：
1)制备黑顺片的饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液；
2)将步骤1)中制备的饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，得到各自的UPLC-MS图谱；
3)将步骤2)中饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液的UPLC-MS图谱与实施例1提供的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱进行对应比较，评价饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品品质，并比较饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液的UPLC-MS图谱之间的差异，以评价标准汤剂和/或配方颗粒的生产工艺稳定性。
采用实施例1提供的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱对饮片、标准汤剂、配方颗粒待测样品进行检测，为黑顺片从原料到成品的内在质量控制提供新的分析手段，方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，保持了黑顺片饮片、标准汤剂与配方颗粒质量的一致性，为确保符合配方颗粒要求的标准汤剂以及确保符合标准汤剂要求的黑顺片饮片原料的生产过程提供重要的多指标参数依据。
以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其包括以下步骤：
1）制备黑顺片的饮片供试品溶液、标准汤剂供试品溶液和配方颗粒供试品溶液以及对照药材溶液和对照品溶液；
2）将所述对照品溶液、所述对照药材溶液、所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，得到各自的UPLC-MS图谱；
3）基于所述对照品溶液的UPLC-MS图谱，确定所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的特征峰，并以所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱作为对照，分别按照要求选出所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液各自UPLC-MS图谱中的对应峰，构建黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱；
步骤1）中，所述对照品包括新乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱、宋果灵、附子灵和尼奥林；
制备所述对照药材溶液的步骤包括：将黑顺片对照药材用水提取；
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤包括：分别将黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒采用甲醇或甲醇水溶液提取；
步骤2）中，所述超高效液相色谱-质谱分析的色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：二元流动相体系，其中：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：0~11min，95%→75%流动相A；11~15min，75%→50%流动相A；15~16min，50%→5%流动相A；16~17min，5%流动相A；所述超高效液相色谱-质谱分析的质谱条件如下：离子源：电喷雾正离子；检测模式：正离子模式。
2.根据权利要求1所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述对照品溶液的步骤包括：将所述对照品采用异丙醇-二氯甲烷混合溶剂溶解，再用甲醇水溶液稀释；
所述提取方式包括超声提取、振摇提取和回流提取；所述提取时间为15分钟～45分钟。
3.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述对照品溶液的步骤中，采用50%甲醇水溶液将对照品稀释。
4.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述对照药材溶液的步骤中，采用回流方式提取。
5.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤包括：取黑顺片饮片、标准汤剂粉末、配方颗粒粉末分别加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，提取，并补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即分别制得所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液、所述配方颗粒供试品溶液；其中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30%～75%。
6.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30%～50%。
7.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤中，分别采用甲醇的体积分数为30%、50%和50%甲醇水溶液提取黑顺片饮片、标准汤剂粉末和配方颗粒粉末。
8.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤中，所述提取方式为超声提取。
9.根据权利要求2所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤1）中，
制备所述饮片供试品溶液、所述标准汤剂供试品溶液和所述配方颗粒供试品溶液的步骤中，所述提取时间为30分钟。
10.根据权利要求1所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18色谱柱，100×2.1mm，1.7μm。
11.根据权利要求1所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流速：0.3mL/min～0.5mL/min；进样量：1μL；柱温：25℃～45℃。
12.根据权利要求11所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述流速为0.4mL/min。
13.根据权利要求11所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述柱温为35℃。
14.根据权利要求1所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：干燥气温度：300℃；干燥气流量：8L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：4000V；毛细管出口电压：175V；锥孔电压：65V；碎裂电压：120V。
15.根据权利要求1所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中包含至少10个特征峰。
16.根据权利要求15所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤3）中，选出所述对应峰的要求如下：
所述饮片供试品溶液的UPLC-MS图谱中包含与所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的至少10个特征峰的保留时间和质荷比分别对应的色谱峰，并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定；
所述标准汤剂供试品溶液的UPLC-MS图谱中包含与所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的至少9个特征峰的保留时间和质荷比分别对应的色谱峰，并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定；
所述配方颗粒供试品溶液的UPLC-MS图谱中包含与所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中的至少9个特征峰的保留时间和质荷比分别对应的色谱峰，并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定。
17.根据权利要求16所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法，其特征在于，所述关于相对保留时间的规定如下：
在供试品溶液的UPLC-MS图谱中，以有对照品参比且峰面积最大的色谱峰作为S峰，无对照品参比的各色谱峰相对于S峰的相对保留时间在规定值的±15%之内，所述规定值基于所述对照药材溶液的UPLC-MS图谱中各特征峰的相对保留时间确定。
18.通过根据权利要求1-17中任一项所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法而获得的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱在评价黑顺片从饮片到标准汤剂和/或从标准汤剂到配方颗粒的生产工艺中的应用。
19.一种黑顺片饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备黑顺片的饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液；
2）将所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液分别进行如权利要求1-17中任一项所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法中所述的超高效液相色谱-质谱分析，得到各自的UPLC-MS图谱；
3）将所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液的UPLC-MS图谱与通过根据权利要求1-17中任一项所述的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱的构建方法而获得的黑顺片饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC-MS特征图谱进行对应比较，以评价所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品品质，并比较所述饮片、标准汤剂和/或配方颗粒待测样品溶液的UPLC-MS图谱之间的差异，以评价所述标准汤剂和/或配方颗粒的生产工艺稳定性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108459096A (zh) * 2018-02-01 2018-08-28 华润三九（雅安）药业有限公司 采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液
CN110824054A (zh) * 2019-11-21 2020-02-21 华润三九（雅安）药业有限公司 附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108459096A (zh) * 2018-02-01 2018-08-28 华润三九（雅安）药业有限公司 采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液
CN110824054A (zh) * 2019-11-21 2020-02-21 华润三九（雅安）药业有限公司 附子指纹图谱及其建立方法、附子质量检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Spectrum-effect relationships between UPLC fingerprints and bioactivities of crude secondary roots of Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) and its three processed products on mitochondrial growth coupled with canonical correlation analysis;Quanfu Zheng 等;《Journal ofEthnopharmacology》;20140312;第153卷;第615-623页 *
不同主产地黑顺片的指纹图谱研究;黄慧莲等;《中国实验方剂学杂志》;20110622(第16期);第44-49页 *
基于UPLC/Q-TOF-MS分析附子煎煮过程中化学成分的变化;周思思等;《中西医结合学报》;20120815(第08期);第894-900页 *
基于指纹图谱和化学计量法评价不同产地黑顺片的质量;王晓雅等;《中药新药与临床药理》;20200325(第03期);第353-358页 *

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