CN104849369A - 一种麻附甘药物质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种麻附甘药物质量检测方法，采用薄层色谱法鉴别麻黄、甘草；采用高效液相色谱法鉴别附子并控制双酯型生物碱含量：流动相按时间进行程序梯度洗脱，与对照品混合法进行测定；采用高效液相色谱法，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；采用高效液相色谱法测定麻黄、甘草含量；本发明的检测方法可有效保证该药物在生产和使用过程的质量，从而保证药品疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种麻附甘药物质量检测方法，属药品技术领域。
技术背景
麻附甘药物是一种治疗感冒后咳嗽、咳嗽变异性哮喘药物，由附子6-18份，麻黄1-9份，甘草1-9份为原料制成（简称“麻附甘药物”），对于感冒后咳嗽、咳嗽变异性哮喘的各种症候有很好的疗效。
本发明所述麻附甘药物处方为中医临床应用多年的验方，已有临床应用结果表明，本品对感冒后咳嗽、咳嗽变异性哮喘的疗效确切、长期效果好、未见不良反应，在一定程度上弥补了化药只控制症状、长期效果差等缺陷。
本发明所述麻附甘药物，现有技术没有可用于麻附甘药物质量检测方法，无法在生产和使用中有效保证产品质量，因此，为了保证麻附甘药物质量和临床用药效果，提供一套简便、可靠的质量标准非常重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种麻附甘药物质量检测方法，使药物在生产和使用中可有效的保证产品质量，从而保证药品疗效。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种麻附甘药物的质量检测方法，采用高效液相色谱法鉴别附子，采用薄层色谱法鉴别麻黄、甘草，采用高效液相色谱法控制双酯型生物碱含量，采用高效液相色谱法测定附子、麻黄、甘草含量。
本发明所述的一种麻附甘药物的质量检测方法，其测定步骤为：
（1）用薄层色谱法鉴别麻黄：取检品，称取0.5-5g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点，即确定是含有麻黄的制剂；
（2）用薄层色谱法鉴别甘草：取检品研细，称取0.5-3g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水（15：1：1：2）为展开剂，阴凉处展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂；
（3）用高效液相色谱法鉴别附子：色谱条件及系统适用性试验，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.092%磷酸溶液（21：79）为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000；取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、氨溶液（5→100）、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；取检品研细，称取0.2-2g，置精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（转速为每分钟4000转）30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即确定制剂中含有附子；
（4）采用高效液相色谱法测定双酯型生物碱：色谱条件及系统适用性试验，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃（25：15）为流动相A，以含0.1%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；0～75分钟，流动相B由85%至80%；检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算应不低于8000；取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95；取检品，称取0.5-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液；精密量取对照品溶液、供试品溶液各1ml，混匀，得混合溶液；分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
（5）采用高效液相色谱法测定单酯型生物碱：色谱条件及系统适用性试验，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.092%磷酸溶液（21：79）为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000；取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、氨溶液（5→100）、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液（20：80）的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；取检品研细，称取0.2-2g，置精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心（转速为每分钟4000转）30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
（6）采用高效液相色谱法测定麻黄生物碱：色谱条件与系统适用性试验，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.092%磷酸溶液（1.5：98.5）为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为210nm，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，加流动相制成每1ml各含30μg、15μg的混合溶液作为对照品溶液；取检品，称取0.1-5g，置蒸馏瓶中，加入氯化钠7.5g，加蒸馏水30ml，再加20%氢氧化钠溶液100ml，混匀，蒸馏，用预先盛0.5mol/L盐酸溶液4ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
（7）采用高效液相色谱法测定甘草苷：色谱条件与系统适用性试验，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.5%冰醋酸溶液（18：82）为流动相；检测波长为276nm，理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000；取甘草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得对照品溶液；取检品，称取0.02-2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
至此，完成了本发明，本发明的有益效果是采用了多种方法对麻附甘药物进行全面的质量控制，可保证药物的质量，严格控制了毒性成分的含量，保证有效成分含量达到要求。
为了进一步说明本发明对于麻附甘药物的质量可控性，以下通过本发明质量标准研究过程进一步说明本发明的有益效果。质量标准研究旨在进一步说明本发明的作用，而非本发明的限制。
一、测定样品制备
1 制备麻附甘胶囊剂
取附子20kg，麻黄13.34kg，甘草13.34g，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮3小时，第二次加水6倍量，煎煮2小时，滤过，滤液合并，浓缩成稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量辅料混匀，装入胶囊，得麻附甘药物的胶囊剂。
2 制备不含附子的阴性胶囊剂
取麻黄200g，甘草200g，照制备麻附甘胶囊剂的方法制成不含附子的阴性胶囊剂。
3 制备不含麻黄的阴性胶囊剂
取附子300g，甘草200g，照制备麻附甘胶囊剂的方法制成不含麻黄的阴性胶囊剂。
4 制备不含甘草的阴性胶囊剂
取附子300g，麻黄200g，照制备麻附甘胶囊剂的方法制成不含甘草的阴性胶囊剂。
二、质量标准研究过程
1 鉴别
1.1 附子鉴别
附子中主要有效成分为苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，采用HPLC法替代TLC法对其进行鉴别。供试品色谱中，在与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品色谱相应位置上，有色谱峰响应。方法学研究见附子含量测定项下。
1.2 麻黄鉴别
采用盐酸麻黄碱对照品对本品中蜜麻黄进行薄层鉴别。专属性试验结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同的红色斑点，阴性溶液在相应位置无斑点，表明本法鉴别胶囊中盐酸麻黄碱专属性强，其他原辅料无干扰。溶液稳定性试验结果表明本法鉴别供试品溶液在室温放置8小时仍稳定。不同厂牌薄层板考察试验结果显示，用不同薄层板对本品中盐酸麻黄碱鉴别无影响。
1.3 甘草鉴别
进行了专属性试验，结果供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性溶液在相应位置无斑点，说明本法鉴别炙甘草专属性强，方法可行。进行了溶液稳定性考察，结果表明供试品溶液在室温放置8小时仍能有效鉴别。对不同厂牌薄层板进行考察，结果显示用不同薄层板对本品炙甘草鉴别无影响，表明此法稳定可靠。
2 双酯型生物碱限度
《中国药典》2010年版第二增补本附桂骨痛胶囊项下附子双酯型生物碱含量测定法（以下简称“药典法”）与本发明附子双酯型生物碱含量测定法，用于麻附甘胶囊剂附子双酯型生物碱含量测定的比较。
2.1 “药典法”测定麻附甘胶囊剂双酯型生物碱含量
色谱条件 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃(25：15)为流动相A，以含0.1%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为232nm。
表1 “药典法”梯度洗脱表
| 时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0~38 | 15→26 | 85→74 |
| 38~39 | 26→35 | 74→65 |
| 39~49 | 35 | 65 |
| 49~50 | 35→15 | 65→85 |
对照品溶液制备 取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液。精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 取本品内容物，混匀，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液(30：70)的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
阴性溶液的制备 取阴性制剂同供试品溶液制备法配制阴性溶液。
分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
试验结果显示，阴性溶液在与对照品溶液第一、三色谱峰相应位置附近均有色谱峰，表明阴性对本法测定双酯型生物碱存在干扰。因此“药典法”中采用方法不适用于麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定。
2.2 本发明方法测定麻附甘胶囊剂双酯型生物碱含量
色谱条件 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：四氢呋喃(25：15)为流动相A，以含0.1%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为232nm。
表2 梯度洗脱表
| 时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0~75 | 15→20 | 85→80 |
| 75~77 | 20→35 | 80→65 |
| 77~87 | 35 | 65 |
| 87~89 | 35→15 | 65→85 |
对照品溶液制备 取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液。精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验 精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%磷酸溶液（30：70）的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。
分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95。
供试品溶液的制备 取本品内容物，混匀，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙腈：浓氨试液（90：10）的混合溶液25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液。精密量取对照品溶液、供试品溶液各1ml，混匀，得混合溶液。
阴性溶液的制备 取阴性制剂同供试品溶液制备方法制备。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表3 系统适用性试验结果（n=5）
| 项目 | 理论板数 | 分离度 | 拖尾因子 | 重复性 |
| 新乌头碱 | >21000 | —— | 0.97～0.99 | 0.24% |
| 次乌头碱 | >25000 | 6 | 0.95～0.98 | 0.63% |
| 乌头碱 | >27000 | 3 | 0.99-1.03 | 0.74% |
| 双酯型生物碱 | —— | —— | —— | 0.45% |
结果表明本法测定双酯型生物碱系统适用性良好。
表4 固相萃取柱系统适用性试验结果
| 项目 | 过柱前面积 | 过柱后面积 | 比值 |
| 新乌头碱 | 312362.6 | 310633.5 | 0.994 |
| 次乌头碱 | 328493.0 | 327140.75 | 0.996 |
| 乌头碱 | 301359.0 | 300054.25 | 0.996 |
固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种双酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中双酯型生物碱的测定。
专属性试验结果显示供试品溶液在与次乌头碱色谱峰相应位置处有色谱峰，阴性溶液在与新乌头碱、次乌头碱、乌头碱色谱峰相应位置均无色谱峰，表明本法测定阴性无干扰，专属性强。
本品中双酯含量较低（0.0012%），且中药中各种成分较多很难彻底排除各类微量成分对结果的干扰，在测定中稍有色谱峰即可对测定产生影响，致使图谱无法达到高效液相色谱法试验要求，故在供试品溶液中加入定量双酯型生物碱对照品，利于方法学研究试验中各项指标的控制，亦可得到较为准确的结果。
试验结果显示采用供试品与对照品混合法测得双酯型生物碱与直接测得结果相近，三种双酯型生物碱与相邻其他峰均可有效分离，表明可采用本法对本品中双酯型生物碱进行测定。
与“药典法”比较，色谱峰峰形明显改善，拖尾因子更小，各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附甘药物双酯型生物碱的含量测定。
2.3 本发明双酯型生物碱含量测定方法学验证线性试验
取每1ml分别含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各20μg的混合对照品溶液，作为对照品线性贮备液。分别制备不同浓度线性溶液。分别精密各吸取线性溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表5 新乌头碱线性试验结果
| 新乌头碱(μg/ml) | 0.9877 | 1.9754 | 3.9508 | 9.8769 | 19.7538 |
| 峰面积 | 14637 | 29982 | 62607 | 160145 | 325364 |
以新乌头碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=165787x-2616.6，r=1.0000。结果表明本法测定新乌头碱进样量在0.01～0.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表6 次乌头碱线性试验结果
| 次乌头碱(μg/ml) | 1.1058 | 2.2116 | 4.4231 | 11.0578 | 22.1157 |
| 峰面积 | 15191 | 30873 | 65154 | 168223 | 343857 |
以次乌头碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=15674x-3598.6，r=0.9999。结果表明本法测定次乌头碱进样量在0.01～0.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表7 乌头碱线性试验结果
| 乌头碱(μg/ml) | 1.0621 | 2.1242 | 4.2484 | 10.6210 | 21.2420 |
| 峰面积 | 13553 | 27602 | 59771 | 153193 | 316987 |
以乌头碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=15057x-4122.7，r=0.9999。结果表明本法测定乌头碱进样量在0.01～0.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 本发明双酯型生物碱含量测定方法学验证检测限试验
取双酯型生物碱对照品溶液稀释进样，测得S/N为2.5：1，双酯型生物碱检测限分别为：新乌头碱0.49ng、次乌头碱0.55ng、乌头碱0.53ng。
2.5 本发明双酯型生物碱含量测定方法学验证溶液稳定性试验
取供试品溶液室温放置，分别于第0、10、20小时吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见下表。
表8 溶液稳定性试验结果
| 项目 | 0h | 10h | 20h | 平均 | RSD |
| 新乌头碱 | 158827 | 156839 | 157442 | 157702.7 | 0.65% |
| 次乌头碱 | 198547 | 198123 | 197536 | 198068.7 | 0.26% |
| 乌头碱 | 155464 | 155013 | 154693 | 155056.7 | 0.25% |
| 双酯型生物碱 | 512838 | 509985 | 509691 | 510828 | 0.34% |
结果显示供试品溶液在室温放置20小时内稳定性良好。
2.6 本发明双酯型生物碱含量测定方法学验证色谱柱耐用性试验
采用不同厂牌的色谱柱进行测定，结果见下表。
表9 不同色谱柱耐用性试验
结果表明本法测定双酯型生物碱含量对不同厂牌色谱柱耐用性良好。
3 含量测定
3.1 附子含量
《中国药典》2010年版第二增补本附桂骨痛胶囊项下附子单酯型生物碱含量测定法（以下简称“药典法”）与本发明附子单酯型生物碱含量测定法，用于麻附甘胶囊剂附子单酯型生物碱含量测定的比较。
1）“药典法”测定麻附甘胶囊剂单酯型生物碱含量
色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂（以下简称“C18”）；以乙腈：0.1%磷酸溶液(22：78)为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于10000。
对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml各含50μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取检品，称取0.5g，置25ml量瓶中，加0.5mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，离心(转速为每分钟4000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附为填充剂的固相萃取柱，150mg，6ml，用前依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml、氨水溶液(5→100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液10ml洗脱，洗脱液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液(20：80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液，即得。
阴性溶液的制备：取阴性制剂同法操作。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表10 “药典法”系统适用性与专属性试验结果
结果表明本法可对三种单酯型生物碱进行有效分离，各峰半峰宽较大，不利于各峰分离。供试品图谱中第一单酯峰与相邻峰分离较差，显示阴性存在干扰。对照品溶液配制时三种生物碱浓度均一致，与麻附甘制剂中三种单酯型生物含量有一定差异，不利于含量测定的准确性。因此“药典法”中采用C18色谱柱、流动相组成及比例、对照品配制浓度等均不适用于麻附甘药物单酯型生物碱的含量测定。
2）本发明方法测定麻附甘胶囊剂单酯型生物碱含量
色谱条件与系统适用性试验 以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.092%磷酸溶液(21：79)为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验 精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml、氨溶液(5→100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液(20：80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95。
供试品溶液的制备 取本品10粒，倾出内容物，混匀，精密称取0.5000g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟4000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得。
阴性溶液的制备 取阴性制剂同供试品溶液制备方法制备。
测定法 分别精密吸取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表11 固相萃取柱系统适用性试验结果
| 项目 | 过柱前面积 | 过柱后面积 | 比值 |
| 苯甲酰新乌头原碱 | 304247.7 | 297951.1 | 0.979 |
| 苯甲酰乌头原碱 | 50207.9 | 49585 | 0.988 |
| 苯甲酰次乌头原碱 | 61488.5 | 60221.1 | 0.979 |
固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种单酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中单酯型生物碱的测定。
表12 系统适用性与专属性试验结果
专属性试验结果显示供试品溶液在与对照品溶液各色谱峰保留时间内均有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内无色谱峰，供试品溶液中其他色谱峰与各目标峰分离良好。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。
与“药典法”比较，以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱拖尾因子明显优于C18柱，色谱峰峰形明显改善，各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附甘药物单酯型生物碱的含量测定。
3）本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证线性试验
取每1ml分别含苯甲酰新乌头原碱50μg、苯甲酰乌头原碱10μg、苯甲酰次乌头原碱10μg的混合对照品溶液，作为对照品线性贮备液。制备不同浓度线性溶液。
分别精密各吸取线性溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表13 苯甲酰新乌头原碱线性试验结果
| 苯甲酰新乌头原碱(μg/ml) | 0.9863 | 1.9726 | 5.9178 | 9.8630 | 19.7259 | 49.3148 |
| 峰面积 | 26743 | 53424 | 169096 | 282405 | 564705 | 1409527 |
| 响应因子 | 27115 | 27083 | 28574 | 28633 | 28628 | 28582 |
以次苯甲酰新乌头原碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=28618x-1032.0，r=1.0000。结果表明本法测定苯甲酰新乌头原碱进样量在0.01～0.5μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表14 苯甲酰乌头原碱线性试验结果
| 苯甲酰乌头原碱(μg/ml) | 0.1888 | 0.3777 | 1.1330 | 1.8883 | 3.7766 | 9.4416 |
| 峰面积 | 4214 | 8880 | 27309 | 45998 | 92736 | 232163 |
| 响应因子 | 22316 | 23513 | 24104 | 24359 | 24555 | 24589 |
以次苯甲酰乌头原碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=24643x-475.45，r=1.0000。结果表明本法测定苯甲酰乌头原碱进样量在0.002～0.1μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表15 苯甲酰次乌头原碱线性试验结果
| 苯甲酰次乌头原碱(μg/ml) | 0.1969 | 0.3939 | 1.1816 | 1.9694 | 3.9387 | 9.8468 |
| 峰面积 | 5878 | 10748 | 32773 | 53533 | 107572 | 261057 |
| 响应因子 | 29847 | 27288 | 27736 | 27183 | 27312 | 26512 |
以次苯甲酰次乌头原碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=26465x+1283.7，r=0.9999。结果表明本法测定苯甲酰次乌头原碱进样量在0.002～0.1μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
4）本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证准确度试验
称取本品0.25g（含苯甲酰新乌头原碱353.51μg/g），共6份，精密加入每1ml含苯甲酰新乌头原碱49.3148μg的对照品贮备液1ml，混匀，室温减压回收溶剂至干，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟，时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟4000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附为填充剂的固相萃取柱，150mg，6ml，用前依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml、氨水溶液(5→100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液10ml洗脱，洗脱液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液(20：80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为准确度溶液。
分别精密吸取对照品溶液与准确度溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表16 苯甲酰新乌头原碱准确度试验结果
结果表明本法测定苯甲酰新乌头原碱准确度良好。
5）本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证精密度试验
照上法制备6份供试品溶液，测定。
表17 重复性试验结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD |
| 单酯型生物碱（μg/g） | 440.26 | 449.15 | 448.87 | 454.36 | 444.90 | 446.81 | 447.39 | 1.06% |
表9 不同日期精密度试验结果
试验结果表明本法测定单酯型生物碱不同日期间精密度良好。
表18 不同分析人员精密度试验结果
试验结果表明本法测定单酯型生物碱不同分析人员间精密度良好。
表19 不同设备精密度试验结果
试验结果表明本法测定单酯型生物碱不同设备间精密度良好。
6）本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证溶液稳定性试验
取供试品溶液室温放置，于第0h、8h、20h分别精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如下。
表20 供试品溶液稳定性试验结果
| 时间 | 0h | 8h | 20h | RSD |
| 单酯型生物碱峰面积 | 547081 | 546677 | 535693 | 1.19% |
结果显示供试品溶液室温放置20小时，三种单酯型生物碱峰面积、理论板数、分离度、拖尾因子均无明显变化，表明本法测定时供试品溶液在室温放置20小时内仍稳定，满足本法测定要求。
3.2 麻黄含量
《中国药典》2010年版一部麻黄含量测定方法（以下简称“药典法”），与本发明麻黄测定方法比较。
1）“药典法”测定麻附甘胶囊剂麻黄含量
色谱条件与系统适用性试验 以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.092%磷酸溶液(1.5：98.5)为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为210nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml各含30μg、15μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 称取检品0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44％磷酸溶液50ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用1.44％磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性溶液制备 取阴性制剂同法制备溶液。
测定法 分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果显示供试品溶液在与对照品溶液色谱峰保留时间内有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内有色谱峰，表明本法测定阴性存在干扰，“药典法”无法对麻附甘制剂进行测定。
2）本发明方法测定麻附甘胶囊剂麻黄含量
色谱条件与系统适用性试验 以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.092%磷酸溶液(1.5：98.5)为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为210nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml各含30μg、15μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取检品，称取0.5g，置蒸馏瓶中，加入氯化钠7.5g，加蒸馏水30ml，再加20%氢氧化钠溶液100ml，混匀，蒸馏，用预先盛0.5mol/L盐酸溶液4ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得
阴性溶液制备 取阴性制剂同法制备溶液。
测定法 分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
试验结果显示供试品溶液在与对照品溶液色谱峰保留时间内有相对应的色谱峰，阴性在相应保留时间内无色谱峰。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。
表21 麻黄测定系统适用性。
结果显示本法测定麻黄碱、伪麻黄碱色谱峰重复性、理论板数、分离度、拖尾因子均符合《中国药典》2010年版一部高效液相色谱法中相应规定，表明本法测定系统适用性良好。
与“药典法”比较，本发明测定方法中各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附甘药物麻黄的含量测定。
3）本发明麻黄含量测定方法学验证线性试验
取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品制备不同浓度的线性溶液。分别精密各吸取线性溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表22 盐酸麻黄碱线性试验结果
| 浓度(μg/ml) | 7.45 | 12.136 | 15.17 | 30.34 | 60.68 | 121.36 |
| 峰面积 | 249465 | 381355 | 493777 | 989426 | 1923765 | 3747043 |
以对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=30760x+30470，r=0.9999。结果表明本法测定盐酸麻黄碱进样量在0.07～1.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表23 盐酸伪麻黄碱线性试验结果
| 浓度(μg/ml) | 3.805 | 6.088 | 7.61 | 15.22 | 30.44 | 60.88 |
| 峰面积 | 123296 | 188062 | 243501 | 487176 | 938928 | 1840109 |
以甘草苷对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=30085x+14882，r=0.9999。结果表明本法测定盐酸伪麻黄碱进样量在0.04～0.6μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
4）本发明麻黄含量测定方法学验证准确度试验
取检品，称取0.5g（含盐酸麻黄碱1.251mg/g），精密称定6份，置蒸馏瓶中，精密加入每1ml含盐酸麻黄碱0.5mg的对照品贮备液1ml，加入氯化钠7.5g，加蒸馏水30ml，再加20%氢氧化钠溶液100ml，混匀，蒸馏，用预先盛0.5mol/L盐酸溶液4ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得准确度溶液。
分别精密吸取对照品溶液与准确度溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表24 准确度试验结果
结果表明本法测定盐酸麻黄碱准确度良好。
5）本发明甘草含量测定方法学验证溶液稳定性试验
取供试品溶液室温放置，于第0h、5h、10h分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如下。
表25 供试品溶液稳定性试验结果
| 时间 | 0h | 5h | 10h | RSD |
| 麻黄碱 | 1016626.625 | 1011678.625 | 1015989.75 | 0.27% |
| 伪麻黄碱 | 443252.813 | 437609.313 | 444760.094 | 0.85% |
结果显示供试品溶液室温放置10小时，麻黄碱、伪麻黄碱峰面积无明显变化，表明本法测定时供试品溶液在室温放置10小时内仍稳定，满足本法测定要求。
6）本发明麻黄含量测定方法学验证色谱柱耐用性试验
表26 采用不同厂牌、批号的色谱柱测定麻黄含量。结果如下。
结果表明本法测定麻黄生物碱色谱柱耐用性良好。
7）本发明麻黄含量测定方法学验证重复性试验
照上法制备6份供试品溶液，测定。
表27 重复性试验结果
结果表明本法测定麻黄生物碱含量重复性良好。
8）本发明麻黄含量测定方法学验证中间精密度试验
取样品连续3日测定麻黄生物碱含量。结果如下：
表28 不同日期精密度试验结果
结果表明本法测定不同日期精密度良好。
取样品分别由试验人员A、B在同一台高效液相色谱仪上测定麻黄生物碱含量。得结果如下：
表29 不同人员精密度试验结果
结果表明本法测定不同人员精密度良好。
取样品分别由同一试验人员在A、B两台高效液相色谱仪上测定麻黄生物碱含量。得结果如下：
表30 不同仪器精密度试验结果
结果表明本法测定不同仪器精密度良好。
3.3 甘草含量
《中国药典》2005年版一部甘草中甘草苷含量测定方法（以下简称“药典法”），与本发明甘草测定方法比较。
1）“药典法”测定麻附甘胶囊剂甘草含量
色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.5%冰醋酸（1：4）为流动相；检测波长为276nm。理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 精密称取甘草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，精密称取0.1001g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率200W，频率25kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性溶液制备 取阴性制剂同法制备溶液。
测定法 精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果显示供试品溶液在与对照品溶液色谱峰保留时间内有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内有色谱峰，表明本法测定阴性存在干扰，“药典法”无法对麻附甘制剂进行测定。
2）本发明方法测定麻附甘胶囊剂甘草含量
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.5%冰醋酸（18：82）为流动相；检测波长为276nm。
对照品溶液的制备 精密称取甘草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，精密称取0.1002g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率200W，频率25kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性溶液制备 取阴性制剂同法制备溶液。
测定法 精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
试验结果显示供试品溶液在与对照品溶液色谱峰保留时间内有相对应的色谱峰，阴性在相应保留时间内无色谱峰。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。
表31 甘草测定系统适用性。
| 项目 | 理论板数 | 重复性（n=5） | 分离度 | 拖尾因子 |
| 甘草苷对照品 | 8604 | 1.21% | —— | 1.03 |
| 供试品 | 9048 | —— | 1.74 | 1.06 |
结果显示本法测定甘草苷色谱峰重复性、理论板数、分离度、拖尾因子均符合《中国药典》2010年版一部高效液相色谱法中相应规定，表明本法测定系统适用性良好。
与“药典法”比较，本发明测定方法中各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附甘药物甘草的含量测定。
3）本发明甘草含量测定方法学验证线性试验
取每1ml含甘草苷0.4mg的对照品溶液，作为对照品线性贮备液。制备不同浓度的线性溶液。
分别精密各吸取线性溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表32 甘草苷线性试验结果
| 浓度(μg/ml) | 2.08 | 4.16 | 8.32 | 16.65 | 33.30 |
| 峰面积 | 57219 | 110819 | 215181 | 442715 | 901064 |
| 响应因子 | 27495 | 26625 | 25850 | 26592 | 27061 |
以甘草苷对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=27097x-4222.8，r=0.9999。结果表明本法测定甘草苷进样量在0.02～0.33μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
4）本发明甘草含量测定方法学验证准确度试验
称取本品0.05g（含甘草苷4.2512mg/g），共6份，置具塞锥形瓶中，精密加入每1ml含甘草苷0.2mg的对照品贮备液1ml，室温挥干，精密加入70%乙醇溶液50ml，称定重量，超声处理（功率200W，频率25kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得准确度溶液。
分别精密吸取对照品溶液与准确度溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表33 准确度试验结果
结果表明本法测定甘草苷准确度良好。
5）本发明甘草含量测定方法学验证溶液稳定性试验
取供试品溶液室温放置，于第0h、5h、10h分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如下。
表34 供试品溶液稳定性试验结果
| 时间 | 0h | 5h | 10h | RSD |
| 甘草苷峰面积 | 212010 | 212330 | 209745 | 0.67% |
结果显示供试品溶液室温放置10小时，甘草苷峰面积无明显变化，表明本法测定时供试品溶液在室温放置10小时内仍稳定，满足本法测定要求。
6）本发明甘草含量测定方法学验证色谱柱耐用性试验
表35 采用不同厂牌、批号的色谱柱测定甘草苷含量。结果如下。
结果表明本法测定甘草苷色谱柱耐用性良好。
7）本发明甘草含量测定方法学验证重复性试验
照上法制备6份供试品溶液，测定。
表36 重复性试验结果
结果表明本法测定甘草苷含量重复性良好。
8）本发明甘草含量测定方法学验证中间精密度试验
取样品连续3日测定甘草苷含量。结果如下：
表37 不同日期精密度试验结果
结果表明本法测定不同日期精密度良好。
取样品分别由试验人员A、B在同一台高效液相色谱仪上测定甘草苷含量。得结果如下：
表38 不同人员精密度试验结果
结果表明本法测定不同人员精密度良好。
取样品分别由同一试验人员在A、B两台高效液相色谱仪上测定甘草苷含量。得结果如下：
表39 不同仪器精密度试验结果
结果表明本法测定不同仪器精密度良好。
具体实施方式
实施例1：麻附甘颗粒剂按本发明质量标准检测方法测定
1）制备颗粒剂：
取附子6kg，麻黄2kg，甘草2kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩至稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量糊精混匀，制成颗粒，干燥，整粒，得麻附甘药物的颗粒剂。
2）检验
取样品，按照本发明所述质量标准检测方法进行检验，结果见表40，结果表明本发明的方法能够有效的控制麻附甘颗粒的质量：
表40 检验结果
实施例2：麻附甘的颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液剂、丸剂按本发明质量标准检测方法测定
1）制备样品：
按不同处方配比、提取方法、操作工艺制备麻附甘药物的颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液剂、丸剂。
2）检验
取样品，按照本发明所述质量标准检测方法进行检验，结果均符合本发明所述质量标准检测方法要求，表明本发明的方法能够有效的控制麻附甘颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液剂、丸剂的质量。
Claims (1)
1.一种麻附甘药物质量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）用薄层色谱法鉴别麻黄：取检品，称取0.5-5g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；
另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液=20：5：0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点，即确定是含有麻黄的制剂；
（2）用薄层色谱法鉴别甘草：取检品研细，称取0.5-3g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15：1：1：2为展开剂，阴凉处展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂；
（3）用高效液相色谱法鉴别附子：色谱条件及系统适用性试验，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.092%磷酸溶液=21：79为流动相，0.092%磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为232nm；理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000；取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；取检品研细，称取0.2-2g，置精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，转速为每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品色谱中呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即确定制剂中含有附子；
（4）采用高效液相色谱法测定双酯型生物碱：色谱条件及系统适用性试验，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃=25：15为流动相A，以含0.1%磷酸的0.03mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；0～75分钟，流动相B由85%至80%；检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算应不低于8000；取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取上述三种对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱上，固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以0.1mol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1%磷酸溶液=30：70的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述固相萃取柱系统适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95；取检品，称取0.5-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙腈-浓氨试液=90：10的混合溶液25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，得供试品溶液；精密量取对照品溶液、供试品溶液各1ml，混匀，得混合溶液；分别精密吸取对照品溶液与混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
（5）采用高效液相色谱法测定单酯型生物碱：色谱条件及系统适用性试验，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.092%磷酸溶液=21：79为流动相，0.092%磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为232nm；
理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于6000；取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱上，固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；取检品研细，称取0.2-2g，置精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，转速为每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
（6）采用高效液相色谱法测定麻黄生物碱：色谱条件与系统适用性试验，色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以甲醇：0.092%磷酸溶液=1.5：98.5为流动相，0.092%磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为210nm，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000；取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，加流动相制成每1ml各含30μg、15μg的混合溶液作为对照品溶液；取检品，称取0.1-5g，置蒸馏瓶中，加入氯化钠7.5g，加蒸馏水30ml，再加20%氢氧化钠溶液100ml，混匀，蒸馏，用预先盛0.5mol/L盐酸溶液4ml的100ml量瓶收集蒸馏液近95ml，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
（7）采用高效液相色谱法测定甘草苷：色谱条件与系统适用性试验，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.5%冰醋酸溶液=18：82为流动相；检测波长为276nm，理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000；取甘草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得对照品溶液；取检品，称取0.02-2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
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Address after: 250014 81 thousand Buddha Shandong Road, Lixia District, Ji'nan, Shandong Patentee after: Shandong Zhonghong Kang Pharmaceutical Technology Development Co.,Ltd. Address before: 250014 No. 4, West building, Shandong Academy of Sciences, 19 Shandong Road, Lixia Road, Lixia District, Shandong Patentee before: JINAN KANGZHONG PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
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Effective date of registration: 20221227 Address after: No. 16, Dixin 6th Road, Shandong Wudi Economic Development Zone, Binzhou City, Shandong Province, 251900 Patentee after: SHANDONG TIANSHUN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 250014 No. 81, Shandong Road, thousand Buddha, Lixia District, Ji'nan, Shandong Patentee before: Shandong Zhonghong Kang Pharmaceutical Technology Development Co.,Ltd. |
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