TWI828229B - 麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜（１ｈ-ｎｍｒ）定量方法 - Google Patents
麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜（１ｈ-ｎｍｒ）定量方法 Download PDFInfo
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Abstract
一種麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，係利用光譜與質譜方法鑑定了二乙醚產生的環化衍生物，並選擇了苯作為更好的替代提取溶劑，六種主要麻黃生物鹼的位置通過二維核磁共振光譜方法分析，首次得到了確認，透過高特異性的核磁共振氫譜(1H-NMR)方法並對其進行了修改，用於量化麻黃生物鹼衍生物的含量。
Description
本發明係有關一種定量方法，特別指涉及利用二維核磁共振光譜方法分析確認六種主要麻黃生物鹼並對麻黃屬植物中的麻黃生物鹼進行量化之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法。
按中草藥藥材的品質管制除了對於藥材的基原判斷鑑定、具藥效成分的分析或主要成分含量分析外，亦對有毒物質的檢測及掺假、誤用、掺入禁藥或製程污染等品質管制的檢測。所運用的分離技術與儀器包括TLC、GC、HPLC、CE、GC/MS/MS、LC/MS/MS、LC/NMR、UPLC串聯NMR、MS等，藉由層析分離後再以各式偵檢系統偵測，達到定性與定量的目的，進而完成中草藥的品質管制，或完成中草藥的指紋圖譜與基原判斷。
傳統以薄層層析、高效能液相層析的分析方法在遭遇分子本身缺乏發色團或相似化合物時，常需要複雜的前處理方法或衍生化反應來改善偵測靈敏度，使得其在實用性上大打折扣，此乃為本領域技術人員及消費者極欲突破之處。
為解決上述之現有技術不足之處，本發明主要目的，在於提供一種麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，利
用質子核磁共振質譜儀(1H-NMR)方法，快速且專一的檢測麻黃屬植物中之麻黃生物鹼的種類與含量。
本發明次要目的，在於提供一種麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，利用核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得六種主要麻黃生物鹼(麻黃鹼、甲基麻黃鹼、去甲麻黃鹼、擬麻黃鹼、甲基擬麻黃鹼、去甲擬麻黃鹼)位置外，更測得3種少量的環化麻黃生物鹼(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine、(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine、(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine。
本發明又一目的，在於提供一種麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，於溶液萃取優化過程中透過二乙醚(diethyl ether)萃取可誘導麻黃生物鹼之環化，苯(benzene)萃取可以獲得雜質量最少的萃取物。
本發明所欲解決之問題，按中草藥藥材的品質管制除了對於藥材的基原判斷鑑定、具藥效成分的分析或主要成分含量分析外，亦對有毒物質的檢測及掺假、誤用、掺入禁藥或製程污染等品質管制的檢測。所運用的分離技術與儀器包括TLC、GC、HPLC、CE、GC/MS/MS、LC/MS/MS、LC/NMR、UPLC串聯NMR、MS等，藉由層析分離後再以各式偵檢系統偵測，達到定性與定量的目的，進而完成中草藥的品質管制，或完成中草藥的指紋圖譜與基原判斷；然傳統以薄層層析、高效能液相層析的分析方法在遭遇分子本身缺乏發色團或相似化合物時，常需要複雜的前處理方法或衍生化反應來改善偵測靈敏度，使得其在實用性上大打折扣。
解決問題之技術手段，為達上述之目的，本發明提供一種麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其特徵是，該步驟，包括：(A)、麻黃樣品製備及溶液萃取優化S1：係將麻黃粉末樣品(約2克)浸入50毫升0.5%的鹽酸水溶液中，在60℃下用超音波震盪萃取；30分鐘後，以抽氣過濾方式將液渣分離；每個樣品提取四次並合併濾液，用碳酸鈉將合併溶液的pH值調整到10.0，然後在每分鐘3000轉速下離心10分鐘，得到上清溶液；將上清溶液加入氯化鈉直至飽和，並在每分鐘3000轉速下再離心10分鐘；得到的上清溶液用苯分配五次，合併的有機溶液萃取在真空中濃縮，透過溶液萃取優化即得麻黃萃取物；(B)、麻黃生物鹼的核磁共振氫譜定量(qNMR)分析S2：係將麻黃萃取物和內標”蒽”溶於0.6毫升的氘代氯仿中，用布魯克AV-400核磁共振儀進行分析，參數如下；100次掃描以0.187赫茲/點記錄；光譜寬度，3600赫茲；使用90脈衝以獲得最大的靈敏度；弛緩延遲，20秒；收集時間，2.56秒；對於定量分析，使用峰面積，並手動選擇每個峰的積分起點和終點。
其中，本發明該溶液萃取優化過程係採用二乙醚(diethyl ether)萃取可誘導麻黃生物鹼之環化。
其中，本發明該溶液萃取優化過程係採用苯(benzene)萃取可以獲得雜質量最少的萃取物。
其中，本發明該核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得六種主要麻黃生物鹼(麻黃鹼、甲基麻黃鹼、去甲麻黃鹼、擬麻黃鹼、甲基擬麻黃鹼、去甲擬麻黃鹼)位置。
其中，本發明該核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得3種少量的環化麻黃生物鹼。
其中，本發明該環化麻黃生物鹼係包含(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine、(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine、(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine。
其中，本發明該生物鹼含量的計算方法如下：
對照先前技術之功效，本發明利用質子核磁共振質譜儀(1H-NMR)方法，專一的檢測麻黃屬植物中之麻黃生物鹼的種類與含量，同時於溶液萃取優化過程中透過二乙醚(diethyl ether)萃取可誘導麻黃生物鹼之環化，苯(benzene)萃取可以獲得雜質量最少的萃取物；進而達成，測得六種主要麻黃生物鹼(麻黃鹼、甲基麻黃鹼、去甲麻黃鹼、擬麻黃鹼、甲基擬麻黃鹼、去甲擬麻黃鹼)位置，更測得3種少量的環化麻黃生物鹼；有效提升其使用快速方便，將可大幅擴大產業之利用性並具新穎及進步性。
S1:麻黃樣品製備及溶液萃取優化
S2:麻黃生物鹼的核磁共振氫諎定量(qNMR)分析
圖1：係為本發明實施例的草麻黃(ES)中麻黃(EI)木賊麻黃(EE)中麻黃生物鹼萃取物的1H-NMR圖譜。
圖2：係為本發明實施例的甲基麻黃鹼(methylephedrine)的1H-NMR圖譜。
圖3：係為本發明實施例的甲基麻黃鹼(methylephedrine)之HSQC/TOCSY(
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)圖譜。
圖4：係為本發明實施例的麻黃鹼(ephedrine)的1H-NMR圖譜。
圖5：係為本發明實施例的麻黃鹼(ephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜。
圖6-A：係為本發明實施例的去甲麻黃鹼(norephedrine)的1H-NMR圖譜。
圖6-B：係為本發明實施例的去甲麻黃鹼(norephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜。
圖7：係為本發明實施例的擬麻黃鹼(pseudoephedrine)的1H-NMR圖譜。
圖8：係為本發明實施例的擬麻黃鹼(pseudoephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜。
圖9：係為本發明實施例的在草麻黃的擴增1H-NMR光譜中，麻黃生物鹼的H1信號。
圖10：係為本發明實施例的草麻黃(ES)、中麻黃(EI)和木賊麻黃(EE)中的麻黃生物鹼及其環化產物。
圖11：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之電噴灑高解析度質譜儀。
圖12：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之1H-NMR圖譜。
圖13：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之特徵碳信號。
圖14：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之HSQC-TOCSY圖譜。
圖15：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之HMBC圖譜。
圖16：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之電噴灑高解析度質譜儀。
圖17：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之1H-NMR圖譜。
圖18：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之特徵碳信號。
圖19：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin之HSQC-TOCSY圖譜。
圖20：係為本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin之HMBC圖譜。
圖21：係為本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之1H-NMR圖譜。
圖22：係為本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之特徵碳信號。
圖23：係為本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之HSQC-TOCSY圖譜。
圖24：係為本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之HMBC圖譜。
圖25：係為本發明流程圖。
茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而於文中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本發明實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係侷限本發明於實際實施上的專利範圍，合先敘明。
請參閱圖25及圖1至圖5及圖6-A、圖6-B及圖7至圖24，係為本發明流程圖及本發明實施例的草麻黃(ES)中麻黃(EI)木賊麻黃(EE)中麻黃生物鹼萃取物的1H-NMR圖譜、本發明實施例的甲基麻黃鹼(methylephedrine)的1H-NMR圖譜、本發明實施例的甲基麻黃鹼(methylephedrine)之HSQC/TOCSY(
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),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜及本發明實施例的擬麻黃鹼(pseudoephedrine)的1H-NMR圖譜、為本發明實施例的擬麻黃鹼(pseudoephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜、本發明實施例的在草麻黃的擴增1H-NMR光譜中，麻黃生物鹼的H1信號、本發明實施例的草麻黃(ES)、中麻黃(EI)和木賊麻黃(EE)中的麻黃生物鹼及其環化產物、本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之電噴灑高解析度質譜儀、本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之1H-NMR圖
譜、本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之特徵碳信號、本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之HSQC-TOCSY圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之HMBC圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之電噴灑高解析度質譜儀、本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之1H-NMR圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之特徵碳信號、本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin之HSQC-TOCSY圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin之HMBC圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之1H-NMR圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之特徵碳信號、本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之HSQC-TOCSY圖譜、本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之HMBC圖譜、麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，本發明之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，於一較佳實施例中，其步驟係包括：麻黃樣品製備及溶液萃取優化S1、麻黃生物鹼的核磁共振氫譜定量(qNMR)分析S2；於本實施例該核磁共振氫譜(1H NMR)的測定是利用布魯克(Bruker,Billerica,MA,USA)AV-400 400MHz NMR核磁共振光譜儀，利用四甲基矽烷為化學位移內標準品，化學位移以ppm表示；該核磁共振氫譜定量(qNMR)的測定與A相同，也是利用布魯克(Bruker,Billerica,MA,USA)AV-400 400MHz NMR核磁共振光譜儀進行分析。
前述之麻黃樣品製備及溶液萃取優化S1：(A)、係將麻黃粉末樣品(約2克)浸入50毫升0.5%的鹽酸水溶液中，在60℃下用超音波震盪萃取。30分鐘後，以抽氣過濾方式將液渣分離。每個樣品提取四次並合併濾液，用碳酸鈉將合併溶液的pH值調整到10.0，然後在每分鐘3000轉速下離心10分鐘，得到上清溶液。將上清溶液加入氯化鈉直至飽和，並在每分鐘3000轉速下再離心10分鐘。得到的上清溶液用苯分配五次，合併的有機溶液萃取在真空中濃縮，透過溶液萃取優化即得麻黃萃取物(如圖25所示)。
前述之麻黃生物鹼的核磁共振氫譜定量(qNMR)分析S2：(B)、係將麻黃萃取物和內標”蒽”溶於0.6毫升的氘代氯仿中，用布魯克AV-400核磁共振儀進行分析，參數如下。100次掃描以0.187赫茲/點記錄；光譜寬度，3600赫茲；使用90脈衝以獲得最大的靈敏度；弛緩延遲，20秒；收集時間，2.56秒。對於定量分析，使用峰面積，並手動選擇每個峰的積分起點和終點(如圖25所示)。
本發明該溶液萃取優化過程係採用二乙醚(diethyl ether)萃取可誘導麻黃生物鹼之環化；而該溶液萃取優化過程係採用苯(benzene)萃取可以獲得雜質量最少的萃取物；本發明該核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得六種主要麻黃生物鹼(麻黃鹼、甲基麻黃鹼、去甲麻黃鹼、擬麻黃鹼、甲基擬麻黃鹼、去甲擬麻黃鹼)位置；該核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得3種少量的環化麻黃生物鹼；該環化麻黃生物鹼係包含(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine、(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine、(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine)；該生物鹼含量的計算方法
如下：
本發明利用光譜與質譜方法鑑定了二乙醚產生的環化衍生物，並選擇了苯作為更好的替代提取溶劑，六種主要麻黃生物鹼的位置通過二維核磁共振光譜方法分析得到了確認，本發明係一種高特異性的1H-NMR方法並對其進行了修改，用於量化麻黃生物衍生物鹼的含量，由於NMR定量分析方法簡單、快速和不破壞待測樣品的優點，只需簡單前處理或不需前處理，再搭配不同氘代溶劑選擇使欲定量之化合物質子訊號峰不重疊，即可同時立即測定數個化合物之含量；本發明係首次利用二維核磁共振光譜方法分析確認六種主要麻黃生物鹼並對麻黃屬植物中的麻黃生物鹼進行量化；以質子核磁共振質譜儀(1H-NMR)方法，可以快速且專一的檢測麻黃屬植物中之麻黃生物鹼的種類與含量，本實施例該環化衍生物的分子式由高解析液相層析電噴灑游離質譜儀(HR-ESI-MS)分析資料確定。麻黃生物鹼及其環化產物的1H-,13C-,HSQC-TOCSY,HMBC NMR分析是在Jeol ECZ600R/S1 600MHz NMR光譜儀上記錄的，探頭為Royal 5mm。
本發明實施例的草麻黃(ES)中麻黃(EI)木賊麻黃(EE)中麻黃生物鹼萃取物的1H-NMR圖譜，係為偵測到常見的麻黃生物鹼，另外還有三個具有特徵性的環化化合物，其質子信號在δ H 5.14、4.99、4.53ppm處觀察到，這些環化產物也可以在草麻黃(ES)中麻黃(EI)木賊麻黃(EE)的提取物中
檢測出來(如圖1所示)；本發明實施例的甲基麻黃鹼(methylephedrine)的1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供甲基麻黃鹼分子結構上的氫資訊(如圖2所示)；本發明實施例的甲基麻黃鹼(methylephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜，係為二維光譜(HMBC、HMQC、TCOSY等)的技術可對甲基麻黃鹼結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖3所示)；本發明實施例的麻黃鹼(ephedrine)的1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供麻黃鹼分子結構上的氫資訊(如圖4所示)；本發明實施例的麻黃鹼(ephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜，係為二維光譜(HMBC、HMQC、TCOSY等)的技術可對麻黃鹼結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖5所示)；本發明實施例的去甲麻黃鹼(norephedrine)的1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供去甲麻黃鹼分子結構上的氫資訊(如圖6-A所示)；本發明實施例的去甲麻黃鹼(norephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜，係為二維光譜(HMBC、HMQC、TCOSY等)的技術可對去甲麻黃鹼結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖6-B所示)；本發明實施例的擬麻黃鹼(pseudoephedrine)的1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供擬麻黃鹼分子結構上的氫資訊(如圖7所示)；本發明實施例的擬麻黃鹼(pseudoephedrine)之HSQC/TOCSY(
),HSQC(.....)and HMBC(
)圖譜，係為二維光譜(HMBC、HMQC、TCOSY等)的技術可對擬麻黃鹼結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖8所示)；本發明實施例的在草麻黃的擴增1H-NMR光譜中，麻黃生物鹼的H1信號，係為一維1H核磁共振光譜可提供麻黃鹼分子結構上的氫資訊(如
圖9所示)；本發明實施例的草麻黃(ES)、中麻黃(EI)和木賊麻黃(EE)中的麻黃生物鹼及其環化產物，係為偵測到常見的麻黃生物鹼，另外還有三個具有特徵性的環化化合物，其質子信號在δ H 5.14、4.99、4.53ppm處觀察到，這些環化產物也可以在草麻黃(ES)中麻黃(EI)木賊麻黃(EE)的提取物中檢測出來(如圖10所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之電噴灑高解析度質譜儀，係提供(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine的高解析質譜分子量與推定分子式，幫助解析樣品分子結構(如圖11所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine分子結構上的氫資訊(如圖12所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之特徵碳信號，係為一維13C核磁共振光譜可提供(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine分子結構上的碳資訊(如圖13所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之HSQC-TOCSY圖譜，係為二維異核HSQC-TOCSY核磁共振光譜技術可對(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖14所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine之HMBC圖譜，係為異核多鍵碳氫關聯性(HMBC)用來建立(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine異核碳氫原子間的關聯性，通常是遠程偶合的碳氫關係(二至三個化學鍵)(如圖15所示)；本發明實施例的
(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之電噴灑高解析度質譜儀，係為提供(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine的高解析質譜分子量與推定分子式，幫助解析樣品分子結構(如圖16所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine分子結構上的氫資訊(如圖17所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之特徵碳信號，係為一維13C核磁共振光譜可提供(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine分子結構上的碳資訊(如圖18所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin之HSQC-TOCSY圖譜，係為二維異核HSQC-TOCSY核磁共振光譜技術可對(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖19所示)；本發明實施例的(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin之HMBC圖譜，係為異核多鍵碳氫關聯性(HMBC)用來建立(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidin異核碳氫原子間的關聯性，通常是遠程偶合的碳氫關係(二至三個化學鍵)(如圖20所示)；本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之1H-NMR圖譜，係為一維1H核磁共振光譜可提供(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine分子結構上的氫資訊(如圖21所示)；本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之特徵碳信號，係為一維13C核磁共振光譜可提供(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine分子結構上的碳資訊(如圖22所
示)；本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之HSQC-TOCSY圖譜，係為二維異核HSQC-TOCSY核磁共振光譜技術可對(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine結構鑑定提供氫與碳相對位置與立體的資訊(如圖23所示)；本發明實施例的(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine之HMBC圖譜，係為異核多鍵碳氫關聯性(HMBC)用來建立(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine異核碳氫原子間的關聯性，通常是遠程偶合的碳氫關係(二至三個化學鍵(如圖24所示)。
本發明利用質子核磁共振質譜儀(1H-NMR)方法，專一的檢測麻黃屬植物中之麻黃生物鹼的種類與含量，同時於溶液萃取優化過程中透過二乙醚(diethyl ether)萃取可誘導麻黃生物鹼之環化，苯(benzene)萃取可以獲得雜質量最少的萃取物；進而達成，測得六種主要麻黃生物鹼(麻黃鹼、甲基麻黃鹼、去甲麻黃鹼、擬麻黃鹼、甲基擬麻黃鹼、去甲擬麻黃鹼)位置，更測得3種少量的環化麻黃生物鹼；有效提升其使用快速方便，將可大幅擴大產業之利用性並具新穎及進步性。
S1:麻黃樣品製備及溶液萃取優化
S2:麻黃生物鹼的核磁共振氫譜定量(qNMR)分析
Claims (7)
- 一種麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其特徵是，該步驟，包括：(A)、麻黃樣品製備及溶液萃取優化S1：係將麻黃粉末樣品(約2克)浸入50毫升0.5%的鹽酸水溶液中，在60℃下用超音波震盪萃取；30分鐘後，以抽氣過濾方式將液渣分離；每個樣品提取四次並合併濾液，用碳酸鈉將合併溶液的pH值調整到10.0，然後在每分鐘3000轉速下離心10分鐘，得到上清溶液；將上清溶液加入氯化鈉直至飽和，並在每分鐘3000轉速下再離心10分鐘；得到的上清溶液用苯分配五次，合併的有機溶液萃取在真空中濃縮，透過溶液萃取優化即得麻黃萃取物；(B)、麻黃生物鹼的核磁共振氫譜定量(qNMR)分析S2：係將麻黃萃取物和內標”蒽”溶於0.6毫升的氘代氯仿中，用布魯克AV-400核磁共振儀進行分析，參數如下；100次掃描以0.187赫茲/點記錄；光譜寬度，3600赫茲；使用90脈衝以獲得最大的靈敏度；弛緩延遲，20秒；收集時間，2.56秒；對於定量分析，使用峰面積，並手動選擇每個峰的積分起點和終點。
- 如申請專利範圍第1項所述之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其中，所述溶液萃取優化過程係採用二乙醚(diethyl ether)萃取可誘導麻黃生物鹼之環化。
- 如申請專利範圍第1項所述之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其中，所述溶液萃取優化過程係採用苯(benzene)萃取可以獲得雜質量最少的萃取物。
- 如申請專利範圍第1項所述之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁 共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其中，所述核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得六種主要麻黃生物鹼(麻黃鹼、甲基麻黃鹼、去甲麻黃鹼、擬麻黃鹼、甲基擬麻黃鹼、去甲擬麻黃鹼)位置。
- 如申請專利範圍第2項所述之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其中，所述核磁共振氫譜(1H-NMR)分析測得3種少量的環化麻黃生物鹼。
- 如申請專利範圍第5項所述之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其中，所述環化麻黃生物鹼係包含(2R,4R,5S)-3,4-dimethyl-2,5-diphenyloxazolidine、(2R,4R,5S)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine、(2R,4R,5R)-2,3,4-trimethyl-5-phenyloxazolidine)。
- 如申請專利範圍第1項所述之麻黃中麻黃生物鹼的改良型核磁共振氫譜(1H-NMR)定量方法，其中，所述生物鹼含量的計算方法如下：，其中，該A：各生物鹼的峰面積；該B： 蒽的峰面積；該C：蒽的濃度(M)；該D：萃取物的重量；該M：各生物鹼的分子量。
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