CN118010898A - 附子有效成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种附子有效成分的检测方法，涉及中药检测技术领域。本申请的检测方法包括：取待测附子样品，浸出清液，得到供试品；采用超高速液相色谱三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测，获得特征物质的含量。本申请通过超高速液相色谱‑三重四极杆质谱联用检测方法能够快速对附子进行检测，从而可合理划分不同来源附子的质量水平，为建立科学的附子品质评价方法和质量控制标准提供了参考。
Description
技术领域
本申请涉及中药检测技术领域，具体涉及附子有效成分的检测方法。
背景技术
附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根的加工品，主要功效为回阳救逆，补火助阳，散寒止痛。附子主要分布在四川、陕西、贵州、湖南、云南等地。市场上出售的附子品种多样，而不同的附子由于其含有的有效成分含量有所不同，会直接影响附子的质量以及使用效果。
现有技术中有提供一些有关附子有效成分的检测方法。然而现有的检测方法无法通过检测不同来源附子的有效成分含量来对附子进行区分。且有些检测方法的检测效率不高。
因此，亟需提供一种新的有关附子的检测方法，用于检测不同来源附子的有效成分含量，从而对附子的质量进行辨别，这有利于附子的合理应用。另外，现有技术也需要提供一种新的高效的附子检测方法。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种附子有效成分的检测方法，旨在至少解决上述现有技术中的一种技术问题。本申请提供一种高效的附子检测方法，能够对不同来源的附子进行有效成分含量的检测，从而对附子的质量进行辨别，这有利于附子的合理应用。
本申请实施例是这样实现的：提供一种附子有效成分的检测方法，包括如下步骤：
取待测附子样品，加入盐酸水溶液浸出清液，并取所述清液加入氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液中，得到供试品；
采用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测，获得特征物质的含量；
其中，所述特征物质包括水溶性生物碱、单酯型生物碱和双酯型生物碱，且，所述水溶性生物碱包括附子灵、宋果灵和尼奥林；所述单酯型生物碱包括苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头碱；所述双酯型生物碱包括新乌头碱、次乌头碱和乌头碱；
所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱，规格为：1.7μm，2.1×100mm；所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测的洗脱方式为：
在0~1.0min，采用体积比90%的流动相A和10%流动相B形成的混合流动相；在1.0~10min采用梯度洗脱，流动相A从体积比90%降至10%，流动相B从体积比10%增至90%；在10min及之后，采用体积比10%流动相A和90%流动相B形成的混合流动相；其中，流动相A为体积占比0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相的流速为0.2-0.6mL/min。
在一些实施例中，所述根据所述特征物质的含量范围，确定所述待测附子样品的质量，包括：
在所述水溶性生物碱的含量为30~250μg/g且尼奥林的含量为20~120μg/g，所述单酯型生物碱的含量为150~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量≤180μg/g，则确定所述待测附子样品为A1质量水平；
在所述水溶性生物碱的含量≥50μg/g且尼奥林的含量≥50μg/g，所述单酯型生物碱的含量为60~340μg/g，则确定所述待测附子样品为A2质量水平；
在所述水溶性生物碱的含量为40~400μg/g且所述尼奥林的含量为20~310μg/g，所述单酯型生物碱的含量≥100μg/g，所述双酯型生物碱的含量为10~90μg/g，且所述新乌头碱的含量≤50μg/g，则确定所述待测附子样品为A3质量水平。此处的A1、A2、A3质量水平属于根据附子特征物质的含量进行人为的划分，划分的目的在于更好地区分不同有效成分的附子，从而满足附子的不同场景的合理应用。A1、A2、A3质量水平之间不存在直接的优劣等级区别。
在一些实施例中，所述水溶性生物碱的含量为100~200μg/g，所述尼奥林的含量为50~100μg/g，所述单酯型生物碱的含量为350~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量为120~180μg/g，所述新乌头碱的含量为50~120μg/g，则确定所述待测附子样品为A1质量水平。
在所述水溶性生物碱的含量为250~400μg/g，且所述尼奥林的含量为150~350μg/g，所述单酯型生物碱的含量为350~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量为50~90μg/g，且所述新乌头碱的含量为1~30μg/g，则确定所述待测附子样品为A2质量水平。
在一些实施例中，所述水溶性生物碱的含量为50~300μg/g，所述尼奥林的含量为50~250μg/g，所述单酯型生物碱的含量为60~340μg/g，所述双酯型生物碱的含量为50~300μg/g，则确定所述待测附子样品为A3质量水平。
在一些实施例中，所述确定所述待测附子样品为A2质量水平时，还包括：
在所述双酯型生物碱的含量为50~100μg/g，所述新乌头碱的含量≤50μg/g。
进一步的，在所述双酯型生物碱的含量为150~300μg/g，所述新乌头碱的含量≥50μg/g，则确定所述待测附子样品的为A2质量水平。
在一些实施例中，所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，规格为：1.7μm，2.1×100mm；
和/或，所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱的柱温为32-38℃，检测波长为230-240nm；
和/或，每次对所述供试品进行检测，进样0.8-1.2μL，平衡时间0.8-1.2min；
和/或，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为：0~1.0min，90%流动相A，10%流动相B；1.0~10min为梯度洗脱，90%→10%流动相A，10%→90%流动相B；10min之后，10%流动相A，90%流动相B；其中，流动相A为体积占比0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相的流速为0.2-0.6mL/min。
在一些实施例中，所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中质谱条件为：以三重四级杆质谱检测，电喷雾离子化方式，检测离子为正离子，监控模式为多级反应检测模式；
和/或，毛细管电压为5.5 kV，离子源温度为500 ℃，去簇电压为100 V。
在一些实施例中， 所述采用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测之前，还包括：
配制标准品混合液，使用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测标准品混合液，得到标准离子流色谱图；
以及，通过不同浓度的所述标准品混合液，确定各个所述标准品的标准曲线；
其中，所述标准品混合液的配制步骤包括：取新乌头碱、附子灵、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、去甲猪毛菜碱、新乌头原碱、滇乌头碱、次乌头原碱、宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏的标准品，混合加入异丙醇-二氯甲烷混合溶液制成所述标准品混合液。
在一些实施例中，所述取待测附子样品，浸出清液，得到供试品，包括：
取所述待测附子样品的粉末，加入0.01-0.1mol/L盐酸水溶液中，混合后取清液，得到所述供试品；其中，所述待测附子样品与所述盐酸水溶液的质量体积比为30-60mg/mL。
在一些实施例中，所述取待测附子样品，浸出清液，得到供试品，包括：
取5µL所述清液，加入20 ng·ml-1氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液100µL，涡旋30s，于10000-15000 rpm离心15-30min，取上清液作为所述供试品。
本申请的检测方法，通过超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法能够快速对附子进行检测。通过本申请的检测方法能对不同来源的附子的有效成分含量进行准确检测，为建立科学的不同质量水平附子饮片所需药材品质评价方法和质量控制标准提供了参考。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请提供的检测方法一实施例的流程示意图；
图2、图3、图4分别为新乌头碱1的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图5、图6、图7分别为附子灵2的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图8、图9、图10分别为次乌头碱3的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图11、图12、图13分别为苯甲酰新乌头原碱4的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图14、图15、图16分别为乌头碱5的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图17、图18、图19分别为苯甲酰次乌头原碱6的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图20、图21、图22分别为乌头原碱7的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图23、图24、图25分别为去甲猪毛菜碱8的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图26、图27、图28分别为新乌头原碱9的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图29、图30、图31分别为滇乌头碱10的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图32、图33、图34分别为次乌头原碱11的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图35、图36、图37分别为宋果灵12的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图38、图39、图40分别为尼奥林13的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图41、图42、图43分别为塔拉萨敏14的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
标准品色谱图1和标准品色谱图2为标准品进行两次重复进样的色谱图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
由于生长环境、栽培管理方式、采收期、甚至炮制方式的不同，造成了产区间附子饮片质量的差异，本申请提供一种基于超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法的附子检测方法，为建立科学的附子饮片不同质量水平品质评价方法和质量控制标准提供了参考。
本申请提供一种基于超高速液相色谱三重四极杆质谱联用的附子的检测方法，包括如下步骤：
步骤S11：取待测附子样品，加入盐酸水溶液浸出清液，并取所述清液加入氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液中得到供试品；
本步骤通过对待测附子样品进行预处理得到的浸出物，以能够将附子中的特定组分浸出，有利于后续检测的准确性。
在一实施例中，具体可以将待测附子样品打成粉末，加入盐酸水溶液中，超声处理后，取清液即待测附子样品。其中，附子粉末与盐酸水溶液的质量体积比为30-60mg/mL，比如可以为30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL等。盐酸水溶液的浓度可以为0.01-0.1mol/L，具体可以为0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.08mol/L、0.1mol/L等。超声的时间可以为20-60min，比如20min、30min、40min、60min等。
在一具体实施例中，将250mg的附子样品粉末，加6.25ml的0.05M的盐酸水溶解，超声，静置，取5µL上清液，然后加入100µL含20 ng·ml-1氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液，涡旋30s，于13000 rpm离心15min，取上清液作为供试品；其中，内标溶液通过如下制备：用移液枪确吸取一定量的氢溴酸高乌甲素储备液（10 µg/mL），用乙腈稀释至20 ng/mL。
可以理解的，超声处理后，可以通过静置以得到清液，也可以通过离心、过滤等固液分离方式得到清液。
步骤S12：采用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测，获得特征物质的含量；
其中，所述特征物质包括水溶性生物碱、单酯型生物碱，具体的，水溶性生物碱包括附子灵、宋果灵和尼奥林，单酯型生物碱包括苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头碱。进一步的，水溶性生物碱的含量可以为附子灵、宋果灵和尼奥林的含量之和。单酯型生物碱的含量可以为苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头碱的含量之和。
进一步的，所述特征物质还包括双酯型生物碱，双酯型生物碱包括新乌头碱、次乌头碱和乌头碱。具体的，双酯型生物碱的含量可以为新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量之和。
步骤S13：根据所述特征物质的含量范围，确定所述待测附子样品的质量水平；
在一实施例中，在所述水溶性生物碱的含量为30~250μg/g且尼奥林的含量为20~120μg/g，所述单酯型生物碱的含量为150~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量≤180μg/g，确定所述待测附子样品的质量水平为A1。
进一步的，在一实施例中，所述水溶性生物碱的含量为100~200μg/g，所述尼奥林的含量为50~100μg/g，所述单酯型生物碱的含量为350~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量为120~180μg/g，所述新乌头碱的含量为50~120μg/g，确定所述待测附子样品的的质量水平为A1。
在一实施例中，在所述水溶性生物碱的含量为40~400μg/g且所述尼奥林的含量为20~310μg/g，所述单酯型生物碱的含量≥100μg/g，所述双酯型生物碱的含量为10~90μg/g，且所述新乌头碱的含量≤50μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A3。
进一步的，在所述水溶性生物碱的含量≥200μg/g且所述尼奥林的含量≥150μg/g，所述单酯型生物碱的含量≥200μg/g，所述双酯型生物碱的含量≥50μg/g，且所述新乌头碱的含量≤50μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A3。
进一步的，在所述水溶性生物碱的含量为250~400μg/g，且所述尼奥林的含量为150~350μg/g，所述单酯型生物碱的含量为350~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量为50~90μg/g，且所述新乌头碱的含量为1~30μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A3。
在一实施例中，在所述水溶性生物碱的含量≥50μg/g且尼奥林的含量≥50μg/g，所述单酯型生物碱的含量为60~340μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A2。
在另一实施例中，在所述水溶性生物碱的含量≥100μg/g且尼奥林的含量≥50μg/g，所述单酯型生物碱的含量为150~340μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A2。
进一步的，在一实施例中，所述水溶性生物碱的含量为50~300μg/g，所述尼奥林的含量为50~250μg/g，所述单酯型生物碱的含量为60~340μg/g，所述双酯型生物碱的含量为50~300μg/g，确定所述待测附子样品的质量水平为A2。
进一步的，在一实施例中，所述水溶性生物碱的含量为100~250μg/g，所述尼奥林的含量为50~150μg/g，所述单酯型生物碱的含量为150~340μg/g，所述双酯型生物碱的含量为50~300μg/g，确定所述待测附子样品的的质量水平为A2。
进一步的，所述确定所述待测附子样品的质量水平为A2时，还可以进一步通过双酯型生物碱的含量，以及新乌头碱的含量来对A2进行更细区分，具体包括：在所述双酯型生物碱的含量为50~100μg/g，所述新乌头碱的含量≤50μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A2；在所述双酯型生物碱的含量为150~300μg/g，所述新乌头碱的含量≥50μg/g，则确定所述待测附子样品的质量水平为A2。
进一步的，四川江油附子中，所述水溶性生物碱的含量为50~300μg/g，所述尼奥林的含量为70~250μg/g；四川布拖附子中，所述水溶性生物碱的含量为180~300μg/g，所述尼奥林的含量为50~190μg/g。
【色谱条件】
所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱，具体规格为：1.7μm，2.1×100mm。
所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱的柱温为32-38℃（比如32℃、35℃、38℃等）、流速为0.3-0.8mL/min（比如0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min等）、检测波长为230-240nm。
每次对供试品进行检测，供试品进样0.8-1.2μL（比如0.8μL、1.0μL、1.2μL等），平衡时间0.8-1.2min（比如0.8min、1.0min、1.2min等）。
所述高效液相色谱检测的洗脱方式为（以下百分比均为体积比）：
0~1.0min，90%流动相A，10%流动相B；
1.0~10min为梯度洗脱，90%→10%流动相A，10%→90%流动相B；
10min之后，10%流动相A，90%流动相B；
其中，流动相A为体积占比0.1%的甲酸水溶液（v/v），流动相B为乙腈。流动相的流速为0.2-0.6mL/min，具体可以为0.2mL/min、0.4mL/min、0.6mL/min等。
【质谱条件】
所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中质谱条件为：以三重四级杆质谱检测，电喷雾离子化（ESI）方式，检测离子为正离子，监控模式为多级反应检测模式（MRM）。
具体的，毛细管电压为5.5 kV，离子源温度为500 ℃，去簇电压（DP）为100 V。
在步骤S12之前，还包括：配制标准品混合液，使用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测标准品混合液，得到标准离子流色谱图，参见图2、图3；步骤2中，采用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测，获得供试品的离子流色谱图，将供试品的离子流色谱图与标准离子流色谱图进行比较，根据停留时间等综合判断，将供试品溶液的监测离子对峰面积比与浓度相当的标准品混合液的监测离子对峰面积比比较：相对比例>50％，允许±20％偏差； 相对比例20％～50％， 允许±25％偏差；相对比例10％～20％，允许±30％偏差； 相对比例＜10％， 允许±50％ 偏差，在允许范围内，则可判定样品中存在该分析物。
其中，标准品包括新乌头碱1、附子灵2、次乌头碱3、苯甲酰新乌头原碱4、乌头碱5、苯甲酰次乌头原碱6、乌头原碱7、去甲猪毛菜碱8、新乌头原碱9、滇乌头碱10、次乌头原碱11、宋果灵12、尼奥林13、塔拉萨敏14。
在一实施例中，所述标准品混合液的配制方法，包括：用甲醇配制系列不同浓度的标准品溶液，混合，得到不同浓度的标准品混合液。
标准溶液的配制
在一具体实施例中，标准品混合液的制备包括：取新乌头碱1、附子灵2、次乌头碱3、苯甲酰新乌头原碱4、乌头碱5、苯甲酰次乌头原碱6、乌头原碱7、去甲猪毛菜碱8、新乌头原碱9、滇乌头碱10、次乌头原碱11、宋果灵12、尼奥林13、塔拉萨敏14的标准品，加异丙醇-二氯甲烷（1：1）混合溶液制成每1 mL各含1 mg的混合溶液作为标准品混合液，用移液枪准确吸取一定量的标准品混合液（1mg/mL），用甲醇稀释至浓度分别为156.25、312.5、625、1250、2500、5000、10000、20000 ng/mL的标准品混合溶液。
内标溶液的配制
在一实施例中，用移液枪确吸取一定量的氢溴酸高乌甲素标准品储备液（10 µg/ml），用乙腈稀释至20 ng/mL。
图1是本申请提供的检测方法一实施例的流程示意图；
图2、图3、图4分别为新乌头碱1的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图5、图6、图7分别为附子灵2的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图8、图9、图10分别为次乌头碱3的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图11、图12、图13分别为苯甲酰新乌头原碱4的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图14、图15、图16分别为乌头碱5的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图17、图18、图19分别为苯甲酰次乌头原碱6的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图20、图21、图22分别为乌头原碱7的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图23、图24、图25分别为去甲猪毛菜碱8的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图26、图27、图28分别为新乌头原碱9的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图29、图30、图31分别为滇乌头碱10的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图32、图33、图34分别为次乌头原碱11的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图35、图36、图37分别为宋果灵12的标准品色谱图、待测附子样品的色谱图、标准曲线；
图38、图39、图40分别为尼奥林13的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线；
图41、图42、图43分别为塔拉萨敏14的标准品色谱图1、标准品色谱图2、标准曲线。
从图1可以看出本发明检测方法的流程，从图2至图43可以看出本发明待检测的附子有效成分的色谱图、有效成分标准品的色谱图以及各个标准品回归方程。
在本实施例中，采用内标法测定标准品，其对应的监测离子对和碰撞能量如表1所示。
表1 标准品和内标的质谱参数
| 物质编号 | 分析物 | 母离子 | 子离子 | 驻留时间 | 碰撞能量(eV) |
| 1 | 新乌头碱 | 632.4 | 572.4 | 0.1S | 44.3 |
| 2 | 附子灵 | 454.2 | 436.2 | 0.1S | 45.1 |
| 3 | 次乌头碱 | 616.4 | 556.4 | 0.1S | 44.2 |
| 4 | 苯甲酰新乌头原碱 | 590.3 | 540.3 | 0.1S | 46.1 |
| 5 | 乌头碱 | 646.4 | 586.3 | 0.1S | 45.1 |
| 6 | 苯甲酰次乌头原碱 | 574.4 | 542.3 | 0.1S | 46.7 |
| 7 | 乌头原碱 | 500.3 | 450.2 | 0.1S | 45.6 |
| 8 | 去甲猪毛菜碱 | 180.1 | 117.1 | 0.1S | 31.1 |
| 9 | 新乌头原碱 | 486.3 | 436.2 | 0.1S | 45.6 |
| 10 | 滇乌头碱 | 660.4 | 600.4 | 0.1S | 45.7 |
| 11 | 次乌头原碱 | 470.3 | 438.3 | 0.1S | 42.8 |
| 12 | 宋果灵 | 358.3 | 340.3 | 0.1S | 38.5 |
| 13 | 尼奥林 | 438.2 | 420.2 | 0.1S | 38 |
| 14 | 塔拉萨敏 | 422.2 | 390.2 | 0.1S | 47 |
| 15 | 内标：氢溴酸高乌甲素（IS） | 585.4 | 535.3 | 0.1S | 40.9 |
在一具体实施例中，标准曲线的建立，步骤如下：
取9 µL的0.05M的盐酸水于各个EP管中，分别加入1 µL标准溶液的配制项下各浓度的标准品混合溶液，涡旋混匀，加入200µL含20 ng·ml-1内标氢溴酸高乌甲素的乙腈，涡旋30s，于13000 rpm离心15min，取上清装进样瓶待测。得到混合标品理论浓度分别为15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
将上述不同浓度的混合标准品溶液注入色谱仪，以各分析物对照品浓度为横坐标，各分析物标准品定量离子对响应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到各个标准品回归方程（见图7和表2），根据标准曲线计算成分含量。结果表明各个标准品（分析物）的线性方程的相关系数R均在0.99以上，各分析物均有较好的线性关系。
表2 各标准品的回归方程
| 物质编号 | 分析物 | 回归方程 | 相关系数r |
| 1 | 新乌头碱 | y=0.05551x-0.05273 | 0.99601 |
| 2 | 附子灵 | Y=0.03705x-0.13685 | 0.99432 |
| 3 | 次乌头碱 | y=0.04860x+0.07248 | 0.99496 |
| 4 | 苯甲酰新乌头原碱 | y=0.01822x-0.06434 | 0.99593 |
| 5 | 乌头碱 | y=0.01405x-0.10139 | 0.99748 |
| 6 | 苯甲酰次乌头原碱 | y=0.04118x-0.15771 | 0.99707 |
| 7 | 乌头原碱 | y=0.05395x+0.12726 | 0.99458 |
| 8 | 去甲猪毛菜碱 | y=0.00134x-0.00458 | 0.99123 |
| 9 | 新乌头原碱 | y=3.86930e-4x+0.00178 | 0.99169 |
| 10 | 滇乌头碱 | y=0.11466x-0.30830 | 0.99236 |
| 11 | 次乌头原碱 | y=0.06282x-0.23419 | 0.99536 |
| 12 | 宋果灵 | y=0.08051x-0.05585 | 0.99580 |
| 13 | 尼奥林 | y=0.00555x-0.01208 | 0.99186 |
| 14 | 塔拉萨敏 | y=0.02176x+0.05221 | 0.99735 |
下面通过具体实施例、对比例和实验例对本申请的技术方案及技术效果进行详细说明，以下实施例仅仅是本申请的部分实施例，并非对本申请作出具体限定。
试验材料：新乌头碱1、附子灵2、次乌头碱3、苯甲酰新乌头原碱4、乌头碱5、苯甲酰次乌头原碱6、乌头原碱7、去甲猪毛菜碱8、新乌头原碱9、滇乌头碱10、次乌头原碱11、宋果灵12、尼奥林13、塔拉萨敏14等标准品、内标氢溴酸高乌甲素，均来自商用试剂。
仪器：
三重四极杆质谱（MS）：Qtrap 5500，美国AB公司；
超高速液相色谱（UFLC）系统： SIL-30AC autosampler，LC-30AD chromatograph，CBM-20A communications bus module，CTO-20AC prominence column oven，日本岛津公司；
各称量约250mg的四川江油附子样品粉末，加6.25ml的0.05M的盐酸水溶解，超声，静置，取5µL上清待用。
各称量约250mg的四川布拖附子样品粉末，加6.25ml的0.05M的盐酸水溶解，超声，静置，取5µL上清待用。
各称量约250mg的云南丽江附子样品粉末，加6.25ml的0.05M的盐酸水溶解，超声，静置，取5µL上清待用。
各称量约250mg的陕西汉中附子样品粉末，加6.25ml的0.05M的盐酸水溶解，超声，静置，取5µL上清待用。
取5 µL提取的上清样品于各个EP管中，加入100µL含20 ng/mL内标氢溴酸高乌甲素的乙腈，涡旋30s，于13000 rpm离心15min，取上清装进样瓶待测。
液相条件
流速 0.5 mL·min-1；样品室温度：15℃；柱温：35℃；平衡时间1min，进样1µL。色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18 1.7um, 2.1×100mm column，梯度洗脱如表3所示：
表3 液相洗脱条件
质谱参数
电喷雾离子化（ESI）方式，检测离子为正离子；毛细管电压5.5 kV，离子源温度500℃，去簇电压（DP）为100 V。
采用多级反应检测模式（MRM）模式，测定采用内标法测定新乌头碱等标准品，并绘制标准曲线，其对应的监测离子对和碰撞能量如表1所示。各标准品的标准曲线的回归方程见表2，检测获得江油附子、布拖附子、云南丽江附子和陕西汉中附子的各个特征物质的含量如下表4至表7：
表4 江油附子的检测结果
| 物质编号 | 特征物质名 | 含量（μg/g） |
| 1 | 新乌头碱 | 15.91 |
| 2 | 附子灵 | 11.22 |
| 3 | 次乌头碱 | 41.21 |
| 4 | 苯甲酰新乌头原碱 | 126.64 |
| 5 | 乌头碱 | 7.54 |
| 6 | 苯甲酰次乌头原碱 | 18.94 |
| 7 | 乌头原碱 | 1.67 |
| 8 | 去甲猪毛菜碱 | 55.80 |
| 9 | 苯甲酰乌头碱 | 67.82 |
| 10 | 滇乌头碱 | 0.80 |
| 11 | 次乌头原碱 | 0.52 |
| 12 | 宋果灵 | 19.93 |
| 13 | 尼奥林 | 95.59 |
| 14 | 塔拉萨敏 | 3.51 |
表5 布拖附子的检测结果
| 物质编号 | 特征物质名 | 含量（μg/g） |
| 1 | 新乌头碱 | 86.91 |
| 2 | 附子灵 | 44.82 |
| 3 | 次乌头碱 | 54.18 |
| 4 | 苯甲酰新乌头原碱 | 157.16 |
| 5 | 乌头碱 | 23.70 |
| 6 | 苯甲酰次乌头原碱 | 19.10 |
| 7 | 乌头原碱 | 2.06 |
| 8 | 去甲猪毛菜碱 | 46.92 |
| 9 | 苯甲酰乌头碱 | 96.33 |
| 10 | 滇乌头碱 | 0.72 |
| 11 | 次乌头原碱 | 0.71 |
| 12 | 宋果灵 | 36.54 |
| 13 | 尼奥林 | 100.51 |
| 14 | 塔拉萨敏 | 4.13 |
表6 云南附子检测结果
| 物质编号 | 特征物质名 | 含量（μg/g） |
| 1 | 新乌头碱 | 83.61 |
| 2 | 附子灵 | 37.97 |
| 3 | 次乌头碱 | 58.48 |
| 4 | 苯甲酰新乌头原碱 | 249.94 |
| 5 | 乌头碱 | 12.75 |
| 6 | 苯甲酰次乌头原碱 | 17.37 |
| 7 | 乌头原碱 | 3.60 |
| 8 | 去甲猪毛菜碱 | 87.21 |
| 9 | 苯甲酰乌头碱 | 214.42 |
| 10 | 滇乌头碱 | 0.71 |
| 11 | 次乌头原碱 | 1.27 |
| 12 | 宋果灵 | 42.37 |
| 13 | 尼奥林 | 66.85 |
| 14 | 塔拉萨敏 | 5.24 |
表7 云南附子检测结果
| 物质编号 | 特征物质名 | 含量（μg/g） |
| 1 | 新乌头碱 | 10.27 |
| 2 | 附子灵 | 25.39 |
| 3 | 次乌头碱 | 57.64 |
| 4 | 苯甲酰新乌头原碱 | 195.53 |
| 5 | 乌头碱 | 5.27 |
| 6 | 苯甲酰次乌头原碱 | 38.41 |
| 7 | 乌头原碱 | 1.27 |
| 8 | 去甲猪毛菜碱 | 72.23 |
| 9 | 苯甲酰乌头碱 | 218.08 |
| 10 | 滇乌头碱 | 0.81 |
| 11 | 次乌头原碱 | 0.39 |
| 12 | 宋果灵 | 39.21 |
| 13 | 尼奥林 | 236.70 |
| 14 | 塔拉萨敏 | 7.26 |
从表4-7可以看出，不同产地的附子中的有效成分含量存在明显区别。通过本申请的检测方法能够对不同来源的附子有效分成含量进行准确检测，通过附子有效成分含量的准确检测可以对附子的质量进行合理划分，从而在不同场景使用附子时，可以合理选择合适的附子进行合理使用。
通过表4-7也可以进一步看出，不同产地的附子的有效成分含量也存在一定区别，表明本申请的检测方法对不同产地的附子也可进行检测。
从表4-7可以看出，不同来源的附子检测出的有效成分含量有明显区别，以新乌头碱为例，表4记载的江油附子中新乌头碱含量为15.91μg/g，表5记载的布拖附子中新乌头碱含量为86.91μg/g，表6记载的云南附子中新乌头碱含量为83.61μg/g，表7记载的云南附子中新乌头碱含量为10.27μg/g。由此可以看出，不同来源附子的有效成分含量差距很大。因此，为了更好的区分这些附子，可以按照A1、A2、A3质量水平对这些附子进行区分。
以上对本申请实施例所提供的检测方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (10)
1.一种附子有效成分的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测附子样品，加入盐酸水溶液浸出清液，并取所述清液加入氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液中得到供试品；
采用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测，获得特征物质的含量；
其中，所述特征物质包括水溶性生物碱、单酯型生物碱和双酯型生物碱，所述水溶性生物碱包括附子灵、宋果灵和尼奥林，所述单酯型生物碱包括苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头碱，所述双酯型生物碱包括新乌头碱、次乌头碱和乌头碱；
所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱为ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱，规格为：1.7μm，2.1×100mm；所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测的洗脱方式为：
在0~1.0min，采用体积比90%的流动相A和10%流动相B形成的混合流动相；在1.0~10min采用梯度洗脱，流动相A从体积比90%降至10%，流动相B从体积比10%增至90%；在10min及之后，采用体积比10%流动相A和90%流动相B形成的混合流动相；其中，流动相A为体积占比0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相的流速为0.2-0.6mL/min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，根据所述特征物质的含量，确定所述待测附子样品的质量，包括：
在所述水溶性生物碱的含量为30~250μg/g且尼奥林的含量为20~120μg/g，所述单酯型生物碱的含量为150~600μg/g，所述双酯型生物碱的含量≤180μg/g，则确定所述待测附子样品为A1质量水平；
在所述水溶性生物碱的含量≥50μg/g且尼奥林的含量≥50μg/g，所述单酯型生物碱的含量为60~340μg/g，则确定所述待测附子样品为A2质量水平；
在所述水溶性生物碱的含量为40~400μg/g且所述尼奥林的含量为20~310μg/g，所述单酯型生物碱的含量≥100μg/g，所述双酯型生物碱的含量为10~90μg/g，且所述新乌头碱的含量≤50μg/g，则确定所述待测附子样品为A3质量水平。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水溶性生物碱的含量为50~300μg/g，所述尼奥林的含量为50~250μg/g，所述单酯型生物碱的含量为60~340μg/g，所述双酯型生物碱的含量为50~300μg/g，确定所述待测附子样品为A2质量水平。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述待测附子样品为A2质量水平时，还包括：
在所述双酯型生物碱的含量为50~100μg/g，所述新乌头碱的含量≤50μg/g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中色谱柱的柱温为32-38℃，检测波长为230-240nm。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，每次对所述供试品进行检测，进样0.8-1.2μL，平衡时间0.8-1.2min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测过程中质谱条件为：以三重四级杆质谱检测，电喷雾离子化方式，检测离子为正离子，监控模式为多级反应检测模式；
和/或，毛细管电压为5.5 kV，离子源温度为500 ℃，去簇电压为100 V。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测方法对所述供试品进行检测之前，还包括：
配制标准品混合液，使用超高速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测标准品混合液，得到标准离子流色谱图；
以及，通过不同浓度的所述标准品混合液，确定各个所述标准品的标准曲线；
其中，所述标准品混合液的配制步骤包括：取新乌头碱、附子灵、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、去甲猪毛菜碱、新乌头原碱、滇乌头碱、次乌头原碱、宋果灵、尼奥林、塔拉萨敏的标准品，混合加入异丙醇-二氯甲烷混合溶液制成所述标准品混合液。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述取待测附子样品，加入盐酸水溶液浸出清液，包括：
取所述待测附子样品的粉末，加入0.01-0.1mol/L盐酸水溶液中，混合后取清液，其中，所述待测附子样品与所述盐酸水溶液的质量体积比为30-60mg/mL。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述取所述清液加入氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液中得到供试品，包括：
取5µL所述清液，加入20 ng·ml-1氢溴酸高乌甲素-乙腈溶液100µL，涡旋30s，于10000-15000 rpm离心15-30min，取上清液作为所述供试品。
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