CN115372497A - 一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药检测技术领域，具体是一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，包括：制备混合对照品溶液；制备供试品溶液；分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，外标法计算含量，即得，本发明建立了HPLC法同时测定小活络丸中6种生物碱类成分的含量，方法简便、专属性强，且同时对单酯型和双酯型生物碱进行控制，更有利于对乌头属药味的质量控制，保证了临床用药的安全性与有效性，为产品的质量控制和质量评价提供参考。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体是一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法。
背景技术
小活络丸为传统中成药，原名活络丹，又称小活络丹。1977年版《中国药典》修改为“小活络丸”，以后历版药典均以“小活络丸”收载。小活络丸由胆南星、制川乌、制草乌、地龙、乳香(制)、没药(制)六味中药组成，临床常用于风寒湿邪闭阻、痰瘀阻络所致的痹病，症见肢体关节疼痛，或冷痛，或刺痛，或疼痛夜甚、关节屈伸不利、麻木拘挛等。方中制川乌、制草乌温经散寒、祛风除湿，通痹止痛，为君药；胆南星燥湿化痰，祛经络中之风痰及湿邪，并能止痛，为本方臣药；乳香、没药行气活血，以化络中之淤血，并能止痛，为佐药；地龙通经活络，引导诸药直达病所，为使药；诸药合用，共奏祛风散寒，化痰除湿，活血止痛之功效。
方中制川乌、制草乌为毛茛科乌头类中药材，其中所含的二萜类双酯型生物碱(MA、HA、AC)有大毒，主要是对神经和心血管系统造成严重伤害，乌头属植物作为临床用药时，常因炮制或用药不当引起中毒甚至死亡。此类药材经过炮制加工后，可水解为相应的二萜类单酯型生物碱(BMA、BAC、BHA)，活性存在，毒性降低，治疗指数提高，常作为主要的药效成分应用于临床。要想降低原料质量风险、保证疗效以及防止低限投料等都需要通过成品的含量控制才能实现。目前尚未有采用HPLC法同时测定小活络丸中苯甲酰新乌头原碱(BMA)、苯甲酰乌头原碱(BAC)、苯甲酰次乌头原碱(BHA)、新乌头碱(MA)、次乌头碱(HA)和乌头碱(AC)含量的方法，因此，建立小活络丸中二萜类生物碱含量的测定方法，并控制其范围，对保证临床疗效和用药安全具有重要意义。
《中国药典》2020年版一部小活络丸质量标准中仅收载有乌头碱的TLC限量检查项，难以全面控制方中毒性药味的质量，且对乌头碱限量的控制限度较高，有可能引起中毒的风险。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，包括以下步骤：
A.制备混合对照品溶液；
B.制备供试品溶液：取小活络丸适量，剪碎，取3g，称定，置具塞锥形瓶中，加入0.2mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.2mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心20分钟，量取续滤液15ml，置于处理好的固相萃取柱上，依次以0.05mol/L盐酸溶液、乙腈各10ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继续用体积比为90:10的乙腈-浓氨溶液5ml洗脱，洗脱液收集于5ml量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
C.分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，外标法计算含量，即得；
优选的，所述混合对照品溶液的制备方法为：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品与乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含300μg、100μg、 100μg、300ug的混合溶液，作为对照品贮备液，量取对照品贮备液5ml，置50ml量瓶中，加体积比为90:10的乙腈-浓氨溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
优选的，所述步骤B中的超声处理：功率400W,频率40kHz，水温40℃以下。
优选的，所述步骤B中离心转速为每分钟6000转。
优选的，所述步骤B中固相萃取柱为以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂的固相萃取柱，500mg，6ml，用前依次用乙腈、水各 6ml洗脱。
优选的，色谱条件为：
色谱柱：PICKERING C18柱4.6×250mm，5μm
流动相A：甲醇，为流动相B：乙腈，流动相C：0.1％磷酸
梯度洗脱
柱温：30℃
流速：1ml/min
检测波长：232nm
进样量：15μl。
优选的，所述梯度洗脱程序如下：
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的HPLC法具有高效、灵敏、操作简便、准确性高等优点，本发明建立了HPLC法同时测定小活络丸中6种生物碱类成分的含量，方法简便、专属性强，且同时对单酯型和双酯型生物碱进行控制，更有利于对乌头属药味的质量控制，保证了临床用药的安全性与有效性，为产品的质量控制和质量评价提供参考。
附图说明
图1为混合而对照品溶液的色谱图，其中：1-苯甲酰新乌头原碱； 2-苯甲酰乌头原碱；3-苯甲酰次乌头原碱；4-新乌头碱；5-次乌头碱； 6-乌头碱；
图2为供试品溶液的色谱图，其中：1-苯甲酰新乌头原碱；2-苯甲酰乌头原碱；3-苯甲酰次乌头原碱；4-新乌头碱；5-次乌头碱；6- 乌头碱；
图3为阴性样品溶液的色谱图。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图，作详细说明如下，但本发明并不限于此。
在本发明的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体特征、结构或者参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本发明的说明书中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体特征、结构或者参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
本发明的目的在于提供了一种同时测定小活络丸中6种生物碱类成分的含量测定方法，本发明采用HPLC法测定苯甲酰新乌头原碱 (BMA)、苯甲酰乌头原碱(BAC)、苯甲酰次乌头原碱(BHA)、新乌头碱(MA)、次乌头碱(HA)和乌头碱(AC)含量。
本发明含量测定方法采用HPLC法，该方法如下：
色谱条件：色谱柱：PICKERING C18柱(4.6×250mm，5μm)；以：以甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，0.1％磷酸为流动相C，梯度洗脱程序见下表；柱温：30℃，流速：1ml/min；检测波长：232nm；进样量：15μl。
流动相梯度洗脱程序
混合对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品与乌头双酯型生物碱对照提取物适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含300μg、100μg、100μg、300ug的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液5ml，置50ml量瓶中，加乙腈-浓氨(90:10)溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取本品适量，剪碎，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.2mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400W,频率40kHz)30分钟(水温40℃以下)，放冷，再称定重量，用0.2mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟6000转)20分钟，精密量取续滤液15ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂的固相萃取柱，500mg，6ml，用前依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以0.05mol/L盐酸溶液、乙腈各10ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液(90:10)5ml洗脱，洗脱液收集于5ml量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，外标法计算含量，即得。
1.仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪(配备四元泵，DAD检测器，Waters e2695)；分析天平：MettlerXPE26(百万分之一)(上海梅特勒仪器有限公司)； Mettler XS105(十万分之一)(上海梅特勒仪器有限公司)；KQ-400KDE 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水仪(美国Millipore 公司)。
1.2试药
对照品(均购自中国食品药品检定研究院)：
乌头双酯型生物碱对照提取物(批号：112029-201601，供含量测定用，含量以新乌头碱31.7％，次乌头碱30.0％，乌头碱31.8％计)
苯甲酰新乌头原碱(批号：111795-201604，含量以94.0％计)
苯甲酰乌头原碱(批号：111794-201705，含量以99.1％计)
苯甲酰次乌头原碱(批号：111796-201906，含量以97.2％计)
5批次小活络丸样品：均购自药店，详细信息见表1。
表1 5批次小活络丸样品信息
试剂：甲醇、乙腈(色谱纯，Merck，Germany)，水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：PICKERING C18柱(4.6×250mm，5μm)；以：以甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，0.1％磷酸为流动相C，梯度洗脱程序见表2；柱温：30℃，流速：1ml/min；检测波长：232nm；进样量： 15μl。
表2流动相梯度洗脱程序
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，外标法计算含量，即得。
2.2溶液的制备
2.2.1混合对照品溶液
取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品与乌头双酯型生物碱对照提取物适量，精密称定，加乙腈制成每 1ml分别含300μg、100μg、100μg、300ug的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液5ml，置50ml量瓶中，加乙腈-浓氨(90:10)溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2供试品溶液的制备
取本品适量，剪碎，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.2mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率 400W,频率40kHz)30分钟(水温40℃以下)，放冷，再称定重量，用0.2mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟 6000转)20分钟，精密量取续滤液15ml，置于处理好的固相萃取柱 (以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂的固相萃取柱，500mg，6ml，用前依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以0.05mol/L盐酸溶液、乙腈各10ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液(90:10)5ml洗脱，洗脱液收集于5ml量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性样品溶液的制备
按小活络丸处方比例与制备工艺，制备缺制川乌与制草乌的阴性样品，按“供试品溶液”项下方法制备阴性样品溶液。
2.3专属性试验
分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样15μl进行分析，记录色谱图，见附图。在样品色谱图中，分别显示与对照品苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱与乌头碱保留时间一致的色谱峰，阴性样品色谱图中无相应的色谱峰，说明除制川乌、制草乌外的其它药味不干扰待测成分的测定，方法专属性良好。
2.4线性关系考察
用乙腈-浓氨试液(90:10)分别配制苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱与乌头碱浓度依次为：272.5675、108.3225、105.183、91.8127、86.889、92.1023μ g/ml的对照品储备液溶液，依次稀释为系列浓度对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件测定，以对照品进样量(ng)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表3，表明各成分在各自线性范围内线性关系良好。另取混合对照品溶液逐级稀释，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，当信噪比(S/N)为3:1时得检出限，当信噪比(S/N)为10:1时得定量限，结果见表 3。
表3各成分线性关系、检出限和定量限
2.5精密度实验
吸取混合对照品溶液15μl按“2.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录各成分峰面积积分值，并计算RSD，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的RSD值分别为0.8％、0.5％、0.3％、0.7％、0.6％和0.5％，结果表明仪器精密度良好。
2.6稳定性实验
精密吸取正文方法制备的批号为210603供试品溶液各15μl，分别在配制后0、2、4、8、12、18、24h按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积积分值，计算RSD，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的RSD值分别为0.5％、0.4％、1.2％、0.8％、0.5％、0.7％，结果表明实验制得的供试品溶液在24h内稳定。
2.7重复性试验
取小活络丸样品(批号：210603)适量，剪碎，分别取1.5、3.0、 4.5g，各取3份，精密称定，按正文方法制备供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进样测定，记录各成分峰面积积分值，计算含量及其 RSD，结果见表4，表明该方法重复性良好。
表4重复性试验结果
2.8回收率试验
取小活络丸样品(批号：210603)适量，剪碎，精密称取9份，每份约1.5g，每三份为一组，分别加入用0.2mol/L盐酸溶液配制的低、中、高三个浓度的对照品溶液25ml，按“2.2.2”项下方法分别制备供试溶液。由于本方法中双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱、乌头碱)为限量成分，制剂中一般含量较低，所以加入对照品的量以限度为依据进行折算。按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表5，表明本方法回收率较好。
表5加样回收率试验结果(n＝9)
2.9样品测定
采用所建立的方法对收集到的5批次小活络丸样品进行6种生物碱成分的含量测定，结果见表6。
表6小活络丸含量测定结果 (μg/g)
综上所述，本发明方法简便、专属性强，且同时对单酯型和双酯型生物碱进行控制，更有利于对乌头属药味的质量控制，保证临床用药的安全性与有效性，可为产品的质量控制和质量评价提供参考。
Claims (7)
1.一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.制备混合对照品溶液；
B.制备供试品溶液：取小活络丸适量，剪碎，取3g，称定，置具塞锥形瓶中，加入0.2mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.2mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心20分钟，量取续滤液15ml，置于处理好的固相萃取柱上，依次以0.05mol/L盐酸溶液、乙腈各10ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继续用体积比为90:10的乙腈-浓氨溶液5ml洗脱，洗脱液收集于5ml量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
C.分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，外标法计算含量，即得。
2.根据权利要求1所述的一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于：所述混合对照品溶液的制备方法为：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品与乌头双酯型生物碱对照提取物，称定，加乙腈制成每1ml分别含300μg、100μg、100μg、300ug的混合溶液，作为对照品贮备液，量取对照品贮备液5ml，置50ml量瓶中，加体积比为90:10的乙腈-浓氨溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
3.根据权利要求1所述的一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于：所述步骤B中的超声处理：功率400W,频率40kHz，水温40℃以下。
4.根据权利要求1所述的一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于：所述步骤B中离心转速为每分钟6000转。
5.根据权利要求1所述的一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于：所述步骤B中固相萃取柱为以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂的固相萃取柱，500mg，6ml，用前依次用乙腈、水各6ml洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于：色谱条件为：
色谱柱：PICKERING C18柱4.6×250mm，5μm
流动相A：甲醇，为流动相B：乙腈，流动相C：0.1％磷酸梯度洗脱
柱温：30℃
流速：1ml/min
检测波长：232nm
进样量：15μl。
7.根据权利要求6所述的一种小活络丸中6种生物碱成分的含量测定方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序如下：
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