CN108459096A - 采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液 - Google Patents

采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液 Download PDF

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Abstract

一种采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液，涉及中药注射液生产检测领域。黑顺片自动化提取过程中实时放行方法采集检测黑顺片原料样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱；根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量提取，采用超滤膜除去杂质，得到黑顺片提取液；在线采集检测黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱；根据黑顺片提取液的生物碱含量调整黑顺片的提取工艺参数，该方法通过不同原料对应不同工艺参数以得到稳定的有效成分，提高黑顺片减毒增效的批间稳定性、安全性，同时减少有毒有害试药试剂的应用，所得的黑顺片提取液和参附注射液的产品质量稳定性好，临床用药的安全性、有效性高。

Description

采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提 取液及参附注射液
技术领域
本发明涉及中药注射液生产检测领域，且特别涉及一种采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液。
背景技术
目前上市的中药注射液产品均实施检验放行标准，该标准只能评价产品质量的符合性，该模式为“事后控制”，对临床用药的安全性和有效性的反馈滞后。但是中药注射液成分复杂，检验放行只能抽检现有质量标准中的检验指标，不能全面代表产品内在质量情况以及批间一致性。参附注射液作为常见的一种中药注射液产品，主要用于阳气暴脱的厥脱症(感染性、失血性、失液性休克等)；也可用于阳虚(气虚)所致的惊悸、怔忡、喘咳、胃疼、泄泻、痹症等，其主要原料为红参、附片(黑顺片)。黑顺片属于有毒药材，其中含毒成分乌头类碱也是有效成分，且中毒计量与治疗计量接近。
黑顺片作为参附注射剂原料，临床使用已有30多年，对黑顺片的现行质量标准只有双酯型生物碱上限鉴别，和单酯型生物碱的下限鉴别，不能全面反映黑顺片的质量情况，且检验过程涉及使用大量有毒有害有机试剂，如生物碱萃取用异丙醇、二氯甲烷等的应用，对检验人员的健康以及环境污染均有较大程度的影响。
因此，需要建立一种黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，以提高黑顺片减毒增效的批间稳定性、安全性，同时减少有毒有害试药试剂的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，通过建立生产过程参数实时放行标准，不同原料对应不同工艺参数以得到稳定的有效成分，提高黑顺片减毒增效的批间稳定性、安全性，同时减少有毒有害试药试剂的应用。
本发明的另一目的在于提供一种黑顺片提取液，产品质量稳定性好，临床用药的安全性、有效性高。
本发明的另一目的在于提供一种参附注射液，产品质量稳定性好，临床用药的安全性、有效性高。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其包括以下步骤：
采集黑顺片原料样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片原料的生物碱含量、指纹图谱标准；
根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量，于110～130℃提取 1.5～4小时，采用截留分子量为5KD～10KD的超滤膜除去杂质，得到黑顺片提取液；
在线采集黑顺片提取液样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片提取液的生物碱含量、指纹图谱标准；
根据黑顺片提取液的生物碱含量调整黑顺片的提取工艺参数，直至黑顺片提取液中的单酯型乌头碱含量控制在1.5-4.5μg/ml。
进一步地，在本发明较佳实施例中，根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量的方法为：若黑顺片原料的生物碱含量为 0.010％～0.013％，黑顺片原料的加酸体积比为0.98～1.02：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.014％～0.016％，黑顺片原料的加酸体积比为1.03～1.07：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.017％～0.020％，黑顺片原料的加酸体积比为1.08～1.12：100。
进一步地，在本发明较佳实施例中，生物碱包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱，苯甲酰新乌头原碱，其中，苯甲酰乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱，苯甲酰新乌头原碱为单酯型乌头碱，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱为双酯型乌头碱。
进一步地，在本发明较佳实施例中，检测黑顺片原料样品的生物碱含量的方法为：
取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷混合溶液，制成每1ml各含10μg 苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得原料对照品溶液；
取黑顺片原料样品，粉碎成粉，加氨试液，加入异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，超声处理，用异丙醇-乙酸乙酯混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤；量取滤液，于40℃以下减压回收溶剂至干，在残渣加入异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤，取续滤液，即得原料供试品溶液；
分别吸取原料对照品溶液与原料供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，得到黑顺片原料样品的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱含量。
进一步地，在本发明较佳实施例中，检测黑顺片原料样品的色谱指纹图谱的方法为：
取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷混合溶液，制成每1ml各含10μg 苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得原料对照品溶液；
取黑顺片原料样品，加盐酸溶液浸渍，补加水，煮沸提取，在药渣加盐酸溶液煮沸提取，合并两次煎煮液并加水稀释，搅匀，过滤，取续滤液，即得供试品提取溶液；
分别吸取原料对照品溶液与供试品提取溶液各20μl，注入液相色谱仪测定，得到黑顺片原料样品的色谱指纹图谱。
进一步地，在本发明较佳实施例中，检测黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱的方法为：
取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷混合溶液，制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及每1ml各含5μg乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的混合溶液，即得成品参照溶液；
取黑顺片提取液样品，加入已平衡的Polyclean-X-HLB 60mg/3ml 固相萃取柱中，抽干柱子，先用水冲洗，再用甲醇冲洗，收集甲醇液，摇匀，即得成品供试品溶液；
分别吸取成品参照溶液与成品供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪检测，得到黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱。
本发明提出一种黑顺片提取液，其是采用上述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法得到。
进一步地，在本发明较佳实施例中，黑顺片提取液中单酯性乌头碱含量为1.5-4.5μg/ml。
本发明提出一种参附注射液，其包括上述的黑顺片提取液。
本发明实施例的采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液的有益效果是：本发明实施例的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法采集黑顺片原料样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片原料的生物碱含量、指纹图谱标准；根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量，于110～130℃提取1.5～4小时，采用截留分子量为5KD～10KD的超滤膜除去杂质，得到黑顺片提取液；在线采集黑顺片提取液样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片提取液的生物碱含量、指纹图谱标准；根据黑顺片提取液的生物碱含量调整黑顺片的提取工艺参数，直至黑顺片提取液中的单酯型乌头碱含量控制在1.5-4.5μg/ml，该黑顺片自动化提取过程中实时放行方法通过建立生产过程参数实时放行标准，不同原料对应不同工艺参数以得到稳定的有效成分，提高黑顺片减毒增效的批间稳定性、安全性，同时减少有毒有害试药试剂的应用。所得的黑顺片提取液和参附注射液的产品质量稳定性好，临床用药的安全性、有效性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中黑顺片药材对照指纹图谱；
图2为本发明实施例1中不同批次高温热处理温度趋势图；
图3为本发明实施例1中成品参照溶液色谱图；
图4为本发明实施例1中成品供试品溶液色谱图；
图5为对比例1所得不用批次成品的单酯型乌头碱总量变化图；
图6为本发明实施例1所得不同批次成品的单酯型乌头碱总量变化图；
图7为本发明实施例1和对比例1所得不同批次成品的总固体变化趋势图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的采用黑顺片自动化提取过程中实时放行方法所得的黑顺片提取液及参附注射液进行具体说明。
本发明实施例提供一种黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其包括以下步骤：
S1、采集黑顺片原料样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片原料的生物碱含量、指纹图谱标准，以确定投料原料质量的一致性。本实施例所指的生物碱包括乌头碱(Aconitine，1)、次乌头碱(Hypaconitine，2)、新乌头碱(Mesaconitine，3)、苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconine，4)、苯甲酰次乌头原碱 (Benzoylhypaconine，5)、苯甲酰新乌头原碱(Benzoylmesaconine， 6)，其中，苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconine，4)、苯甲酰次乌头原碱(Benzoylhypaconine，5)、苯甲酰新乌头原碱(Benzoylmesaconine， 6)为单酯型乌头碱(有效成分)；乌头碱(Aconitine，1)、次乌头碱 (Hypaconitine，2)、新乌头碱(Mesaconitine，3)为双酯型乌头碱 (有毒成分)。
S2、根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量，具体方法为：若黑顺片原料的生物碱含量为0.010％～0.013％，黑顺片原料的加酸体积比为0.98～1.02：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.014％～0.016％，黑顺片原料的加酸体积比为1.03～1.07：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.017％～0.020％，黑顺片原料的加酸体积比为1.08～1.12：100，并于110～130℃提取1.5～4小时，促进有毒成分双酯型乌头碱的降解，使含不同双酯型乌头碱含量的原料制备所得的成品中有效成分稳定，再采用截留分子量为5KD～10KD(优选8KD)的超滤膜(优选聚醚砜超滤膜)过滤除去药液中大分子物质和易缔合成大分子物质的小分子杂质，得到黑顺片提取液。
另外，对同1批次黑顺片原料的不同批次热处理运行参数进行统计分析，优化自动提取参数，缩小批间参数波动值。
S3、在线采集黑顺片提取液样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片提取液的生物碱含量、指纹图谱标准。
S4、根据黑顺片提取液的生物碱含量调整黑顺片的提取工艺参数，直至黑顺片提取液中的单酯型乌头碱含量控制在1.5-4.5μg/ml。
另外，对不同批次不同生物碱含量范围的黑顺片提取液加入不同量的盐酸比例，热处理后，再对样品进行测定，结合有效成分(单酯性生物碱含量)、有毒成分(双酯型乌头碱含量)、批间稳定性指标(总固体)进行检测，以获得稳定、安全的成品。
本发明实施例的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法环保、健康、安全，具体是在黑顺片提取过程中，将降毒增效工序的各生物碱含量测定及放行标准转化为自动提取参数实时放行标准。每个工序采用参数实时放行，实现多维度实时质量评估，免除中间体的检测，减少有机试剂的使用以及有机试剂对环境的污染；减少人为检测干预，降低应抽检或检测指标不全面给产品质量评估带来的风险。而且，对于成品生物碱含量控制标准，现有技术中是以苯甲酰新乌头原碱下限 (约≥0.08μg/ml)液相鉴别，本实施例提升为控制单酯型乌头碱含量 (1.5-4.5μg/ml)，提升了成品的有效性和安全性。
步骤S1中，检测黑顺片原料样品的生物碱含量的方法为：
取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(体积比1：1) 混合溶液，制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得原料对照品溶液。
取黑顺片原料样品，粉碎成粉，混合均匀，过三号筛，精密称定，加氨试液，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(体积比1：1)混合溶液，称定重量，超声处理(功率200～400W、频率30～50kHz、水温在25℃以下)20～60分钟，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(体积比1：1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤；精密量取续滤液 25ml，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷(体积比1：1)混合溶液溶解，过滤，取续滤液，即得原料供试品溶液。
分别精密吸取原料对照品溶液与原料供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，得到黑顺片原料样品的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱含量。本实施例的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃(体积比25：15)为流动相A，以0.1mol/L醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。
按干燥品计算，其中含苯甲酰乌头原碱(C32H45NO10)、苯甲酰次乌头原碱(C31H43NO9)和苯甲酰新乌头原碱(C31H43NO10)的总量计不得少于0.010％，否则不符合原料标准。
步骤S1中，检测黑顺片原料样品的色谱指纹图谱的方法为：
取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(体积比1：1) 混合溶液，制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得原料对照品溶液。
取黑顺片原料样品100g，加1％盐酸溶液300ml浸渍24小时，补加水500ml，煮沸提取2小时，药渣加0.015％盐酸溶液700ml，煮沸提取2小时，合并两次煎煮液并加水稀释至500ml，搅匀，过滤，取续滤液，即得供试品提取溶液。
分别精密吸取原料对照品溶液与供试品提取溶液各20μl，注入液相色谱仪测定，得到黑顺片原料样品的色谱指纹图谱。本实施例的色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，推荐色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18(4.6mm×250mm，5μm)；以0.2％三乙胺(用冰醋酸调PH5.3)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm，柱温为30℃；流速：1ml/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于20000)。
在8～54分钟范围内，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，黑顺片原料样品的色谱指纹图谱与黑顺片药材对照指纹图谱比较，8 个共有峰匹配相似度应不得低于0.9，否则不符合原料标准。
步骤S3中，检测黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱的方法为：
取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(体积比1：1)混合溶液制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及每1ml各含5μg乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的混合溶液，即得成品参照溶液。
取黑顺片提取液样品精密量取1ml，加入已平衡的 Polyclean-X-HLB 60mg/3ml固相萃取柱中，以2ml/min的速度，抽干柱子，先用水冲洗5ml—再用甲醇冲洗1ml收集甲醇液，摇匀，即得成品供试品溶液。
分别精密吸取成品参照溶液与成品供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪检测，得到黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱。本实施例的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18(4.6mm×250mm，5μm)；以0.2％三乙胺(用冰醋酸调pH5.3)为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为235nm；柱温30℃；流速1ml/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于20000。
本发明实施例提供一种黑顺片提取液，其是采用上述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法得到。黑顺片提取液中双酯型生物碱未检出，有效成分单酯性乌头碱含量为1.5-4.5μg/ml。
本发明实施例提供一种参附注射液，其包括上述的黑顺片提取液。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其是按照以下过程进行：
1、建立黑顺片原料的生物碱含量、原料指纹图谱标准。
1.1含量测定
1.1.1色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃(25：15) 为流动相A，以0.1mol/L醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml) 为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～48 15→26 85→74
48～49 26→35 74→65
49～58 35 65
58～65 35→15 65→85
1.1.2原料对照品溶液的制备：
取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(1：1)混合溶液制成每1ml各含10μg的混合溶液，即得。
1.1.3原料供试品溶液的制备：
取供试品，粉碎成粉，混合均匀(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1：1) 混合溶液50ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz，水温再25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1： 1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25ml， 40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷(1：1) 混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得。
1.1.4测定法：
分别精密吸取原料对照品溶液与原料供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算含苯甲酰新乌头原碱(C31H43NO10)、苯甲酰乌头原碱(C32H45NO10)和苯甲酰次乌头原碱(C31H43NO9)的总量计，不得少于0.010％。
1.2指纹图谱
1.2.1色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，推荐色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18(4.6mm×250mm，5μm)；以0.2％三乙胺(用冰醋酸调PH5.3)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm，柱温为30℃；流速：1ml/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于20000。
时间 A(0.2％三乙胺，冰HAc调PH5.3) B(甲醇)
0min 70％ 30％
30min 45％ 55％
54min 27％ 73％
1.2.2原料对照品溶液的制备：
取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(1：1)混合溶液制成每1ml各含10μg的混合溶液，即得。
1.2.3供试品提取溶液的制备：
取附片药材100g，加1％盐酸溶液300ml浸渍24小时，补加水 500ml，煮沸提取2小时，药渣加0.015％盐酸溶液700ml，煮沸提取2小时，合并两次煎煮液并加水稀释至500ml，搅匀，过滤，取续滤液，即得。
1.2.4测定法：
分别精密吸取原料对照品溶液与供试品提取溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。在8～54分钟范围内，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，成品的指纹图谱与附片(黑顺片)药材对照指纹图谱 (附片药材对照指纹图谱如图1所示)比较，以8个共有峰匹配相似度应不得低于0.9。
2、根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量，具体方法为：若黑顺片原料的生物碱含量为0.010％～0.013％，黑顺片原料的加酸体积比为0.98～1.02：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.014％～0.016％，黑顺片原料的加酸体积比为1.03～1.07：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.017％～0.020％，黑顺片原料的加酸体积比为1.08～1.12：100，并于110～130℃提取1.5～4小时，促进有毒成分双酯型乌头碱的降解，使含不同双酯型乌头碱含量的原料制备所得的成品中有效成分稳定，再采用截留分子量为5KD～10KD(优选8KD)的超滤膜(优选聚醚砜超滤膜)过滤除去药液中大分子物质和易缔合成大分子物质的小分子杂质，得到黑顺片提取液。
对同1批次附片原料50批次热处理运行参数进行统计分析，其中42批次高温热处理温度趋势图如2所示，优化自动提取参数，缩小批间参数波动值。
3、测定药液的乌头碱(Aconitine，1)，次乌头碱(Hypaconitine， 2)，新乌头碱(Mesaconitine，3)，苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconine， 4)，苯甲酰次乌头原碱(Benzoylhypaconine，5)，苯甲酰新乌头原碱 (Benzoylmesaconine，6)，建立参数标准。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Thermo Hypersil BDSC18(4.6mm×250mm，5μm)；以0.2％三乙胺(用冰醋酸调pH5.3)为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm；柱温30℃；流速1ml/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于20000。
成品参照溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(1：1) 混合溶液制成每1ml各含10μg苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱及每1ml各含5μg新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的混合溶液，即得。
成品供试品溶液的制备：附片提取液精密量取1ml，加入已平衡的Polyclean-X-HLB 60mg/3ml固相萃取柱中，以2ml/min的速度，抽干柱子，水冲洗5ml—甲醇冲洗1ml收集甲醇液，摇匀，即得。
线性：附片提取液中双酯型生物碱几乎检测不出，故对苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱作标准曲线绘制。精密量取以配制的苯甲酰新乌头原碱对照品(0.50962mg/ml)与苯甲酰次乌头原碱 (0.50388mg/ml)对照品混合溶液1ml，分别稀释至100ml、50ml、25ml、10ml、5ml，精密吸取对照品混合溶液4ml，稀释至25ml。按参附注射液乌头类生物碱含量检测方法，检测。结果显示苯甲酰新乌头原碱在0.1019μg～2.5385μg之间线性良好(r＝0.999),结果显示苯甲酰新乌头原碱在0.1008μg～2.6156μg线性良好(r＝0.996)。
测定法：分别精密吸取成品参照溶液与成品供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪检测，得到黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱。成品参照溶液色谱图如图3所示，成品供试品溶液色谱图如图4所示。
4、根据黑顺片提取液的生物碱含量调整黑顺片的提取工艺参数，直至黑顺片提取液中的单酯型乌头碱含量控制在1.5-4.5μg/ml。
对3批次不同含量范围的黑顺片提取液各10批次，共30-50个样品加入不同量的盐酸比例，热处理后对样品进行测定，结合有效成分(单酯性生物碱含量)、有毒成分(双酯型乌头碱含量)、批间稳定性指标(总固体)进行检测。黑顺片减毒增效控制参数表如表1所示。
表1黑顺片减毒增效控制参数表
对比例1
对比例提供一种黑顺片的提取方法，其是采用不同批次黑顺片原料，按照表1所示的减毒增效控制参数表中的工艺参数进行，最后得到不同批次的黑顺片提取液成品。
实施例1是实时放行标准建立并按照标准参数实施后进行的提取方法，对比例1是优化前，即未按照实时放行标准进行的提取方法，将实施例1和对比例1的黑顺片提取液成品进行数据对比，结果如图 5～7所示。图5为对比例1所得不用批次成品的单酯型乌头碱总量变化图；图6为实施例1所得不同批次成品的单酯型乌头碱总量变化图；图7为实施例1和对比例1所得不同批次成品的总固体变化趋势图。由图5～7可知，按照实时放行标准进行的提取方法所得的成品的批间稳定性、安全性明显高于未按照实时放行标准进行的提取方法所得的成品。
综上所述，本发明实施例的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法通过建立生产过程参数实时放行标准，不同原料对应不同工艺参数以得到稳定的有效成分，提高黑顺片减毒增效的批间稳定性、安全性，同时减少有毒有害试药试剂的应用。本发明实施例的黑顺片提取液和参附注射液的产品质量稳定性好，临床用药的安全性、有效性高。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其特征在于，其包括以下步骤：
采集黑顺片原料样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片原料的生物碱含量、指纹图谱标准；
根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量，于110～130℃提取1.5～4小时，采用截留分子量为5KD～10KD的超滤膜除去杂质，得到黑顺片提取液；
在线采集黑顺片提取液样品，检测其中的生物碱含量以及色谱指纹图谱，建立黑顺片提取液的生物碱含量、指纹图谱标准；
根据黑顺片提取液的生物碱含量调整黑顺片的提取工艺参数，直至黑顺片提取液中的单酯型乌头碱含量控制在1.5-4.5μg/ml。
2.根据权利要求1所述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其特征在于，根据黑顺片原料的生物碱含量配制加酸量的方法为：若黑顺片原料的生物碱含量为0.010％～0.013％，黑顺片原料的加酸体积比为0.98～1.02：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.014％～0.016％，黑顺片原料的加酸体积比为1.03～1.07：100；若黑顺片原料的生物碱含量为0.017％～0.020％，黑顺片原料的加酸体积比为1.08～1.12：100。
3.根据权利要求1所述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其特征在于，所述生物碱包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱，苯甲酰新乌头原碱，其中，苯甲酰乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱，苯甲酰新乌头原碱为单酯型乌头碱，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱为双酯型乌头碱。
4.根据权利要求3所述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其特征在于，检测黑顺片原料样品的生物碱含量的方法为：
取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷混合溶液，制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得原料对照品溶液；
取黑顺片原料样品，粉碎成粉，加氨试液，加入异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，超声处理，用异丙醇-乙酸乙酯混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤；量取滤液，于40℃以下减压回收溶剂至干，在残渣加入异丙醇-二氯甲烷混合溶液溶解，过滤，取续滤液，即得原料供试品溶液；
分别吸取原料对照品溶液与原料供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，得到黑顺片原料样品的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱含量。
5.根据权利要求3所述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其特征在于，检测黑顺片原料样品的色谱指纹图谱的方法为：
取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷混合溶液，制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的混合溶液，即得原料对照品溶液；
取黑顺片原料样品，加盐酸溶液浸渍，补加水，煮沸提取，在药渣加盐酸溶液煮沸提取，合并两次煎煮液并加水稀释，搅匀，过滤，取续滤液，即得供试品提取溶液；
分别吸取原料对照品溶液与供试品提取溶液各20μl，注入液相色谱仪测定，得到黑顺片原料样品的色谱指纹图谱。
6.根据权利要求3所述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法，其特征在于，检测黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱的方法为：
取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，加异丙醇-二氯甲烷混合溶液，制成每1ml各含10μg苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及每1ml各含5μg乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的混合溶液，即得成品参照溶液；
取黑顺片提取液样品，加入已平衡的Polyclean-X-HLB 60mg/3ml固相萃取柱中，抽干柱子，先用水冲洗，再用甲醇冲洗，收集甲醇液，摇匀，即得成品供试品溶液；
分别吸取成品参照溶液与成品供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪检测，得到黑顺片提取液样品的生物碱含量以及色谱指纹图谱。
7.一种黑顺片提取液，其特征在于，其是采用如权利要求1至6中任一项所述的黑顺片自动化提取过程中实时放行方法得到。
8.根据权利要求7所述的黑顺片提取液，其特征在于，所述黑顺片提取液中单酯性乌头碱含量为1.5-4.5μg/ml。
9.一种参附注射液，其特征在于，其包括如权利要求7所述的黑顺片提取液。
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